Методическая статья

Группа автоматизированных мультиплекс иммунофлюоресценции иммуно онкология исследований на образцах ткани формалин Исправлена карцинома

DOI:

10.3791/58390

⸱

21 января 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pathology, MedImmune, 2Laboratory of Pathology, MedImmune, 3Akoya Biosciences Inc., 4Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas - MD Anderson Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробный протокол является оптимизированы и шести маркер мультиплекс иммунофлюоресценции группа, с помощью автоматизированных ситечко для получения более надежного результата и продолжительности процедуры. Этот подход может быть непосредственно адаптирована в любой лаборатории для исследования иммуно онкология.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Продолжение разработок в иммуно онкологии требуется углубление понимания механизмов иммунологии рака. Immunoprofiling анализ образцов ткани от формалин исправлена, парафин врезанных биопсий (FFPE) стал ключевым инструментом для понимания сложности иммунологии опухоли и открывая Роман интеллектуального биомаркеров для иммунотерапии рака. Immunoprofiling анализ тканей требует оценки комбинированных маркеров, в том числе субпопуляций воспалительных клеток и иммунных контрольно-пропускные пункты, в микроокружения опухоли. Появление Роман мультиплекс иммуногистохимических методов позволяет эффективнее многопараметрических анализа разделов одного ткани чем стандартные monoplex иммуногистохимии (IHC). Один из коммерчески доступных мультиплекс иммунофлюоресценции (если) метод на основе усиления tyramide сигнала и, в сочетании с многоспектральной микроскопического анализа, позволяет для лучшего разделения сигнала различных маркеров в ткани. Эта методология совместим с использованием неконъюгированной первичных антител, которые были оптимизированы для стандартных IHC на FFPE образцов тканей. Здесь мы подробно описать автоматизированных протокол, который позволяет мультиплекс если маркировка образцов ткани железы с шести маркер мультиплекс антитела группы в составе PD-L1, ПД-1, CD68, CD8, Ki-67 и AE1/AE3 cytokeratins с 4, 6-diamidino-2-phenylindole как изображение ядерных клеток. Мультиплекс группы протокол оптимизирован в автоматизированной IHC ситечко для окрашивания время, что короче, чем ручной протокола и можно непосредственно применять и адаптировать любой следователь Лаборатория иммуно онкология исследований на образцах ткани FFPE. Также описаны несколько элементов управления и инструменты, включая падение управления метод для тонкой контроля качества новых мультиплекс если группы, которые полезны для оптимизации и проверки техники.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoprofiling анализ образцов ткани тумора FFPE стала важным компонентом исследований иммуно онкологии, особенно для обнаружения и проверки Роман интеллектуального биомаркеров для иммунотерапии рака в контексте клинических испытаний1 ,2. Хромогенный IHC, используя химические chromogens например Диаминобензидин, остается стандартным методом диагностики патологии для immunolabeling биопсия тканей3. Стандартный IHC может также использоваться для immunoprofiling ткани рака, включая количественный субпопуляций лимфоцитов опухольассоциированных и оценки выражения уровни иммунных контрольно-пропускных пунктов как запрограммированной клеточной смерти лигандом 1 (PD-L1)4 ,5. Стандартный IHC является ограниченным, однако в том, что в разделе ткани могут быть помечены только один антиген. Потому что immunoprofiling исследования, как правило, требуют анализа комбинированных выражение несколько маркеров, использование стандартных IHC потребует пятнать несколько разделов ткани, каждый витражи с одного маркера и следовательно, будет существенно ограничены для анализа проб небольших ткани как биопсия иглы ядро. Стандартные методы IHC также ограничены для оценки маркеров, которые coexpressed на различных клеточных популяций, как это обычно происходит с маркерами иммунной контрольно-пропускной пункт, например PD-L1, которая выражается опухольассоциированных макрофагов и раковые клетки. Это ограничение сообщалось в, например, использование стандартных monoplex IHC патологоанатомами для количественного анализа IHC маркера, выраженных клеток различных типов6. Разработка методов мультиплекс хромогенных IHC используя разнообразные цветные chromogens на же представляет раздел ткани выдвижение над стандартным методом ИГХ monoplex,7 , хотя они остаются ограничивается immunolabeling из нескольких маркеры и также представляет важную техническую проблему для надлежащей оценки маркеров, выраженных в же субцеллюлярные отсеков же клеточных популяций.

Вышеупомянутые оговорки относительно наличия ткани из клинических образцов, а также ограничения мультиплекс хромогенных IHC методов, привели к необходимости разработки мультиплекс методов для исследования иммуно онкология, основанные на флуоресцентные метки в сочетании с изображений системы, которые могут эффективно отделить сигналы нескольких флуорофоров от тот же слайд. Один из таких методов на основе усиления сигнала tyramide (АСП) в сочетании с многоспектральной микроскопии изображений для эффективного цвета разделения8. Коммерчески доступных комплект на основе TSA применяет флуорофоров, оптимизированный для многоспектральных изображений8 (см. Таблицу материалы). Важнейшим конкурентным преимуществом этой системы является ее совместимость с же немеченого первичного антитела, которые уже были проверены и оптимизирован для стандартных хромогенных IHC9,10,11. Это позволяет не только быстрее оптимизации, но и гибкость в оптимизации и группа изменений, включения новых целей. Кроме того, метод TSA мультиплекс иммунофлюоресценции (МВС) могут быть оптимизированы для коммерчески доступных автоматизированных систем IHC Стайнер, позволяя для простой передачи от monoplex хромогенных IHC mIF.

Здесь мы представляем протокол МВС группа для исследования иммуно онкология, основанные на автоматизированных mIF TSA окрашивание и использует многоспектрального сканера для воображения. Этот протокол могут быть адаптированы и изменение пользователем любой лаборатории с доступом к описано оборудование и реагенты. Протокол включает в себя группу из шести первичных антител для immunoprofiling карциномы: PD-L1, ПД-1, CD68 (как маркер Пан макрофагов), CD8 (Т-цитотоксические клетки), Ki-67 и AE1/AE3 (pan Цитокератины, используется как эпителиального маркер для идентификации карцинома клетки). Недавнее исследование описывает оптимизации ручной TSA mIF протокола с помощью хромогенных IHC как стандартную ссылку для проверки мультиплекс, окрашивание12. Обновленный метод, представленные здесь была разработана с помощью коммерчески доступных, семь цветов TSA комплект оптимизированы в автоматизированных Стайнер, резко сокращая окрашивания время от 3 – 5 дней до 14 h, а также улучшение согласованности окрашивание. Помимо подробного основного протокола, представленные здесь в разделе Дополнительных материалов включает в себя метод «капля контроль», процесс дополнительного контроля качества для оценки новой группы МВС, а также технические примечания для оптимизации, Устранение неполадок и разработка новых мультиплекс панелей, чтобы помочь пользователю настроить и оптимизировать метод mIF TSA для заказной mIF панелей лаборатории.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Протокол, представленные здесь описывается выполнение immunoprofiling mIF группы с помощью TSA для шести антител (CD68, ki67, PD-L1, ПД-1, CD8 и AE1/AE3) на автоматизированных Стайнер (см. Таблицу материалы). Протокол также описывает, как выполнять перетаскивания элементов управления для контроля качества новой группы mIF (см. Дополнительные материалы). В этом протоколе окрашивание выполняется с восьми неокрашенных FFPE слайды из человека миндалин (положительный контроль) и восемь неокрашенных слайды из человеческих легких аденокарциномы. Первый слайд используется для полного мультиплекс окрашивания всех шести маркеров, второй слайд для изотипа управления, в котором используются не первичного антитела и оставшихся шести слайдов для перетаскивания элементов управления (см. Дополнительные материалы). Дополнительный элемент управления для ткани аутофлюоресценция настоятельно рекомендуется и всегда должны быть включены в многозальный кинотеатр исследования (см. Дополнительные материалы). Однако следователи могут использовать другие типы опухоли и контроля согласно их собственных целей проекта. Лаборатория пользователей без предыдущего опыта работы с mIF TSA метода и методики многоспектрального сканера следует читать мультиплекс IHC развития руководство (доступна в Интернете по адресу http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Хотя это руководство описывает ручной протокол, он также обеспечивает хорошее введение в mIF, окрашивания методом. Все разделы ткани, используемые в настоящем протоколе были обезличенные и утвержден в соответствии с Хельсинкской декларации.

1. ткань образцов

  1. Выберите образец человека миндалины FFPE, содержащие лимфоидной гиперплазии использоваться как положительный контроль и FFPE человеческих легких аденокарциномы образец заведомо PD-L1 положительный. Обзор гематоксилином и эозином (H & E) слайды выбранного легких Рак блоков, чтобы подтвердить наличие опухоли. Важно избежать опухоли с обильными области некроза, как это может увеличить фон неспецифичный пятнать.
    Примечание: Для оптимизации, Избегайте использования парафиновых блоков, которые были сохранены для 10 или более лет и ткани с сушеные появление в блоке парафина (консультироваться со специалистом гистология).
  2. Используя микротом, вырежьте 10 последовательных последовательных секций от каждого блока, толщиной 4 мкм. Смонтируйте разделы на положительно заряженный стеклянное скольжение для IHC, один раздел на слайд.
    Примечание: Секции должны быть смонтированы совершенно плоские без морщин, как морщины могут генерировать окрашивание артефактов. Число слайдов серийный секций от 1 до 10.
  3. Подготовьте новый H & E слайд на первой секции. Обзор H & E слайд с помощью патологоанатом, чтобы подтвердить наличие легких или ткани опухоли миндалины оставшиеся в блоке.
    Примечание: Позднее, этот H & E слайд может помочь с выбором регионах, представляющих интерес для многоспектральный анализ и фенотип.
  4. Храните неокрашенных разделы в коробке пластиковых слайдов на 4 ° C на срок до трех месяцев.

2. Создание новой mIF окрашивания программа автоматизированной Stainer: регистрация реагентов

Примечание: Реагенты должны быть добавлены к списку реагента в программного обеспечения автоматизированной Стайнер прежде чем они станут доступными для использования в протоколах. См Таблицу материалов для информации на автоматизированных Стайнер модель и версия программного обеспечения.

  1. Щелкните на вкладке реагентов в рамках программного обеспечения автоматизированной ситечко. Нажмите кнопку Добавить , чтобы назначить нового реагента. Введите имя (например, «520 TSA реагент») и сокращенное название (например, «520 TSA»), отметив, что есть не более восьми символов. Выберите вспомогательные из раскрывающегося меню и установите поставщик. Не изменяйте Стандартный пятно от DS сингл/последовательный. Настройка по умолчанию, окрашивание протокол к Протоколу F. Установите протокол по умолчанию HIER ЭР120.
  2. Сохранение нового реагента и повторите шаг 2.1 для всех реактивов, перечисленных в таблице 1.

3. автоматизированный Stainer: Регистрация контейнеров

  1. Напишите имя реагента для использования на стороне каждого контейнера. Сканирование штрих-кода на стороне. В всплывающем окне выберите правильный реагент из списка. Выберите дату окончания срока действия и сохранить.
  2. Повторите процедуру на шаге 3.1 для всех реактивов, перечисленных в таблице 1.
  3. Зарегистрируйте открытые исследования Kit. Сканировать как штрих-кода на стороне комплект и следуйте указаниям на экране. Имя комплекта «Мультиплексного исследования Kit 1.» Зарегистрировать 1 x tris (гидроксиметил) aminomethane (Tris)-буфер солевой раствор как часть комплекта (Таблица 1).

4. Автоматизированная Stainer: Создание протокола программы mIF

  1. Базовый протокол мультиплекс предварительно с именем Опал 7 мультиплекс на новых автоматизированных stainers (см. модель и версия программного обеспечения в Таблице материалы). Найдите протокола путем фильтрации для «всех» вместо «предпочтительный» на экране протокол. Если отсутствует базовый протокол, затем обновите программное обеспечение автоматизированных ситечко с помощи от производителя.
  2. Все изменения должны проводиться на копии оригинального протокола. Прежде чем вносить изменения, сохраните оригинал и создать копию, выбрав вкладку протоколы , затем щелкните правой кнопкой мыши Опал 7 мультиплекс протокол копирования.
  3. Измените имя на 7 мультиплекс протокол 1 в новом окне и выберите вкладку связанные с правильным устройством (слово модель или benchtop). Матч с протоколом в Дополнительной таблице S1. Нажмите кнопку Добавить реагент для добавления 10 мин пероксидазы ингибирование шаг (не является частью стандартного протокола) и выберите пероксидазы ингибитором как реагент.
  4. Подтвердите, что блокирующий шаги использовать PKI блокирующий буфер. Убедитесь, что каждое основное антитело относится к соответствующим реактивом, что вторичное антитело шаги используют HRP полимера, и что спектральные 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Комплект многоспектральных автоматизации используется. Подтвердите выбор, проверяя реагента, который был назначен для каждого соответствующего шага в раскрывающемся меню на экране протокол.

5. Автоматизированная Stainer: Добавление перетаскивания элементов управления и протокол управления Isotype

  1. Скопируйте имя 7 мультиплекс протокол 1 и изменить его на 7 мультиплекс протокол 1 CD68 DROP. Измените реагент Антитело CD68 Мыши IgG и сохранить протокол.
  2. Создание шести более новых протоколов, один для каждого элемента управления раскрывающегося и один для управления полным изотипа (изменение всех антитела к соответствующим изотипов) таким же образом.

6. автоматизированные Stainer: Слайд подготовка протокола

  1. Скопируйте prestaining протокол * испечь и Dewax и переименовать этот протокол многоспектральных испечь и Dewax 2 h.
  2. Настройте протокол для соответствия реагентов, показано в таблице 2. Выпекать слайды втечение 2 ч при температуре 60 ° C. DEWAX за 30 сек при 72 ° C.

7. Автоматизированная Stainer: Подготовка реагентов

  1. Подготовьте один комплект для обнаружения исследований. Один Реагент должен быть постоянно связан с этим комплектом, поэтому заполнить 30 мл открытый контейнер для 1 x трис амортизированное saline (TBS), отмеченные 1 x TBS и найти это в позиции 1 (габаритной ширины ручки) в комплект исследований обнаружения места для мультиплексного исследования Kit 1. этот реагент будет постоянно связан с этим комплектом исследования и не должны изменять позицию для использования в будущем.
  2. Ярлык два открытых контейнеров 30 мл Многоспектральных блока и Многоспектральных среднего. Заполните контейнер Многоспектральных блок с 30 мл блокирующий буфер/антитела разбавителя от многоспектральных окрашивание комплект. Заполните Многоспектральных вторичный контейнер с 30 мл mouse/анти-rabbit вторичное антитело полимера от многоспектральных окрашивание комплект.
  3. Подготовьте десять 7 мл открытые контейнеры. Необходимый объем в микролитров составляет 600 + (150 x [количество слайдов]). Каждое антитело будет применяться к 12 слайдов в данном случае (шесть миндалин и шесть легких). Маркировки и томов для всех контейнеров, обозначены в таблице 3.
  4. Для каждого антитела трубки, сначала добавьте антитела разбавителя, следуют сосредоточено основное антитело в объемах, указанных в таблице 3. Смешайте нежно закупорить.
  5. Подготовка 7 мл открытый контейнер для DAPI, используя четыре капли DAPI концентрата на миллилитр двойной дистиллированной воды; в общей сложности 16 будет быть запятнано с DAPI (600 + [150 x 16] = 3000 мкл). Добавьте 3 мл двойной дистиллированной воды плюс 12 капель спектральных DAPI в контейнер. Подготовьте свежие DAPI для каждого запуска.
  6. Подготовьте 7 мл открытый контейнер для пероксидазы ингибитора. Все 16 слайды будут рассматриваться с пероксидазой ингибитора (600 + [150 x 16] = 3000 мкл). Добавьте 3 мл конъюгат блока в контейнер.
  7. Перед подготовкой рабочей концентрации fluors, Ресуспензируйте все лиофилизированные fluors путем добавления 75 мкл диметилсульфоксида пробирки Флуор, предоставляемых производителем. Смешать, закупорить. Это акции Флуор TSA. Хранить при 4 ° C.
  8. Подготовьте шесть контейнеров титрования, один для каждого Флуор. Необходимый объем в микролитров составляет 350 + (150 x [количество слайдов]). Каждый Флуор будет применяться к 16 слайдов в данном случае (восемь миндалин и восемь легких). Маркировки и томов для всех контейнеров, обозначены в таблице 4.
  9. Когда все реагенты были зарегистрированы и подготовлен, место каждого контейнера в любом месте на стойке и загрузить все реагенты на автоматизированных ситечко. Зонд подтвердит объем каждого реагента.

8. Автоматизированная Stainer: Образец установки и многоспектральных пятнать

  1. В программное обеспечение автоматизированных Стайнер щелкните слайд Настройка в верхней части экрана. Нажмите кнопку Добавить исследования. Заполните всплывающего окна с идентификатором исследование, исследование имя и комментарии.
    1. Выберите имя исследователя проводит окрашивание запуска из раскрывающегося списка. Оставьте объем дозировки в 150 мкл. Выберите многоспектральных Dewax для подготовки протокола. Нажмите кнопку OK и добавить слайд. В разделе Комментариивведите «Мультиплекс 1 легких 123ABC.» Заполните следующие поля, как указано: Ткани типа = тест ткани; Объем дозировки = 150 мкл; Окрашивания режим = сингл, обычные; Маркер = отрицательный; Пятнать = типа «7 мультиплекс протокол 1»; Подготовка = многоспектральных пекут, Dewax 2 ч; HIER = 20 мин с ЭР1 HIER.
  2. Нажмите кнопку добавить слайд и изменить комментарии и протокол для добавления раскрывающегося элемента управления слайды и изотипа управления слайд. Когда все слайды были добавлены к исследованию, закройте окно добавить слайд и печатать этикетки. Применение метки в области соответствующей метки на каждом слайде.
  3. Загрузить слайды в стойки, применяют покрытия плитки в правильной ориентации, вставить стойки в автоматизированных ситечко и Нижняя лотков. Устройство будет проверять этикетки слайд.
  4. Когда все слайды и реагенты отсканированы и измеряется. Кнопку запуска (►) станет активным. Если autostainer обнаруживает любые ошибки, такие как объем недостаточным реагента, символом желтое предупреждение появится, пострадавших лоток. Если возникает ошибка, щелкните правой кнопкой мыши символ осторожность и исправить ошибку.
  5. Инициировать, окрашивание немедленно или запланировать отложенный запуск. Протокол является приблизительно 14 h в продолжительности. Примечание: Убедитесь, что протокол будет завершена в то время, когда слайды могут быть удалены сразу как Эксес стирки может повлиять на результаты окрашивания.

9. Coverslipping многоспектральных слайдов

  1. Удалить слайды из автоматизированных ситечко и хранить их в шкаф, погруженной в 1 x TBS.
  2. Установите образцы с № 1,5 coverslips и 15 мкл монтажные средства массовой информации (см. Таблицу материалы). Удалите все пузырьки, нажав осторожно на coverslip с кончиком пипетки.
  3. Разрешить слайды для лечения на ночь при комнатной температуре на лабораторном столе. Невулканизованная слайды могут быть отсканированы сразу с тщательной обработке.

10. многоспектральный сканер

  1. Мощность на многоспектрального сканера и его компьютера (см. Таблицу материалы для сведения модели и программного обеспечения). Запустите программное обеспечение управления микроскопом. Откройте дверь многоспектрального сканера, сенсорные кнопки на передней части устройства. Каждый пружинный перевозчик в сканер проводит четыре слайды. Загрузить все слайды в перевозчиков и записать порядок перед загрузкой носителей в устройство.
  2. Выберите Изменить протокол и нажмите кнопку новый...; Затем создайте имя протокола мультиплекс группы 1 и удаления элементов управления. Создайте имя исследования Мультиплекс группы разработки, нажмите кнопку Создать протоколи введите Обзор сканирования фильтра DAPI; затем выберите Сканировать весь слайд и пикселей 0,50 мкм (20 X). Все фильтры и группы должны быть представлены. Если нет, нажмите кнопку изменить фильтры и группы, выберите все пять фильтров (DAPI, FITC, CY3, Техас красный и CY5) и затем нажмите кнопку Редактировать воздействия.
  3. Загрузите перевозчик, выбрав перевозчика с полной мультиплекс аденокарциноме легкого. Выберите правильный слайд с помощью графического пользовательского интерфейса. Фокус ткани, либо вручную, либо с использованием автофокуса. Перейдите к любой области с приемлемым DAPI окрашивание и нажмите кнопку Auto подвергать установить экспозицию в миллисекундах (0-2000 мс).
  4. Повторите ту же процедуру для всех пяти наборов фильтров в столбцах весь сканирования и MSI региона. Убедитесь, что для перехода к области с приемлемым окрашивание и переориентировать микроскопа перед установкой экспозиции для каждого фильтра и увеличение уровня. Авто выставить для всех пяти фильтров в 20 x общей проверки и 20 x многоспектральных изображений мультиспектрального регионов (MSI). Выберите разрешение пиксела 0,50 мкм (20 x). Сохраните протокол и нажмите кнопку назад для возврата на главный экран Vectra программного обеспечения; Нажмите кнопку Сканировать слайды.
  5. Откройте интерфейс для каждого слайда и задать задачу для сканирования. Установите исследование Мультиплекс группы развития, установить протокол мультиплекс группы 1и падение управления и установить Идентификатор слайда Мультиплекс легких ABC123, Мультиплекс CD68 Drop легких ABC123, и т.д. . Когда все слайды были помечены, и ставятся задачи, нажмите кнопку Сканировать. Автоматизированный многоспектральный сканер будет выполнять полный авто сканирования всех слайдов, используя все пять фильтров.

11. многоспектральный сканер: Многоспектральных изображений

  1. После завершения сканирования, откройте программное обеспечение QPTIFF («Phenochart») и нажмите кнопку Load слайд в верхнем левом углу. Это откроет QPTIFF, который является пяти фильтра целом слайд сканирования. Каждый слой содержит информацию из более чем одной Флуор, поэтому утилита является ограниченным, но структура ткани и широкое выражение модели являются очевидными и может использоваться для выбора областей для MSI.
  2. Перейдите к и открыть правильный слайд в исследовании с помощью раскрывающегося списка дерева на левой стороне. Войти (вверху справа) с инициалами пользователя.
  3. Выберите пяти регионов для MSI, используя инструмент « штамп » в верхней части экрана. Консультироваться патологоанатом, если таковой доступен. В разделе выбратьвыберите приобретения; в группе Размер в поляхвыберите 1 x 1; и сужение поля зрения, выберите 0,5 мкм (20 x). На основе Цитокератины (CK) окрашивание (главным образом в Cy5), выберите несколько регионов с опухолью (CK +) и стромы (CK-) для записи образа из общей проверки. Повторите эту процедуру для каждого слайда.
  4. После выбора всех MSI-файлов, закройте программного обеспечения Phenochart и вернуться к Vectra программного обеспечения. Измените задачу из сканирования на MSI для каждого слайда и затем нажмите сканирование снова выполнять коллекции MSI.

12. спектральные расслоение

Примечание: Спектральная unmixing шаг необходим для разделения канала и анализа изображений слайдов. Перед выполнением спектральных расслоение в программном обеспечении Информ, спектральной библиотеки должны быть построены с помощью слайды аденокарциномы легкого витражи с каждым Флуор самостоятельно и с DAPI только. Также эта процедура описана в вышеупомянутых мультиплекс IHC Assay развития руководстве.

  1. После завершения приобретения MSI используют спектральные unmixing программного обеспечения («Информ») для открытия файлов в папке MSI . Эти файлы заканчиваться расширением файла тип .im3.
  2. В разделе Формат изображениявыберите Multispectral; в разделе формат сэмплавыберите флуоресценции; и в разделе источник спектральной библиотеки, выберите Информ.
  3. Чтобы выбрать fluors, выбрать и загрузить все fluors шесть и DAPI из библиотеки построены с горками библиотека аденокарциномы легкого. Щелкните Подготовить все (внизу слева). Спектральная unmixing программного обеспечения будет выполнять спектральных расслоение на всех открытых изображений, используя предоставленный спектральные профили.
  4. С патологоанатом оцените окрашивание шаблон хромогенных одного пятна же целевого объекта в последовательном слайды же ткани.

13. Оценка интенсивности флуоресценции и затухание сигнала

Примечание: Графов инструмент, который выглядит как стрелка с коричневый коробочка, является наиболее важным инструментом для оптимизации мультиплекс и должны быть использованы часто (см. Дополнительные материалы). Используя средство графов в спектральных unmixing программного обеспечения, оцените соотношение сигнал шум, который как минимум должен превышать 10:1 (см. Дополнительные материалы для устранения неполадок и для оценки мультиплекс, окрашивание с перетаскивания элементов управления).

  1. 13.1. с изображением открытой в спектральных unmixing программного обеспечения привлекать средства графов и обследования изображений для оценки интенсивности флуоресценции каждого канала. Между 10 и 20 нормализованных графов целевой интенсивность в легочной ткани. Средство нормализованных графов показан на рисунке 1.
  2. Исключать слайды с рассчитывает максимальный сигнал графов области меньше, чем 10 или нормального сигнала менее пяти для любой маркер, чтобы аутофлюоресценция и пятнать пробить не конкурировать с подлинный сигнал.
  3. Исключить слайды с максимальной подсчитывает больше чем 30 для любого канала, чтобы избежать спектральных кровотечение или неэффективных спектральных расслоение.
  4. Решения высокой или низкой нормализованных графов, регулируя TSA концентрации.

14. анализ многоспектральных изображений

  1. Открыть один или несколько MSI в спектральных unmixing программного обеспечения , и только выбрать fluors для расслоение, представлены в по крайней мере один открыть изображение. Щелкните Подготовить все для unmix все в настоящее время открыт цветных изображений для получения изображения спектральным несмешанных.
  2. Выберите инструмент графов для обследования рассчитывает через каждого изображения путем колебаться над области интереса.
  3. Выберите значок глаза, чтобы открыть редактор представлений. Выберите и настройте интенсивность отображения каждого независимого канала.
  4. Выберите настроить , чтобы открыть сегментации ткани, клетки сегментации, фенотипа и скоринга модули. Эти инструменты необходимы для объективной проверки мультиплекс, окрашивание против хромогенных одного пятна и может использоваться для создания данных количественных phenoptic (Рисунок S1).
  5. Используйте Экспорт вкладку, чтобы сохранить оттенки серого, флуоресцентные, pathview стиль несжатого TIFF и файлов данных из модулей анализа phenoptic для дальнейшего анализа, архивирования и презентаций (Рисунок S1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанные здесь будет обеспечивать результаты, как показано на рисунке 2. Начните с оценки пятнать в элементе миндалин, начиная с поверхности плоскоклеточный эпителий. Гистология миндалин образца могут пересматриваться с патологоанатом, используя H & E слайд в качестве образца. Если хромогенный IHC секции выполняются с же маркеров на один и тот же блок ткани, это может использоваться для подтверждения плотности и распределения каждого маркера на...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Продолжающихся рака иммунотерапия революция является открытие Роман и обещая терапевтические возможности для раковых больных13. Достижения в области иммуно онкологии потребует расширения знаний воспалительной опухолью микроокружения, не только понять биологии иммунологические механизмы, участвующие в канцерогенеза, но и найти интеллектуального биомаркеров для новых Иммунотерапия основе лечения1,2. Из-за сложных биологии рака иммунологии до...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана визуальной, глобальной biologics R & D подразделением компании АстраЗенека. К.р. К.В и C.C.H. являются сотрудниками Perkin Elmer, который производит реагентов (TSA комплект) и многоспектральные сканеры, которые были использованы в этой работе. М.с., к.д., A.H., W.Z., C. Бэгналл, C. Браун, J.C., а.л., к.с., м.р. и J.R.C. являются сотрудниками визуальной с владения акциями и/или запасов интересы или опции в компании АстраЗенека.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Редакционная поддержка была оказана Дебора Шуман визуальной.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
"InForm 2.4.2" программа для расмешивания спектров и анализа изображенийPerkinElmerCLS151066называется "программа для рассечения спектра" в
тексте"Phenochart 1.0.9" программа QPTIFF для выбора MSI и просмотра общего сканирования слайдовPerkinElmerCLS151067называется "программа QPTIFF" в тексте
#1.5 CoverslipsSigma Aldrich2975246
200 Proof ЭтанолKoptecV1001
20x Трис-буферный физиологический растворVWRJ640-4L
Разбавитель антителDAKOS2203
Анти-CD68 Мышиный моноклональныйDAKOM087601-2Клон PG-M1
Анти-CD8 Кролик МоноклональныйVentanaM5392Клон SP239
Анти-СК Мышь МоноклональныйDAKOM351501-2Клон AE1/AE3
Anti-ki67 Мышиный моноклональныйDAKOM724001-2Клон MIB-1
Анти-PD-1 Моноклональныйклеточный сигнал кролика#86163Клон D4W2J
Анти-PD-L1 Кролик моноклональныйVentana790-4905Клон SP263
Раствор депарафина связиLeicaAR9222Называется "раствор депарафина" в тексте
Bond Epitope Retrieval Solution 1LeicaAR9961под названием "ER1" в тексте
Bond Epitope Retrieval Solution 2LeicaAR9640под названием "ER2" в текстовом
тексте Bond Open Containers, 30 млLeicaOP309700под названием "30 mL open containers" в тексте
Bond Open Containers, 7 млLeicaOP79193под названием "7 mL open containers"" в тексте
Bond Polymer Refine Detection DetectionLeicaDS9800Называется "хромогенный набор для обнаружения" в
тексте Bond Research Detection KitLeicaDS9455В тексте "исследовательский набор для обнаружения" в тексте
Bond Titration KitLeicaOPT9049В тексте "Titration kit" в тексте
Bond Universal Covertile NovocastraLeicaS21.2001Называется "ковертилька" в тексте
Bond Wash Solution 10X ConcentrateLeicaAR9590Называется "10x Wash solution" в
тексте BondRX AutostainerLeicaНазывается "автоматический морилка" в тексте
BondRX Software Version 5.2.1.204LeicaНазывается "автоматизированное программное обеспечение для окрашивания" в тексте
Opal 7-Color Automation IHC KitPerkinElmerNEL801001KTНазывается "мультиспектральный набор для окрашивания" в тексте
Peroxidase BlockLeicaRE7101
ProLong Diamond Antifade MountantThermoP36965Называется "slide mountant" в тексте
Starfrost SlidesFisher15-183-51
Мультиспектральный микроскоп Vectra Polaris с программным обеспечением "Vectra 3.0.5" для управления мультиспектральным микроскопомPerkinElmerCLS143455Называется "программное обеспечение для управления микроскопом" в текстовом
тексте

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
  2. Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
  3. Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
  4. Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95(2016).
  5. Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
  6. Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
  7. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  8. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  9. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  10. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47(2015).
  11. Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).
  12. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  13. Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
  14. Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
  15. Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48(2018).
  16. Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
  17. Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
  18. Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
  19. Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223(2016).
  20. Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FFPEPD L1 PD 1 CD68 CD8 Ki 67 AE1 AE3

Похожие статьи