Методическая статья

Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

DOI:

10.3791/58369

⸱

28 сентября 2018 г.

 ,  , 
1Molecular Plant Biology, Department of Biochemistry, University of Turku

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол для освещения растений тилакоидных белков сложной организацией и композиция с голубой родной полиакриламида гель электрофореза (БН-страница) и описал 2D-SDS-PAGE. Протокол оптимизирован для Arabidopsis thaliana, , но может быть использован для других видов растений с незначительными изменениями.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фотосинтетической электрон передачи цепи (и т.д.) преобразует солнечную энергию в химическую энергию в виде АТФ и НАДФН. Четыре крупных белковых комплексов встроенный в тилакоидной мембраны урожай солнечной энергии поехать NADP+ через двух фотосистем электронов от воды, и использовать созданный протонного градиента для производства АТФ. PSII фотосистемы, PSI, цитохромы b6f (Cyt b6f) и АТФазы являются все multiprotein комплексы с различные ориентации и динамика в тилакоидной мембраны. Можно получить ценную информацию о составе и взаимодействия белковых комплексов в тилакоидной мембране, растворяющие комплексы от целостности мембраны, мягкими моющими средствами, следуют электрофоретического разделения родной гель комплексы. Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является аналитический метод, используемый для разделения белковых комплексов в их родной и функциональной форме. Этот метод может использоваться для сложных очищение протеина для более детального анализа структурных, но он также предоставляет инструмент для того чтобы рассечь динамического взаимодействия между белковых комплексов. Метод был разработан для анализа митохондриальной дыхательных белковых комплексов, но с тех пор были оптимизированы и улучшены для рассечения тилакоидов белковых комплексов. Здесь мы предоставляем подробную обновленную протокол для анализа лабильной фотосинтетической белковых комплексов и их взаимодействия в проростках Arabidopsis thaliana.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большие multisubunit белка комплексы фотосистем PSI и PSII, Cyt b6f и АТФазы координировать производства АТФ и НАДФН в фотосинтетических реакциях свет. В высших растений хлоропластов комплексы расположены в тилакоидной мембране, который является структурно гетерогенных мембраны структурой, включающей прижаты Грана и тилакоидов стромы не прижаты. Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является широко используемым методом при анализе больших multisubunit белковых комплексов в их родной и биологически активной форме. Этот метод был создан для рассечения митохондриальной мембраны белковых комплексов1, но позже был настроен для разделения белковых комплексов в тилакоидной мембраны сети3. Этот метод подходит (i) для очистки отдельных тилакоидов белковых комплексов для структурного анализа, (ii) для определения собственных взаимодействий между белковых комплексов и (iii) для анализа общей организации белковых комплексов После изменения окружающей среды подсказки.

До разделения белковых комплексов изолированы от мембраны с тщательно подобранными неионогенных моющих средств, которые, как правило, мягкая и сохранения родной структуры белковых комплексов. Моющие средства содержат гидрофобных и гидрофильных сайты и стабильные формы мицеллы выше определенной концентрации, называется критической концентрации мицеллярный (CMC). Повышение концентрации моющего средства над результатами CMC, в нарушение взаимодействия липидов липидов и солюбилизация белковых комплексов. Выбор моющего средства зависит от стабильности белкового комплекса интереса и солюбилизация количество моющего средства. Регулярно используются моющие средства включают α/β-додецил maltoside и digitonin. После солюбилизация белковых комплексов в их родном государстве нерастворимый материал удаляется путем центрифугирования. В высших растений мембрана тилакоида весьма неоднороден в структуре и некоторые моющие средства (например, digitonin) избирательно солюбилизировать последнего только конкретную часть мембраны3. Таким образом чтобы характеризовать организации сложных белков или взаимодействия между белковых комплексов, важно всегда определить мощность солюбилизация выбранного моющего средства, определяя содержание хлорофилла и хлорофилла a/b отношение супернатант для оценки урожайности и представлены тилакоид (суб) домена, соответственно, растворимых дроби. Хлорофилл a/b в нетронутыми тилакоидов роста свет акклиматизации растений составляет обычно около 3, тогда как chl / значение b тилакоидных фракций обогащенный либо в Грано или тилакоидов стромы падает ниже (~ 2.5) или превышает значение общего (~ 4.5) Тилакоиды, соответственно.

Чтобы обеспечить отрицательный заряд для белковых комплексов, Кумасси блестящий синий краситель (НБР) добавляется растворимых образца. Из-за смены заряда белковых комплексов мигрируют к аноду и отделены с уклоном акриламида (АА), по словам их молекулярной массе и форме. Эффективное и высоким разрешением разделение достигается с помощью градиента концентрации линейных акриламида. Во время электрофореза белковых комплексов мигрируют к аноду до тех пор, пока они достигают их размер зависит от размера пор предел. Размер поры геля полиакриламида зависит от (i Общая акриламида /бис- акриламид концентрация (T) и (ii) на крест-компоновщик бис- акриламид мономера концентрации (C) по отношению к общей мономеров4. После разделения с БН-страницы белковых комплексов можно далее подразделить их индивидуальных белковых субъединиц, второй измерение (2D) - SDS - PAGE. Здесь мы описываем подробный протокол для анализа тилакоидной мембраны белковых комплексов по БН-страница/2D-SDS-PAGE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка млрд лари1,2,3

  1. Настройка гель заклинателя плитами 8 x 10 см (прямоугольные стекла и пластина зубчатая глинозема) согласно инструкциям производителя, используя распорки 0,75 мм.
  2. Место градиент миксера на тарелку, перемешать и подключить его с перистальтических насосов, труб. Прикрепите иглой шприца в другой конец трубки и поместите иглу между стекла и алюминиевых пластины. Магнитная мешалка место для «тяжелых» (H)-камеры.
  3. Подготовьте 3,5% (v/v) и 12,5% (v/v) акриламида (АА) решения в 15 мл конические пробирок для разделения гель градиента (см. рецепты в таблице 1). Во избежание преждевременной полимеризации, держите пробирок на льду при подготовке решений.
    Предупреждение: Акриламид является нейротоксического и канцерогенными, носить защитную одежду и перчатки.
  4. Добавьте 5% APS и TEMED прямо перед закупорить решения градиент миксера. Накапайте 12,5% раствора H-камере.
    1. Удаления пузырьков воздуха из канал, соединяющий «свет» (L) и H-палата, открыв клапан, соединяющий две камеры, позволяя решение вступить в L-камеру. Закройте клапан и пипетки следы решения обратно к H-камере.
    2. Наконец накапайте 3,5% раствор L-камере.
  5. Переключение на магнитной мешалкой (скорость перемешать не является критической, но она должна обеспечивать надлежащее смешивание тяжелых и легких решений), откройте клапаны и включите перистальтического насоса. Позволяют решения гелем между стекла и алюминиевых пластины, расхода должна быть примерно 0,5 мл/мин. Игла должна быть выше жидкости все время, она может быть присоединена к верхней части стеклянной пластины с ленты.
  6. Когда камеры H - и L-опустели, заполнить их с ультрачистая вода и позволить воде нежно наложение на поверхность геля. Полимеризации геля занимает около 1-2 часа на RT.
  7. Приготовляют раствор акриламида 3% (см. рецепт в таблице 1) для укладки гель на RT. Накапайте штабелируя гель на вершине полимеризованной разделение геля (перед заливкой штабелируя гель, удалить воду, наложение на поверхность геля) и поместите образец гель гребень между стекла и алюминиевых пластины избегая пузырьки воздуха.
    1. Позвольте полимеризоваться 30-60 мин на RT. Remove гребень мягко под ультрачистая вода. Храните гель на + 4 градусов.
      Паузы точки. Гель может храниться при + 4 ° c на несколько дней. Геля должны храниться в влажных условиях во избежание высыхания поверхности геля и колодцы.

2. тилакоид солюбилизация1,2,3

Примечание: Все шаги должны выполняться под очень тусклый свет. Храните образцы и буферы на льду.

  1. Разбавьте изолированных тилакоидов с ледяной 25BTH20G буфер для окончательного хлорофилл концентрации 1 мг/мл. Для 2D-BN-SDS-PAGE анализ примерно 4-8 мкг хлорофилла / образец подходит.
    Примечание: Тилакоиды, используемых в экспериментах должны быть изолированы от свежих листьев (для протокола тилакоидов изоляции, см3)
  2. Добавить равный объем моющего средства буфера, т.е. 2% β-DM (w/v) или 2% digitonin (w/v). Осторожно перемешать моющего средства для тилакоидов образца с кончиком пипетки и избежать воздушных пузырей. Конечная концентрация моющего средства — 1% и что тилакоидов 0,5 мг Chl/мл.
    1. Солюбилизировать последнего тилакоидов 2 мин на льду (β-DM) или 10 минут на RT с непрерывной нежный смешивания на Рокер/шейкер (digitonin).
      Примечание: Digitonin и β-DM обычно используются для солюбилизация белковых комплексов в тилакоидной. Если используются другие неионных моющих средств, концентрации моющего средства и время солюбилизация должны быть сначала оптимизированы. Обычно диапазон концентрации моющего средства от 0,5% - 5% (v/v).
      Предупреждение: Digitonin это токсичные, носите защитную одежду и перчатки
  3. Удалите insolubilized материал центрифугированием на 18,000 x g для 20 минут, на + 4 градусов.
  4. Супернатант передать новой 1,5 мл трубки и добавить 1/10 (v/v) CBB буфера выборки.
    Примечание: Когда рассматривается общий состав тилакоидной мембраны белковых комплексов, определения урожайности и представлены тилакоидов домен растворимых фракций рекомендуется. Чтобы определить доходность растворимых материалов, принять 5 мкл супернатант новой трубки (перед добавлением CBB) и измерить содержание хлорофилла и Chl / b коэффициент5.

3.2,1,BN-страница3

  1. Настройка гель для системы вертикального электрофореза (например, 250 SE Хофер). Заполните палата верхней буфера с голубой катод буфера (см. таблицу 1) и залить Анодный буфер в нижнюю палату буфера.
  2. Загрузить тилакоидов выборки (например, 5 мкг хлорофилла) в скважинах.
  3. Электрофорез и постепенно увеличивайте напряжение: напряжение 75 В течение 30 мин, 100 V 30 мин, 125 V 30 мин, V 1 h 150 и 175 V до комплексов были разделены полностью. Запустите геля на + 4˚C, либо с помощью холодной комнате или корректировке температуры гель с системой охлаждения.
    Примечание: Измените буфере синий катод ясно катод буфер когда образец фронт мигрировало около одной трети от геля.
  4. После электрофореза запуска сканирования гель с photoscanner для архивирования изображений.

4. 2D-SDS-PAGE

  1. Соберите систему вертикального электрофореза (гель размер 16 x 20 см). Используйте прокладки 1 мм.
  2. Подготовьте стандартные геля SDS (12% акриламида, 6 M мочевины, рецепт см. в таблице 2) с 2D-гребень (одной большой хорошо для газа и один стандартный хорошо для маркер молекулярного веса).
  3. Вырежьте полосу от БН гель и поместите его в трубу (5 мл). Добавить 2 мл буфер Лэмли (содержащие 5% β-меркаптоэтанол) и инкубировать газа для 45 мин с нежным встряхивания на RT.
  4. Поместите полосу, с помощью например, распорки, поверх геля, избегая пузырьков воздуха.
  5. Накапайте 5 мкл маркер молекулярного веса на узкий кусок фильтровальной бумаги и место бумаги к стандарту хорошо.
  6. Для герметизации полосы BN-гель и маркер бумаги, залить сверху полосе гель агарозы 0,5% (в снаряженном буфера) и позволяют укрепить.
  7. Провести электрофорез по стандартным протоколам. После электрофореза, визуализируйте белки с например, пятно Sypro Ruby или серебряный пятнать по6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представительной системы 2D-BN/SDS-PAGE в Рисунок 1 демонстрирует разделение digitonin и белковых комплексов в тилакоидной β-DM-солюбилизирован и их состав Субблок подробные белка. Сложный узор Белки тилакоидов digitonin солюбилизирован (горизонтальные лари на верхней части верхней части рис. 1A) содержит PSII-LHCII-PSI Мегакомплекс, два больших PSII-LHCII supercomplexes (sc), ПСИ-LHCII supercomplex, PSI мономера (м), PSII м/Cyt ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Механизм преобразования фотосинтетической энергии состоит из крупных multisubunit белковых комплексов, которые внедряются в тилакоидной мембраны. Этот протокол описывает основной метод для анализа растений тилакоидов белковых комплексов от Arabidopsis thaliana с БН-страницы в сочетании с 2D-SDS-PAGE. Протокол также подходит для анализа тилакоидов белковых комплексов от табака и шпинат Тилакоиды, но может потребоваться небольшие корректировки.

Для солюбилизация мембраны белковых компле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было финансовой поддержке Академии Финляндии (номера проектов 307335 и 303757) и солнечной энергии биомассы (SE2B) Марии Склодовской-Кюри Грант соглашение (675006). Протокол основан на ссылка3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6-аминокапроновая кислота (ААА)Сигма-ОлдричА2504
БистрисСигма-ОлдричВ4429
СахарозаСигма-ОлдричS0389
Акриламид (АА)Сигма-ОлдричА9099Внимание: Нейротоксичный!
n-dodecyl-β-D-maltosideSigma-AldrichD4641
TricineSigma-AldrichT0377
TrisSigma-AldrichT1503
SDSVWR442444H
МочевинаVWR28877.292
ГлицеринJ.T. Baker7044
Фторид натрия (NaF)J.T. Baker3688
EDTA динатриевая сольJ.T. Baker1073
DigitoninCalbiochem300410Внимание:Токсично!
Pefabloc SCRoche11585916001
Serva Coomassie BlueG Serva35050
&бета;-меркаптоэтанолBio-Rad1610710
APS (персульфат аммония)Bio-Rad161-0700
TEMED (тетраметилэтилендиамин)Bio-Rad1610801
(N,N'-метилен)-бис-акриламидOmnipur2610
GlycineFisherG0800
Предварительно окрашенный маркер белка, широкий диапазон (7-175 кДа)New England BiolabsP7708
Falcon, конические центрифужные пробирки 15 млCorning352093
Двойной гелевый кастер с пластинами 10 x 8 смHoeferSE215
Градиентный генератор SG5Hoefer
0,75 мм Т-образные прокладкиHoeferSE2119T-2-.75
Образец гелевой гребня, 0,75 ммHoeferSE211A-10-.75
Mighty Small SE250 вертикальная система электрофорезаHoeferSE250
IPC-насосIsmatec
Источник питания, PowerPac HVBio-Rad164-5097
ЦентрифугаEppendorf5424R
Роккер-шейкерBiosanBS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell		Bio-Rad1651813

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DM2 SDS PAGESUPRO Ruby

Похожие статьи