Здесь мы представляем протокол обнаружить присутствие нейтрофилов в разделах фиксированной/permeabilized гистология и оценить состояние активации живой очищенный нейтрофилов. В частности MUB пептид40 связывает лактоферрина в гранулы нейтрофилов конкретных и высшего. Экспозиции блок содержимого через permeabilization или нейтрофилов активации позволяет для маркировки нейтрофилов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Пептид40 MUB для использования в обнаружении нейтрофилов опосредованной воспаление события
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Здесь мы предоставляем протокол с применением MUB40, синтезированных пептидов с способностью связывать гликозилированного лактоферрин, хранящиеся в высоких концентрациях в конкретных и третичного Гранулы нейтрофилов. Этот протокол детали, как MUB40 конъюгированных непосредственно к Флюорофор может использоваться для пятно нейтрофилов в фиксированной/permeabilized тканей также, как это может использоваться в живой клетки imaging для анализа для активации нейтрофилов и де грануляции. Методы обнаружения нейтрофилов ограничены к поставляемому моноклональные антитела, которые не всегда подходят для определенных приложений. MUB40 не проникают клеточной мембраны и таким образом, исключается из лактоферрин, хранящиеся в не активировано/не permeabilized нейтрофилов. MUB40 имеет добавленное преимущество признания лактоферрина из широкого хозяйского диапазона, что делает его особенно полезны для сравнения результатов исследований с участием нескольких исследований моделей, сократить количество повторяющихся реагентов и упрощения протоколы через единый этапа окрашивания.
Введение
Нейтрофилы являются одним из основных оружия иммунной системы и регулярно привлекаются к местам воспаления вокруг тела. Изучение нейтрофилов была значительной степени снижена путем их короткий срок в пробирке (менее 8 h) и средства ограничены обнаружения базальных условиях или после активации. Здесь мы представляем испытанный протокол для обнаружения широкого и конкретного млекопитающих нейтрофилов в образцах исправлены/permeabilized. Мы также предоставляем подробный протокол для окрашивания живой нейтрофилов с MUB40. Можно pinpointed по протоколу живой нейтрофилов окрашивание, сроков и местоположения нейтрофилов активации. Этот протокол является и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, описанные здесь были проанализированы и одобрены французских организаций веймутовой (Comité de исследований Clinique), CPP (Comité de защиты des Personnes) и CNIL (Комиссии Nationale Informatique et Liberté).
1. Окрашивание дневно нейтрофилов в гистопатологии ткани с маркировкой MUB40
- Для получения ткани для гистопатология, исправьте разделов ткани/биопсии в соразмерную громкость параформальдегида 4% (PFA) за 30 мин до 4 ч в зависимости от толщины образца. Поместите образцы в холодильнике 4 ° C во время фиксации.
Примечание: Альтернативные фиксации методы/тайминги можно заменить основаны на уникальных пот....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Результаты MUB40-окрашенных тканей от гистопатология слайды обычно показывают отдельные клетки, разбросанных по всей ткани. MUB40 пятна лактоферрин, который присутствует в нейтрофильных гранул и разобщенным. Таким образом обычно видели пунктата пятнать или несколько больших разделенных областей сигнала приходят из отдельных нейтрофилов (рис. 1). Это полезно для добавления второй маркер клеток например DAPI помочь совместно локализовать с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь двух анализов описаны, в котором MUB пептид40 используется для изучения нейтрофилов воспаление и активации. Мы покажем, как можно выявить MUB40 нейтрофилов присутствует в гистопатологии секций или показать их состояние активации с использованием живой очищенный нейтрофилов. Важнейшие шаги для использования MUB40 как окрашивание реактива такие же, как и с любым другим методом флуоресцентного обнаружения. Необходимо позаботиться для обеспечения совместимости флуоресцентные сигналов и .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
B.S.M. указан как изобретатель на MUB40 патентов:
MUB40: Европейский патент EP11290403.2, 09/09/2011.
РИ MUB40: 11/12/17, Европейского патента EP № 17306746.3.
Благодарности
Эта работа была поддержана Фюгеном Лоретт Fondation (LF-2015-15) (B.S.M.) и ANR JCJC грантов (АНР-17-CE15-0012) (B.S.M.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | флуоресцентный пептид MUB40 (доступен с другими конъюгированными флуорофорами) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Ретро-инверсо флуоресцентный пептид MUB40. Синтезирован с D-аминокислотами и устойчив к протеазам (доступен с другими конъюгированными флуорофорами) |
| Парформальдегид | Sigma-Aldrich | 16005 | Фиксатор для гистологии |
| Сахароза | Sigma-Aldrich | S7903 | Раствор используется для удаления избытка PFA |
| Оптимальный температурный компаунд (ОКТ) | Сакура Finetek США | 4583 | Используется для замораживания тканей перед криостатным разрезанием |
| 2-Метилбутан | Sigma-Aldrich | M32631 | Используется для замораживания тканей перед срезом криостата |
| Этанол | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Используется для ванны с сухим льдом для замораживания тканей |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Используется для срезов тканей |
| Предметные стекла для микроскопии | стекла Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Защитные стекла | Thor Labs | CG15CH | Высокоточный покровный лист |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Используется для предотвращения потери жидкости при окрашивании тканей |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Используется для проникновения клеток для окрашивания IF |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 фаллоидин | Fisher Scientific | A12379 | Связывает актин |
| Пролонгирует Золото антифадерный монтант | Fisher | Scientific P36930 | Продлевает сигнал ПЧ и устойчивость к фотообесцвечиванию |
| Флуоресцентный микроскоп | Различный | Используется для изображения ПЧ слайдов | |
| Бескислородный кабинет | Различный | Используется | для очистки живых инактивированных нейтрофилов |
| Хлорид натрия NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Промывочный буферный компонент |
| MACS BSA буфер | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Промывочный буферный компонент |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Градиент для очистки нейтрофилов |
| CD235a гликофориновых магнитных микрогранул | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Используется для удаления загрязняющих эритроцитов |
| LS колонок | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Используется для удаления эритроцитов из нейтрофилов |
| RPMI-1640 без фенола Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Используется для анализа нейтрофилов |
Ссылки
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
