Фосфоресцентный проточной цитометрии с люминесцентные клеток штриховое кодирование для сигнализации биомаркер обнаружение и анализ отдельной ячейки

Краткое содержание

Здесь представлен протокол для анализа средне высокой производительностью событий фосфорилирование белков на клеточном уровне. Фосфоресцентный проточной цитометрии является мощный подход к характеризуют сигнализации аберраций, выявления и проверки биомаркеров и оценить фармакодинамика.

Аннотация

Сигнализации аберрантных клеток играет центральную роль в развитии рака и прогрессии. Наиболее Роман целевой терапии действительно направлены на белки и функций белков, и клетки сигнализации аберраций поэтому может служить в качестве биомаркеров для обозначения персонализированные лечения. В отличие от анализа ДНК и РНК изменения в активности белка может более эффективно оценить механизмы лекарственной чувствительности и сопротивления. Фосфоресцентный проточной цитометрии является мощным средством, что меры события фосфорилирование белков на клеточном уровне, важной особенностью, которая отличает этот метод от других подходов, основанных на антитела. Этот метод позволяет одновременный анализ нескольких сигнальных белков. В сочетании с люминесцентные клеток штриховое кодирование большие наборы данных средне высокой производительностью могут быть приобретены по стандартным цитометр оборудования в короткие сроки. Фосфоресцентный проточной цитометрии имеет приложений как в исследованиях по вопросам базовой биологии, так и в клинических исследованиях, в том числе сигнального анализа, обнаружения биомаркеров и оценки фармакодинамика. Здесь для анализа потока фосфористой очищенный периферической крови мононуклеаров, с использованием клеток хронического лимфолейкоза в качестве примера приводится подробный экспериментальный протокол.

Введение

Фосфоресцентный проточной цитометрии используется для анализа уровня фосфорилирование белка одноклеточных разрешением. Общая цель метода является сопоставление клеточных сигналов шаблоны при определенных условиях. Эксплуатируя многопараметрических потенциала проточной цитометрии, несколько сигнальных путей может быть одновременно исследовано в разных подмножеств населения гетерогенных клеток периферической крови. Эти черты предлагают преимущества перед другими технологиями на основе антител, иммуногистохимия, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA), блок протеина и обратной фазы белка массив (RPPA)¹. Фосфоресцентный проточной цитометрии может сочетаться с люминесцентные клеток штриховое кодирование (FCB), что означает, что образцы отдельные клетки помечены с уникальными подписями флуоресцентных красителей, так что они могут быть смешаны вместе, витражи и проанализированы как единого образца². Это уменьшает потребление антител, повышает надежность данных через сочетание управления и обработанные образцы и повышает скорость приобретения. Численностью населения FCB затем можно разделить на меньшие образцов и окрашивали до 35 различных фосфо специфические антитела, в зависимости от количества исходного материала. Таким образом, большие профилирования эксперименты выполняется с стандартным цитометр оборудования. Фосфоресцентный проточной цитометрии был применен к профилю, сигнальные пути в пациентов образцов из нескольких гематологических рака, включая хронического лимфолейкоза (ХЛЛ)^3,4,5, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) ⁶ и неходжкинских лимфом⁷. Таким образом, фосфористой проточной цитометрии является мощный подход к характеризуют сигнализации аберраций, выявления и проверки биомаркеров и оценить фармакодинамика.

Здесь оптимизированный протокол для анализа ХЛЛ пациентов образцов подачей cytometry фосфористой предоставляется (рис. 1A). Приведены примеры базальной сигнализации характеристика, стимуляции рецепторов клеток anti-IgM/B и наркотиков возмущений. Приводится подробное описание FCB матрицы. Протокол может быть легко адаптирована для других типов клеток подвеска.

Протокол

Образцы крови были получены после письменного информированного согласия от всех доноров. Исследования была утверждена региональным комитетом для медицинских и здравоохранения исследовательской этики Юго-Восточной Норвегии и исследования крови человека была проведена в соответствии с Хельсинкской декларации⁸.

Примечание: Шаги 1-3 должны выполняться в стерильных условиях в культуре ткани капюшоном.

1. изоляция мононуклеаров периферической крови (получения) из образцов крови пациента ХЛЛ

Предупреждение: Кровь человека должны обрабатываться согласно правилам для 2-го уровня биобезопасности.

1. Разбавления крови 1:1 с фосфат амортизированное saline (PBS: 136.9 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10.1 мм Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 1.8 мм х₂PO₄, рН 7,4) и передачи в 50 мл трубки (30 мл).
2. Тщательно слой 10 мл градиента плотности среды (например, Lymphoprep) в нижней части трубки с помощью пипетки 10 мл.
3. Центрифуга на 800 x g 20 мин при 4 ° C. Получения теперь видны на вершине плотность градиента среднего слоя.
4. Использование пипетки Пастера перевести клетки на две новые трубы 50 мл. Мыть дважды с PBS (заполнить трубы).
5. Центрифуга на 350 g x 15 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте в 3 мл ФСБ.
6. Подсчет количества ячеек с использованием предпочтительного метода.
7. Центрифуга клетки на 350 x g для 5 минут удалить супернатант. Примечание: 1.8 в 3.2 шаги являются необязательными. Это позволяет перейти непосредственно к шагу 3.3.
8. Ресуспензируйте клетки плода бычьим сывороточным (ФБС) с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и заморозить вниз в подходящих аликвоты, используя крио трубы.
   Примечание: ДМСО токсичны для клеток. Работе быстро, когда клетки смешивают с FBS/ДМСО. Клетки могут быть хранимой долгосрочной перспективе в жидком азоте.

2. отогрева клетки

1. Быстро разморозить клетки в ванну воды 37 ° C.
   Примечание: ДМСО токсичны для клеток. Работе быстро, чтобы ограничить воздействие ДМСО.
2. Вымойте клетки один раз с 10 мл холодной среды Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI 1640 с дополнительной GlutaMAX, смотрите Таблицу материалы).
3. Центрифуга на 300 x g 5 мин отбросить супернатант.
4. Ресуспензируйте клеток в среде RPMI 1640, дополненная пируват натрия, MEM несущественные аминокислот и пенициллин/стрептомицина (Добавлено при разбавлении 1 x согласно инструкции) и 10% FBS. Клетки перехода к колбе культуры мелкоклеточный и оставить в инкубаторе в 5% CO₂, 37 ° C в течение 1 часа, чтобы позволить клетки для калибровки.

3. Подготовка клеток

1. Количество жизнеспособных клеток с использованием предпочтительного метода.
2. Клетки перехода к 50 мл трубки и центрифуги на 300 x g для 5 минут удалить супернатант.
3. Ресуспензируйте клеток в среде RPMI 1640 (шаг 2.2) дополнен с 1% FBS не более чем 50 x 10⁶ клеток/мл.
4. Передать необходимое количество суспензию клеток скважин в 96 хорошо V-днище.
   Примечание: Количество скважин соответствует количество условий для проверки. Образцы для стимуляции-курс взяты из одной скважины. Вычислите 50 мкл пример в момент времени + 50 мкл мертвого объема. Сохранение образцов для компенсации элементов управления (один безупречный образец + один образец за штриховое кодирование краситель).
5. Передача пластину 96 хорошо разогретую 37 ° C водяной бане. Остальные клетки за 10 мин.

4. стимулирование и фиксации клеток

Примечание: Выполните шаги 4-8 на стенде лаборатории (т.е., не стерильный).

Предупреждение: Основной ингредиент исправить буфера я это параформальдегида, который является токсичным (вдыхании и контакте с кожей). Обращаться с осторожностью.

1. Подготовить 96 хорошо V-днище с 60 мкл буфера исправить я за хорошо на сэмпл. Оставьте в водяной бане 37 ° C.
   Примечание: Ячейки: Исправление буфера должно быть 1:1. Чтобы на испарение при 37 ° C, исправить буфер — первоначально в изобилии.
2. При необходимости лечения клетки с наркотиками до стимуляции.
3. Передача 50 мкл пример управления к пластине исправить. Смешайте закупорить вверх и вниз.
4. При необходимости Начните стимуляции время курс, добавив 10 мкг/мл anti-IgM к клеткам. Смешайте закупорить вверх и вниз.
5. Передача 50 мкл пример пластины исправить в каждый момент времени. Смешайте закупорить вверх и вниз.
   Примечание: Anti-IgM индуцированной сигнализации обычно начинается рано (в минутах).
6. Оставьте пластины исправить при 37 ° C в течение 10 минут после того, как последний пример был добавлен.

5. люминесцентные клеток штриховое кодирование (FCB)

Примечание: Приведена Таблица 1 список штриховое кодирование реагентов.

1. Мыть фиксированные клетки 3 x с PBS (заполнение скважины).
2. Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.
3. Подготовьте 96 хорошо V-днище с реагентами штриховое кодирование. Накапайте 5 мкл Реагента каждого штриховое кодирование на скважину в количество комбинаций, необходимых для пятно все образцы после окрашивания матрицы, например, на рисунке 1B. Каждый образец будет иметь уникальную комбинацию концентраций различных штриховое кодирование.
4. Ресуспензируйте клетки в 190 мкл PBS и передачи пластину штриховое кодирование. Тщательно перемешать.
   Примечание: Пятно один образец компенсации с самой высокой концентрацией окончательный, используемые для каждого реагента штриховое кодирование и сохранить один безупречный пример.
5. Оставьте клетки для 20 мин при комнатной температуре, в темноте.
6. Мыть окрашенные клетки 2 x с потоком мыть (PBS, 1% FBS, азид натрия 0,09%) (заполнить скважин).
7. Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.
8. 190 мкл потока мыть в клетки и объединить перепутываются образцов в одной тубе 15 мл. Передача управления каждого компенсации в отдельном 1,7 мл трубку.
9. Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.

6. клетки Permeabilization для окрашивания внутриклеточных антигена

Предупреждение: Основной ингредиент Пермь буфера III является метанола, который горючих и токсичных (вдыхании и контакте с кожей). Обращаться с осторожностью.

1. Передать 15 мл 2 мл Пермь буфера III. Оставьте при-20 ° C, так что это ледяной после использования.
   Примечание: В Перми буфер можно оставить в-20 ° C с самого начала эксперимента.
2. Добавьте 1,5 мл ледяной Пермь буфера перепутываются клеток населению (15 мл) и 100 мкл каждого компенсации элемента управления (в 1,7 мл трубки) каплям при vortexing, чтобы избежать, что клетки слипаются.
3. Напрямую передавать клетки-80 ° C. Оставьте как минимум 30 мин.
   Примечание: Это естественно для приостановки эксперимент на данный момент. Клетки в Перми буфера может быть хранимой в долгосрочной перспективе при температуре-80 ° C.

7. антитело пятная

Примечание: Приведена Таблица материалов список зарегистрированных фосфо специфических антител.

1. Передача клетки от-80 ° C к коробке льда.
2. Вымойте 3 x с потоком мыть.
   Примечание: Важно добавить поток мыть в избыток, чтобы увидеть ячейки Пелле, например, добавить 3 мл потока мыть популяции клеток перепутываются и 1 мл на каждый элемент управления компенсации.
3. Центрифуга на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
4. Ресуспензируйте перепутываются популяции клеток в объеме потока мыть, что позволяет 25 мкл суспензии клеток на пятно фосфо антитела. Ресуспензируйте компенсации управления в 200 мкл потока мыть.
5. Подготовка антител для пятнать в 96 хорошо V-днище. Окончательный объем будет 50 мкл/хорошо. На хорошо добавьте фосфо специфические антитела, разбавленных в поток мыть в окончательный объем 10 мкл, поверхности маркер, разбавленных в поток мыть в окончательный объем 15 мкл и 25 мкл суспензии клеток.
   Примечание: Разбавления антитела должны быть титруют до эксперимента. Включите изотипа управления.
6. Оставьте клетки для 30 мин при комнатной температуре, в темноте.
7. Мыть окрашенные клетки 2 x с потоком мыть (заполнение скважины).
8. Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.
9. Ресуспензируйте клетки в 150 мкл потока мыть.

8. Подготовка компенсации элементов управления

1. Подготовьте элементы компенсации конъюгированных антител флуорохромов параллельно с Пятнать антитела. Используйте шарики компенсации согласно инструкциям производителя.

9. поток Cytometry анализ

Примечание: Эксперимент может быть выполнен на проточный цитометр с высокой пропускной способностью сборники (HTS).

1. Оптимизируйте фотоэлектронный умножитель напряжения трубки (ПЛТ) с неокрашенных управления.
2. Запуск управления компенсации и рассчитать компенсацию матрицы.
3. Запуск образцов. Частота событий должно соответствовать спецификации инструмента.

10. стробирования стратегии и анализа данных

1. Импорт файлов FCS из эксперимента для потока cytometry анализ программного обеспечения как FlowJo или Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
2. Шлюзовые стратегия
   1. Выберите лимфоцитов путем построения SSC-A по сравнению с FSC-A в участке плотность точка.
   2. Лимфоциты и выберите фуфайки путем построения SSC-A по сравнению с FSC -W.
   3. Отображение единичных клеток и ворота ячейки типа путем построения SSC-A по сравнению с поверхности маркер.
   4. Отображение типа популяции клеток в Pacific Blue сюжет по сравнению SSC-A плотность и выберите различные популяции FCB, основанный на их Pacific Blue пятнать интенсивности (см. рис. 1A).
   5. Участок канала фосфористой антитела против FCB канала, или как heatmap (см. рис. 1A) для отображения событий фосфорилирования.
3. Рассчитать фосфо сигналы, используя обратный гиперболический синус (arcsinh) МФО (средней интенсивности флуоресценции) фосфо сигнал против изотипа управления (уровень базальной фосфорилирование, см. Рисунок 1 d), или стимулировали против кератоз клеточных популяций (см. Рисунок 1E).

Результаты

Основные этапы протоколом cytometry потока фосфористой приведены на рисунке 1A. В примере представлены клетки CLL окрашивали с реактивом штриховое кодирование, Pacific Blue на четыре разведениях. Трехмерные штриховое кодирование может выполняться путем объединения трех штриховое кодирование красители, как показано на рисунке 1B. Отдельные образцы затем deconvoluted на последующие стробирования на каждой штриховое кодирование реаг...

Обсуждение

Фосфоресцентный проточной цитометрии – это мощный метод для измерения уровней фосфорилирование белков в одиночных клетках. Поскольку этот метод опирается на окрашивание с антителами, фосфористой проточной цитометрии ограничено наличием антител. Кроме того для того чтобы получить надежные результаты, все антитела должны титруют и проверены перед использованием. Подробный протокол для титрования фосфо специфических антител был описано в других разделах¹². Во время дизайн панели рассмотрение соотноше...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Среда для клеточных культур
Фетальная бычья сыворотка	ThermoFisher Scientific	10270169	Добавка к среде для клеточных культур
Пируват натрия	ThermoFisher Scientific	11360-039	Добавка к среде для клеточных культур
MEM заменимые аминокислоты	ThermoFisher Scientific	11140-035	Добавка к среде для культивирования клеток
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Градиентная среда
плотности Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	Для стимуляции рецептора В-клеток
BD Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	Фиксирующий буфер
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Буфер для пермеабилизации
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Реактив штрихкодирования
Сукцинимидиловый эфир тихоокеанской синей	ThermoFisher Scientific	P10163	Реактив штрихкодирования
Тихоокеанский апельсин Сукцинимидиловый эфир, соль триэтиламмония	ThermoFisher	Scientific P30253	Реактив штрихкодирования
Компенсационные шарики	<эм>Определяется пользователем		Правильный вид реакционная способность
Пробирки Falcon	Определяется пользователем
Eppendorf tubes	Определяется пользователем
96 луночных V-образных донных пластин	Определяется пользователем		Совместимо с проточным цитометром
Центрифуги<	em>Определяется пользователем		Для пробирок Eppendorf, пробирок и планшетов Falcon
Водяная баня	Определяется пользователем		регулируемой температурой
	Определяется пользователем		С высокопроизводительным пробоотборником (HTS)
Name<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
< strong>Antigen
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Ингибиторы тирозинкиназы селезенки снижают…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Модуляция проксимальной сигнализации в норме и трансформированных…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8398	Clone: F-1 Reference: Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Интерлейкин-33 управляет провоспалительным эндотелием…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)Beckton	Dickinson Pharmingen	558443	Clone: J117-1278 Ссылка: Myhrvold et al., 2018, Одноклеточное профилирование уровней фосфо-белка в.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Снижение ингибиторов тирозинкиназы селезенкиназы…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Модуляция проксимальной сигнализации в норме и трансформированных…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Различные паттерны передачи сигналов рецепторов B-клеток в …, Кровь, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/Itk (pY180)	Beckton Dickinson Pharmingen	564846	Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell Prator signaling in…, Кровь, 129(6): 759-770
Btk (pY551)	Бектон Дикинсон Фарминген	558129	<сильный>Клон: 24a/BTK (Y551)  Reference: Kalland et al., 2012, Модуляция проксимального сигнала в нормальном и трансформированном состоянии…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/ITK (pY511)	Beckton Dickinson Pharmingen	558134	Clone: 24a/BTK (Y551)  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tirosin kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ (стр. 142)	Beckton Dickinson Pharmingen	558489	Clone: K25-407.69 Reference: Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Гистон H3 (pS10)	Cell Signaling Technologies	9716	Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Iκ Bα	Технологии клеточной сигнализации	5743	Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
LAT (pY171)	Beckton Dickinson Pharmingen		558518Clone: I58-1169 Reference: Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)	Beckton Dickinson Pharmingen	558577	Clone: 4/LCK-Y505  Reference: Myhrvold et al., 2018, Одноклеточное профилирование уровней фосфо-белка в.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)	Beckton Dickinson Pharmingen	560043	Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Одноклеточное профилирование уровней фосфо-белка в.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κ B p65 (pS529)	Beckton Dickinson Pharmingen	558422	Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Одноклеточное профилирование уровней фосфо-белка в.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Модуляция проксимальной сигнализации в норме и трансформированной…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Интерлейкин-33 управляет провоспалительным эндотелиальным эндотелием…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
NF-κ B p65 (pS536)	Cell Signaling Technologies	4887	Клон: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Профилирование уровней фосфо-белка в одной клетке в.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Модуляция проксимальной сигнализации в норме и трансформированной…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)	Cell Signaling Technologies	4552	Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Профилирование уровней фосфо-белка в одной клетке в.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Интерлейкин-33 стимулирует провоспалительный эндотелиальный эндотелий, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)	Cell Signaling Technologies	4375	Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Профилирование уровней фосфо-белка в отдельных клетках в.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Снижение ингибиторов тирозинкиназы селезенкиназы…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Модуляция проксимальной сигнализации в норме и трансформированной…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Интерлейкин-33 управляет провоспалительным эндотелиальным эндотелием…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p53 (pS15)	Cell Signaling Technologies	NN	strong>Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 дупликация и сверхэкспрессия Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS20)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, дупликация Flt3 Y591 и сверхэкспрессия Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37)	Cell Signaling Technologies	NN	strong>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 дупликация и сверхэкспрессия Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46)	Cell Signaling Technologies	NN	strong>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 дупликация и сверхэкспрессия Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, дупликация Flt3 Y591 и сверхэкспрессия Bcl-2…, Blood, 109(6):2589-96
PLCγ 2 (pY759)	Beckton Dickinson Pharmingen	558498	Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Одноклеточное профилирование уровней фосфо-белка в.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Различные паттерны передачи сигналов рецепторов В-клеток в…, Кровь, 129(6): 759-770
Rb (pS807/pS811)	Beckton Dickinson Pharmingen	558590	Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Интерлейкин-33 стимулирует провоспалительный эндотелиальный эндотелиальный, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236)	Cell Signaling Technologies	4851	Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)	Cell Signaling Technologies	9257	Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Интерлейкин-33 управляет провоспалительным эндотелием…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)	Beckton Dickinson Pharmingen	558438	Clone: J141-668.36.58  Ссылка: Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)	Beckton Dickinson Pharmingen	612597	Clone: 4a  Reference: Myhrvold et al., 2018, Одноклеточное профилирование уровней фосфо-белка в.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)	Beckton Dickinson Pharmingen	557815	Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)	Zymed/ThermoFisher Scientific	71-7900	Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Обнаружение внутриклеточного фосфорилированного STAT-4 с помощью проточной цитометрии, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)	Beckton Dickinson Pharmingen	612599	Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single-cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Кровь, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)	Beckton Dickinson Pharmingen	612601	Clone: 18/p-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Одноклеточное профилирование уровней фосфо-белка в.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526)	Cell Signaling Technologies	12081	Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Снижение ингибиторов тирозинкиназы селезенкиназы…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)	Beckton Dickinson Pharmingen	557817	Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skå nland et al., 2014, Костимуляция Т-клеток через CD2 и CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Модуляция проксимальной сигнализации в норме и трансформированной…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell Prator signaling in…, Кровь, 129(6): 759-770