Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Устные интубации взрослых рыбок данио: модель для оценки кишечного поглощения биоактивных соединений

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58366

⸱

27 сентября 2018 г.

 ,  , 
1Institute of Biotechnology and Biomedicine (IBB-UAB), Universitat Autònoma de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Animal Physiology and Immunology, Universitat Autònoma de Barcelona

В этой статье

Краткое содержание

Протокол описывает интубирование взрослых данио рерио с биологическими; затем рассечения и подготовка кишечника цитометрии, конфокальная микроскопия и ПЦР. Этот метод позволяет администрации биоактивных соединений для мониторинга кишечного поглощения и местной иммунной стимул вызывали. Это актуально для тестирования кишечных динамика устных профилактики.

Аннотация

Большинство возбудителей вторгнуться организмов через их слизистой оболочки. Это особенно верно в рыбе, как они постоянно подвергаются воздействию микробной богатые водной среды. Разработка эффективных методов для перорального Иммуностимуляторы или вакцин, которые активируют иммунную систему против инфекционных заболеваний, является весьма желательным. В разработке профилактических средств, хорошие экспериментальные модели необходимо проверить их эффективность. Здесь мы показываем, метод для устного интубации взрослых рыбок данио и набор процедур для вскрыть и подготовки кишечника цитометрии, confocal микроскопии и анализа количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот протокол мы точно можно администрировать тома до 50 мкл рыбы весом примерно 1 g просто и быстро, без ущерба для животных. Этот метод позволяет нам исследовать поглощения прямых в vivo дневно помечены соединений на слизистой оболочке кишечника и иммуномодулирующим потенциала таких биопрепаратов на локальном сайте после интубации. Объединив течению методы, такие как проточной цитометрии, гистология, ПЦР и confocal микроскопии кишечника ткани, мы можем понять, как возможность пересечь кишечной слизистой барьеров, проходят через lamina propria, иммуностимуляторы или вакцины и достичь мышцы, оказывая влияние на кишечной слизистой иммунной системы. Модель может использоваться для проверки кандидата устные профилактики и систем доставки или местное действие любого перорального биоактивных соединений.

Введение

Цель этой статьи заключается в подробно описать простой метод для устного интубации данио рерио, наряду с полезной связанные течению процедур. Устные интубации, используя данио рерио стала практической моделью в изучении динамики инфекционного заболевания, устные вакцины/иммуностимулирующим, потребление наркотиков/наночастиц и эффективность и кишечной слизистой иммунитета. Например в исследовании Mycobacterium marinum и peregrinum микобактерий инфекции1был использован данио рерио устные интубации. Lovmo и др. также успешно используется эта модель для доставки наночастиц и м. marinum желудочно кишечного тракта у взрослых рыбок данио2. Кроме того, Чэнь et al. используется данио рерио устные интубации чтобы показать, что наркотики инкапсулируется наночастиц, когда управляемые через желудочно кишечного тракта, были перевезены через барьер мозга крови3. Эти авторы провели интубации, основанную на методе gauvage, характеризуется Коллимор et al. 4 с некоторыми изменениями. Однако они не обеспечивают весьма подробный протокол описания процедуры устного интубации. Здесь мы представляем метод для устного интубации взрослых рыбок данио, опираясь на Коллимор et al. 4 далее мы включают подготовку intestine для соответствующих течению анализа цитометрии, конфокальная микроскопия и ПЦР.

Кишечника и особенно ее слизистой оболочки является первой линией обороны против инфекции и основной сайт питательных5. Когда клетки эпителия и антиген представляющих клеток в слизистой барьеры воспринимают сигналы опасности, запускается немедленно врожденный иммунный ответ. Далее,6,лимфоцитов T и B7устанавливается весьма специфический адаптивного иммунного ответа. Развитие устной вакцин является текущее направление в вакцинологии. Такие вакцины будет эффективным инструментом для защиты организма на открытых участках из-за конкретный ответ иммунных клеток в слизистой оболочки связанных лимфоидной ткани (MALT)8,9. В аквакультуре слизистой вакцины имеют очевидные преимущества, по сравнению с инъекционные вакцины. Они практичны для массовой вакцинации, менее трудоемкой, менее стрессовым для рыб и может назначаться молоди рыб. Тем не менее слизистой вакцин-кандидатов должны достичь второго сегмента кишки без денатурировано в устной окружающей среды. Они также должны пересекать слизистой барьеров для того, чтобы получить доступ к антиген представляющих клеток (БТР), чтобы побудить местных или системных ответов10. Таким образом тестирование слизистой поглощения, достигнутые устные антигены кандидат и систем их доставки, а также иммунный ответ вызвал, имеет важное значение в развитии устных вакцин.

В рамках биомедицинских разработка модели для тестирования биологических эффектов соединений после интубации в Оральный растущий интерес. Многие анатомические и физиологические функции кишечника консервируют между bilaterian линий, с11млекопитающих и костистых рыб. Эта модель устные интубации, подключенных к течению анализа может быть инструментом обеспечить понимание биологии человека, а также полигоном для biologics или других соединений в естественных условиях.

Протокол устное интубации могут выполняться одним оператором, например, успешно администрирование до 50 мкл суспензии наночастиц белок рыбы весом 1 g, с высокой выживаемости. Процедура проста в настройке и быстро; 30 рыб может быть интубированных в 1 час. Протокол для кишечника подготовки является ключом к обеспечению качества образцов клеток и тканей для последующего анализа. Приведены примеры течению результаты, которые показывают полезность протокола в получении данных, относящиеся к кишечного поглощения и изолировать РНК качества для ПЦР. Протокол будет весьма полезным для тех, кто нуждается подходящую модель для проверки динамика устных профилактики или других соединений в кишечнике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры с участием данио рерио (Danio рерио) были утверждены Комитетом по этике близлежащем автономном Университат де Барселона (CEEH номер 1582) по согласованию с международные руководящие принципы для исследований с участием животных ( EU 2010/63). Все эксперименты с живой данио рерио были исполнены на 26-28 ° C.

1. Подготовка оборудования для устного интубации

  1. Место примерно 1 см тонкой силиконовые трубки на 31 G Luer иглы блокировки для покрытия кончик иглы.
  2. Вырезать 10 мкл стерильного фильтра пипетки наконечник (около 2 см), тонкой конец и поместите его силиконовые трубки в ножнах. Убедитесь, что дозатор выходит за пределы кончика иглы во избежание ранения животного.
  3. Прикрепите иглы к 100 мкл Luer lock шприца.
    Примечание: Всегда полоскать с этанолом и затем фосфат буфер солевой раствор (PBS, смотрите материалы) тщательно между процедурами.

2. решения

  1. Подготовка 150 мг/Л (для анестезии) или 300 мг/Л (для euthanasia) 3-аминобензоат этиловый метансульфонат (MS-222) раствора с воды из аквариума, где сохраняются у рыбок данио. Заполните небольшой резервуар с 1 Л раствора анестетика и держать его газированные.
  2. Заполнить еще один небольшой резервуар с 1 Л аквариумной воды без MS-222 для восстановления рыбы и держать его газированные.
  3. Сделайте 50 мл 10 x стерильный раствор ПБС.
  4. Для cytometry анализ/кишечные изоляция клетки Подготовьте достаточно свежие 0,15% коллагеназы типа IV решение по 1 мл на рыбу от Стоковый раствор или порошка в среде Дульбекко изменение орла (DMEM) с 1% v/v пенициллина и стрептомицина (см. материалы). Сделайте аликвоты (1 за рыбы) 1 мл 2 мл пробирок. Храните при 4 ° C до 30 мин перед шагом рассечение.
  5. Для фиксации конфокальная микроскопия/образца подготовить 50 мл свежего параформальдегида (PFA) 4% раствора в PBS или разморозить Стоковый раствор от-20 ° C Морозильник в зонта.
    Предупреждение: PFA является токсичным. Пожалуйста, прочитайте паспорт безопасности материала перед началом работы с ним. Перчатки и защитные очки нужно носить и всегда оставить решения внутри зонта.

3. Подготовка флуоресцентные подвеска наночастиц

  1. Ярлык белка наночастиц с Эстер NHS Атто-488 (см. Таблицу материалов) или соответствующий Люминесцентную краску согласно инструкциям производителя.
  2. Ресуспензируйте наночастиц в буфере бикарбоната натрия 0,1 М на концентрация 2 мг/мл.
  3. Растворите Эстер NHS 488 Атто в Амин бесплатно диметилсульфоксида (ДМСО) на 2 мг/мл. Держите Алиготе 10 мкл для проверки эффективности маркировки (шаг 3,7-3,8).
  4. Смесь наночастиц и Эстер NHS 488 Атто в молярное соотношение 1:2 (белок: краска) при перемешивании в темноте.
  5. Спин вниз помечены наночастиц центрифугированием в 8000 x g 10 мин при комнатной температуре, удалить супернатант и сохранить его для проверки эффективности маркировки (шаг 3,7-3,8).
  6. Вымойте помечены наночастиц, resuspending в 1 мл 0,1 М буфера бикарбонат натрия, vortexing и закупорить вверх и вниз. Затем удалить супернатант центрифугированием в 8000 x g 10 мин при комнатной температуре. Повторите шаг 3,6 в 5 раз.
  7. Ресуспензируйте гранулы в 5 мл 0,1 М бикарбоната натрия буфера в 15 мл пластиковых пробирок и сделать аликвоты флуоресцентные наночастиц в 1,5 мл пробирок (30 аликвоты). Спин вниз на 8000 x g 10 мин при комнатной температуре, удалить супернатант и хранить при температуре-80 ° C защищенный от света.
  8. Измерьте маркировки эффективности, с использованием microvolume спектрофотометром.
    1. Возьмите 1 мкл оригинальное решение Атто 488 от шагу 3.3 и далее развести его в ДМСО (например, 1:20 согласно соотношение объема). Это объем, используется для получения молярное соотношение белка наночастиц и 488 Атто микс на шаге 3.4.
    2. Взять 1 мкл сохраненных супернатант от маркировки реакции на шаге 3.5. Измерение поглощения (abs) = 501 Нм. Процент маркировки является:
      (figure-protocol-1
  9. До эксперимента Подготовьте наночастиц подвеска на желаемой концентрации с помощью 1 x PBS решения.

4. данио рерио анестезии и устные интубации

  1. Быстрая рыба (> 0,5 г) по крайней мере за 48 часов до эксперимента, чтобы опорожнить кишечник.
  2. Переместите рыбы (12 рыбы) Экспериментальные танки (6 Л) одну ночь перед эксперимент, чтобы позволить акклиматизации12.
  3. Вихревой наночастиц раствор хорошо (например, 2500 об/мин и 30 s) и составить желаемый объем наночастиц подвеска (например, 20-50 мкл) в шприц, придает охраняемых иглы.
  4. Место рыбы в пористый 150 мг/Л MS-222 решение (см. раздел 2) до тех пор, пока они опускаться на дно бака и не реагировать щепотку хвостовой плавник; Этот процесс занимает менее 5 минут.
  5. Быстро передавать наркотизированных рыбы с чистой влажной пластиковый лоток, ориентироваться животное горизонтально к лицу иглы и сразу же начать устное интубации.
  6. Тщательно поддерживают рыба с одной стороны и открыть рот с другой стороны, используя защищенный иглы. Аккуратно вставьте иглу вниз пищевода до около 1 см от устья открытия.
    Примечание: Оператор могут чувствовать незначительное сопротивление, когда в конце кончика пипетки прошло Гилл. Будьте осторожны, не угол записи иглы, слишком много которые могут перфорировать Гилл.
  7. Медленно вводить наночастиц подвеска с рыбой. Убедитесь, что приостановление не течет наружу через жабры или рот.
  8. Аккуратно удалите иглу и место рыбы в резервуар восстановления (см. раздел 2). Восстановление обычно занимает в течение 1 мин.
  9. Проверьте рыбу тщательно для любого отклонения от нормы (например, кровотечение в жабры является признаком перфорации).
  10. Как только рыба выздоровели, вернуть их в экспериментальные танки.

5. данио рерио кишечника рассечение

  1. После определенного периода времени должность интубации (например, 5 ч или 24 ч), поместите рыбу с помощью сети в 300 мг/Л MS-222 решение для эвтаназии (см. раздел 2). Убедитесь, что крышечки перестает двигаться, и нет не рефлекс щепотку хвост. Пять минут обычно достаточно.
  2. Подобрать Усыпленных животных с чистой и поместите его на фильтровальной бумаге.
    Примечание: Фильтровальная бумага очень полезен для удаления клея ткани вдоль кишечника.
  3. Используя острые Рассечение ножницами, сделайте полу-круговой разрез от ануса до крышечки и открытого разреза с помощью тонкой пинцета. Вырезать обоих концах кишечника, вывезти всех внутренних органов и разместить их на фильтровальной бумаге.
    Предупреждение: Работайте быстро, чтобы уменьшить клеточный метаболизм и смерти.
    Примечание: в качестве альтернативы, удалите клейкие ткани в PBS и на льду.
  4. Отделите кишечника от внутренних органов, убедившись в том сохранить свою ориентацию (предшествовавшие заднего сегмента кишечника) и растянуть его. Как правило шире, чем заднего сегмента переднего отрезка кишечника. Позаботьтесь, чтобы получить все кишки, когда вскрывали.
    Примечание: Задний конец довольно тонкой и хрупкой в мелких рыб и могут разорвать, особенно в животных < 0,7 г.
  5. Ролл кишечника на фильтровальной бумаге с помощью пинцета, чтобы отсоединить адгезивные ткани из кишечника.
  6. Перейти к подготовки кишечника для анализа различных течению (разделы 6, 7 и 8).

6. подготовка кишечника клетки для цитометрии

  1. Заранее подготовьте аликвоты коллагеназы 0,15% раствора (см. раздел 2.4).
    Примечание: При комнатной температуре перед продолжением следует аликвоты.
  2. Дополнительно: Продолжите с шага 5.5, щели открытым кишечника продольно и мыть с ПБС.
  3. С помощью пинцета, место intestine в 2-мл пробирку центрифуги, заполненные раствором коллагеназы 0,15%.
  4. Место труб на вертикальной Лаборатория ротатор за 1 ч при комнатной температуре в темноте.
  5. Место кишечника на стрейнер ячейки 100 мкм, поддерживает более 50 мл пластиковых пробирок. Разбейте intestine с плунжером шприц 5 мл, стирка 3 раза с ПБС, собирая поток через образец в центрифуге Тюбик 50 мл.
  6. Центрифуга для пластиковых пробирок 50 мл на 400 x g за 10 мин., на 4 ° C.
  7. Тщательно пипеткой покинуть большую часть супернатант при этом не теряя клетки, некоторые из которых могут быть связаны в слизи.
  8. Ресуспензируйте кишечных клетки в нижней части пластиковых пробирок с 500 мкл ПБС и держать на льду до cytometry анализ
  9. Фильтр образцы через 30 мкм фильтром клеток в 5 мл вокруг нижней трубы для цитометрии.
  10. Задать параметры (например, количество ячеек для анализа, региона интерес, напряжения и компенсации, выбор детекторов) на оборудовании цитометр (см. материалы).
  11. Сразу же анализируйте клетки на цитометр, следуя указаниям использования13.

7. подготовка кишечника Cryosections конфокальная микроскопия

  1. Заполните пластиковые формы (см. Таблицу материалы) до половины объема с оптимальной резки температуры (O.C.T.) соединение.
  2. Продолжая из шага 5.5 и сразу после вскрытия, тщательно место intestine в пластиковые плесень. Убедитесь, что кишечник полностью встроенный в O.C.T. комплексе. Если необходимо, добавьте еще O.C.T. составные прессформа.
    Примечание: Рекомендуется разместить в кишечнике с формы «Z» в O.C.T. соединения легко следовать его естественной ориентации.
  3. Место Прессформа на сухого льда до тех пор, пока она идет непрозрачный (меньше чем за минуту).
  4. Храните Прессформа на-80 ° C для длительного использования или процесса, непосредственно, используя следующую процедуру.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
  5. Ломтик замороженные кишке в 10 мкм секций или соответствующей толщины, с помощью криостата при-20 ° C.
  6. Собирайте кишки раздел с тонкой кистью на слайд.
  7. Погрузите слайд в 4% PFA для 15 мин при комнатной температуре исправить образца.
    Предупреждение: PFA является токсичным. Пожалуйста, прочитайте паспорт безопасности материала перед началом работы с ним. Перчатки и защитные очки нужно носить и всегда оставить решения внутри зонта.
  8. Вымойте слайд 3 раза с ПБС, 10 мин.
  9. Добавить каплю монтажа средних и поместите coverslip образца.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
  10. Наблюдать за образец под микроскопом конфокальный с соответствующим увеличением.

8. подготовка кишечника для ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР)

  1. Продолжите с шага 5.5, поставьте intestine в криогенных пузырек и быстро заморозить intestine в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C до использования.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
  2. Для гомогенизации, добавить 200 мкл 2% (v/v) охлажденные 1-Thioglycerol/гомогенизации решение (см. Таблицу материалов) или альтернативных гомогенизации решение кишечника образца.
  3. Работать быстро, гомогенизировать кишечника образца на льду с лаборатории гомогенизатор на высокой скорости (устанавливается на 25 – 30 000 об/мин) до без видимых ткани остаются фрагменты. 3 раза за 5 s обычно достаточно.
  4. Изолировать РНК с помощью коммерческих комплект (см. Таблицу материалы) согласно инструкциям производителя14 или подходящий альтернативный метод. При необходимости Храните РНК в-80 ° C для долгосрочного использования.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
  5. Количественную оценку концентрации РНК с помощью спектрофотометра15 и оценить качество, с использованием РНК анализатор16.
  6. Подготовка 1 мкг или соответствующее количество cDNA, используя набор для синтеза cDNA согласно инструкциям производителя.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Для ПЦР-анализа пожалуйста, следуйте руководящих MIQE17.
  7. Дизайн пар соответствующие грунтовка для гена/s интерес.
  8. Выберите подходящую ссылку генов и проанализировать выражение каждого гена, RT-ПЦР обнаружение системы с использованием коммерческих комплект (см. материалы).
    Примечание: например, добавьте 5 мкл SYBR зеленый Супермикс, 0,5 мкм грунты, 2.5 мкл разбавленного cDNA и 1,5 мкл воды в окончательный объем 10 мкл для каждой скважины ПЦР пластины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Данио рерио (средний вес: 1,03 ± 0,16 g) смешанного пола были успешно интубированных с различными рекомбинантных белков наночастиц (бактериальный включение органы) с помощью нашего дома сделал устные интубации устройства (рис. 1). Мы успешно выполнять устные интубации и добились низкий средний процент смертности (6,8%) (Таблица 1). Данио рерио были либо интубированных с 30 мкл или 50 мкл суспензии наночастиц и смертность была рассчитана в теч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол является улучшение ранее описанные методики для устного интубации на Коллимор et al. 4 наши протокол подробно описывает метод устные интубации и включает в себя подготовку intestine вниз по течению анализа. Наш метод улучшает скорость манипуляции рыбы, позволяя один человек для выполнения весь протокол быстро, без много различий между операторами. Главное отличие нашего протокола с предыдущим является, что мы оцениваем успех эксперимента устные интубации не только путем набл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что существуют не конкурирующие интересы.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантов от испанского министерства науки, Европейской Комиссии и AGAUR средства для NR (AGL2015-65129-R МИНЕКО/ФЕДЕР и 2014SGR-345 AGAUR). RT имеет предварительно докторской стипендии от AGAUR (Испания), JJ было поддержано PhD стипендии от Совета стипендию Китай (Китай) и NR поддерживается программой Ramón y Cajal (Исправительные-2010-06210, МИНЕКО, 2010). Мы благодарим д-р Торреальба для консультации экспертов в производстве белка, н. «Барба» от «Обслуживание де Microscopia» и д-р м. Коста от «Обслуживание de Citometria» на близлежащем автономном Университат де Барселона полезной технической помощи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Силиконовая трубкаDow Corning508-0010,30 мм внутренний диаметр и 0,64 мм внешний диаметр
игла Luer lockHamilton7750-2231 G, Kel-F Hub
Шприц с замкомLuer Hamilton81020/01100 μ L, Kel-F Hub
Наконечник для пипетки с фильтромNerbe Plus07-613-830010 μ L
MS-222Sigma AldrichE10521порошок
10x PBSSigma AldrichP5493
Фильтровальная бумага Фильтр-ЛабRM14034252
коллагеназыGibco17104019
DMEM Gibco31966Модифицированная среда Dulbecco's
Eagle Пенициллин и стрептомицинGibco15240
Сетчатый фильтрFalcon352360
CellTrics Sysmex Partec04-004-2326 (Wolflabs)30 & м размер ячеек фильтры с резервуаром 2 мл
Tissue-Tek O.C.T. compoundSAKURA4583
Пластиковые формы для криосекцийSAKURA4557Одноразовые виниловые формы. 25 мм x 20 мм x 5 мм
SlideThermo Scientific10149870SuperFrost Plus Slide
Cover glassesLabbox COVN-024-20024´ 24 мм
Параформальдегид (PFA)Sigma-Aldrich158127
Atto-488 NHS esterSigma-Aldrich41698
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS5761
DMSOSigma-AldrichD8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue KitPromegaAS1340
1-Тиоглицерин/Гомогенизация растворPromegaInside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kitс добавлением 20 μ l 1-Тиоглицерин на 1 мл гомогенизирующего раствора (2%)
вертикальный лабораторный вращатель Suministros Grupo Esper10000-01062
CryostatLeica 
ГомогенизаторKINEMATICAPolytron PT1600E
проточный цитометр Becton DickinsonFACS Canto
5 мл круглая донная трубкаFalcon352058
Конфокальный микроскопLeicaSP5
Вытяжной шкафKottermann2-447 BST
Nanodrop 1000Thermo Fisher ScientificND-1000Спектрофотометр
Agilent 2100 Биоанализатор системыAgilentG2939AРНК-биоанализатор
Maxwell InstrumentPromegaAS4500 
Набор для синтеза кДНК iScript Bio-rad1708891
CFX384 для ПЦР в реальном времени  Система детектированияBio-Rad1855485
iTaq универсальная SYBR Green Supermix kitBio-rad172-5120
Вода Sigma-AldrichW4502
Криогенный флакон Thermo Fisher Scientific375418CryoTube
Среда для монтажаSigma-AldrichF6057Fluoroshield с DAPI
CM3050S флакона

Ссылки

  1. Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
  2. Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
  3. Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
  4. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
  5. Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85(2014).
  6. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
  7. Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
  8. Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
  9. Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biology. 4, 525-539 (2015).
  10. Munang'andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. ø An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542(2015).
  11. Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054(2017).
  12. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
  13. Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190(2017).
  14. Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
  15. Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
  16. Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  19. Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  20. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Danio rerio
Устные интубации взрослых рыбок данио: модель для оценки кишечного поглощения биоактивных соединений
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.