Методическая статья

Изучая белка импорта в хлоропластов, используя протопластов

DOI:

10.3791/58441

⸱

10 декабря 2018 г.

 ,  , 
1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол выразить белков в протопласта, используя метод PEG-опосредованной преобразования. Этот метод обеспечивает простой выражение протеинов интереса, и эффективное расследование локализация протеина и процесс импорта для различных экспериментальных условий в vivo.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хлоропластов является важным органелл, который отвечает за различные клеточные процессы в растениях, таких как фотосинтез и производство многих вторичных метаболитов и липиды. Хлоропласты требуют большое количество белков для этих различных физиологических процессов. Более 95% белков хлоропласта ядро кодировке и импортированы в хлоропластах от цитозоль после перевода на цитозольной рибосом. Таким образом правильного импорта или ориентации этих белков ядро кодировке хлоропластов в хлоропластах имеет важное значение для надлежащего функционирования хлоропластов, а также растительной клетки. Ядро кодировке хлоропласта протеины содержат сигнальные последовательности для конкретной ориентации в хлоропластах. Молекулярные машины, локализованные в хлоропласте или цитозоль признать эти сигналы и выполнения процесса импорта. Для изучения механизмов импорта белка или ориентации хлоропластов в естественных условиях, мы разработали быстрого, эффективного метода, основанного на протопластов, для анализа белка импорта в хлоропластах арабидопсиса. В этом методе мы используем протопласта, изолированных от листовой ткани Arabidopsis. Здесь мы предоставляем подробный протокол для использования протопласта исследовать механизм, по которому белки импортируются в хлоропластах.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хлоропластов является одним из наиболее важных органеллы в растениях. Одна из основных функций хлоропласты — осуществлять фотосинтез1. Хлоропласты осуществляют также многих других биохимических реакций для производства жирных кислот, аминокислот, нуклеотидов и многочисленные вторичные метаболиты1,2. Для всех этих реакций хлоропласты требуют большое количество различных типов белков. Однако хлоропласта геном содержит только около 100 генов3,4. Таким образом хлоропласты необходимо импортировать большинство их белков из цитозоль. В самом деле большинство белков хлоропласта были продемонстрированы быть импортированы из цитозоль после перевода4,5,6. Клетки растений требуют конкретных механизмов для импорта белки из цитозоль в хлоропластах. Однако хотя эти механизмы импорта белка были изучены в течение последних нескольких десятилетий, мы до сих пор не полностью понимаем их на молекулярном уровне. Здесь мы предоставляем подробный метод для подготовки протопласта и экзогенно выражая генов в протопласта. Этот метод может быть ценным для выяснения молекулярные механизмы лежащие в основе белка импорта в хлоропластах в деталях.

Белка импорта могут быть изучены с использованием многих различных подходов. Один из этих методов включает в себя использование в vitro белка импорта7,системы8. Используя этот подход, в пробирке-перевод белка прекурсоров инкубируют с очищенной хлоропластов в пробирке, и белка импорта анализируемой SDS-PAGE, а затем Западный анализ помаркой. Преимуществом этого подхода является, что может подробно каждый шаг белка импорта в хлоропластах. Таким образом этот метод широко используется для определения компонентов молекулярного механизма импорта белка и анализировать сведения о последовательности для транзита пептидов. Совсем недавно был разработан еще один подход с использованием протопласта из листьев тканей, и он стал широко используется для изучения белков импорта в хлоропластах9,10. Преимуществом этого подхода является, что протопласта обеспечивают клеточной среды, которая ближе к нетронутым клеток, чем система, в пробирке . Таким образом система протопластов позволяет нам решать многие дополнительные аспекты этого процесса, например связанные события цитозольной и как определяется специфика ориентации сигналов. Здесь мы представляем подробный протокол для использования протопласта для изучения белков импорта в хлоропластах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. рост растения арабидопсис

  1. Подготовка 1 Л Gamborg B5 (B5) среднего, добавив 3.2 g B5 среды включая витамины, 20 г сахарозы, 0,5 г этана 2-(N-morpholino) сульфоновой кислоты (MES) до приблизительно 800 мл деионизированной воды и скорректировать рН до 5,7 с гидроксидом калия (KOH). Добавить больше деионизированной воды довести общий объем до 1 л добавить 8 g phytoagar и автоклав для 15 мин при температуре 121 ° C.
  2. Разрешить средне-и охладить до 55 ° C и налить в чашку Петри (9 см в диаметре, 1,5 см в высоту) на лавочке чистой 20-25 мл среды, B5. Сухой плиты 2-3 дней, упаковать их чистой пленкой и держать их в холодильник до использования.
  3. Стерилизовать Arabidopsis thaliana семена с 1 мл 70% (v/v) этанола в пластиковых пробирок (e труба), постоянно встряхивая на 2 – 3 мин удалить супернатант, добавить 1 мл раствора гипохлорита натрия 1% (v/v) и поколебать непрерывно в течение 2-3 мин подготовить 100 – 150 семян на Петри блюдо.
    1. Снять supernatants и смыть семена с 1 мл дистиллированной воды. Повторите этот шаг 4 x. Место стерилизации семян на 4 ° C для 3 дней, чтобы синхронизировать прорастания семян.
  4. Сеять семена 100 – 150 на B5 пластин с помощью микропипеткой и прокладкой тарелку с хирургическая лента.
  5. Растут растения в комнате роста с циклом 16/8 ч свет/темно на 100 µmol·m-2·s-1 интенсивности света, 70% относительной влажности и температуре 20 ° C в течение 2 недель.

2. Подготовка плазмида

Примечание: Высокой чистоты плазмид должно использоваться для преобразования; рекомендуется использовать набор для очистки коммерческих плазмиды.

  1. Очистить плазмида (БС-nt:GFP) с использованием комплекта изоляции ДНК. Для концентрации ДНК, выполняют этанола осадков в 1,5 мл трубку и растворяют гранулы ДНК в 100 мкл дистиллированной воды. Определить концентрацию плазмида с помощью спектрофотометром в 260 Нм. Разбавить плазмида до конечной концентрации ~ 2 мкг / мкл. Держите плазмида при-20 ° C до использования.

3. изоляции протопласта

  1. Подготовьте следующие решения.
    1. Приготовляют раствор фермент содержит macerozyme 0,25% (w/v), 1,0% (w/v) целлюлаза, 400 мм D-маннит, хлорид кальция 8 мм (2CaCl), 0,1% (w/v), бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 5 мм МЧС. Отрегулируйте пэ-аш до 5.6 с Кох.
      1. Фильтр фермента решения с помощью ацетат целлюлозы фильтр с размером пор 0,45 мкм. Аликвота 25 мл раствора фермента в 50 мл конические трубы и держать при температуре-20 ° C. Оттепель фермента решение при комнатной температуре (RT) и перемешать хорошо непосредственно перед использованием.
    2. Приготовляют раствор сахарозы 21% (w/v), растворяя 21 г сахарозы в 100 мл деионизированной воды и автоклав решение.
    3. Готовят раствор W5 содержат 154 мм хлорид натрия (NaCl), 125 мм CaCl2, 5 мм хлористый калий (KCl), 5 мм глюкозы и 1,5 мм МЧС. Отрегулируйте пэ-аш до 5.6 с Кох и автоклав решение.
    4. Приготовляют раствор MaMg содержит 400 мм D-маннит, хлорид магния 15 мм (MgCl2) и 5 мм МЧС. Отрегулируйте пэ-аш до 5.6 с Кох и автоклав решение.
    5. Подготовка 1 M D-маннит и 1 M нитрат кальция акций решения, чтобы сделать PEG решение. Автоклав эти решения.
  2. Урожай нетронутыми листьев тканей от 2 недель старый растений от ~ 1 – 2 B5 пластины с помощью хирургического ножа и место собранные листья в 50 мл конические пробки содержащих 25 мл раствора фермента. Место Конические трубки, содержащие фермент решения и листьев ткани горизонтально на роторный шейкер с нежным агитации в темноте. Он занимает 8-12 h для полного переваривания тканей листа.
  3. В 8-12 ч после инкубации Залейте раствор фермента (содержащие протопласта освобожден из тканей листа) в свежих Петри через сетку с размером пор 140 мкм. Тщательно слой протопластов содержащих фермент решение на вершине 15 мл раствора сахарозы 21% (w/v) и центрифуги на 98 g x 10 мин с самых низких настройках ускорения и замедления в ротор размахивая ведро.
  4. С помощью пипетки Пастера, тщательно передать протопласта от самый верхний слой (фермент раствор) и на уровне интерфейса между фермента раствора и раствора сахарозы конические Тюбик 50 мл, содержащие 30 мл раствора W5. Центрифуга для этой трубки на 51 x g за 6 мин. На данном этапе протопласта будет в Пелле в нижней части Конические трубки.
  5. Выбросите супернатанта, тщательно с использованием пипетки не нарушая протопласта Пелле. Добавить 25 мл раствора W5 и нежно ресуспензируйте протопласта. Инкубируйте протопластов раствор в холодильнике 4 ° C для по крайней мере 1 час для стабилизации.

4. протопластов преобразование с помощью полиэтиленгликоля

  1. Подготовить 40% PEG решение путем добавления 4 g PEG 8000, 4 мл раствора маннитола 1 М, 1 мл 1 М Ca (№3)2и 1,8 мл дистиллированной воды в 50 мл Конические трубки и хорошо перемешать. Распустить PEG нагрев в микроволновой печи на 20 – 30 с. место 40% раствора ПЭГ на RT для охлаждения.
    Примечание: 40%, PEG решение должны быть подготовлены свежезаваренным каждый раз. Если протопласта не являются полностью гранулированных во время инкубации 4 ° C в холодильнике, центрифуга материал на 46 x g на 2 мин.
  2. Удалить супернатант тщательно, но полностью и MaMg решение добавить протопластов Пелле приносить концентрации 5 x 10-6/мл.
    Примечание: Количество протопластов может определяться Горяева рассматривать под микроскопом.
  3. Место 10 мкг плазмидной ДНК каждой пустой 13 мл раунд дно трубки и 300 мкл протопластов решения с помощью пипетки.
    Примечание: В конце кончика пипетки должны быть отрезаны. Всякий раз, когда отбираются протопласта, протопластов содержащих раствор следует высокомобильна прямо перед закупорить так что такое же количество протопласта добавляется к каждой трубе.
  4. Смешать плазмидной ДНК с протопласта, осторожно поворачивая трубы и сразу 300 мкл 40% PEG решение с помощью пипетки. Смешайте нежно, но полностью вращающейся трубы и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре; наклона трубки почти горизонтально и повернуть ее несколько раз.
  5. Добавить 1 мл раствора W5 и смешайте нежно но полностью, повернув трубу вручную аналогичным образом. Проинкубируйте образцы для 10 мин при комнатной температуре.
  6. Повторите этот шаг, в два раза больше с помощью 1,5 мл и 2 мл раствора W5, соответственно. Инкубируйте 30 мин после окончательного сложения W5 решения.
  7. Центрифуга на 46 x g 4 мин удалить супернатант и добавить 2 мл раствора W5. Смешайте нежно но полностью. Инкубируйте при 22 ° C в темной камере.

5. Анализ импорта белка в хлоропластах

Примечание: После ПЭГ опосредованной преобразования протопласта, время инкубации колеблется от 8 до 24 ч.

  1. Микроскопии флуоресцирования
    1. Место 10 мкл протопластов решения на слайд стакан с помощью пипетки с наконечником, подстриженные и тщательно крышка с coverslip, чтобы избежать повреждения протопласта.
    2. Место слайда на сцене флуоресценции микроскопа с фильтром возбуждения/выбросов устанавливает для наблюдения за Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) и auto флуоресценции хлорофилла.
    3. Захват изображения с охлаждением зарядовой (связью ПЗС) камеры и процесс изображения, с помощью редактирования изображений программное обеспечение для создания псевдо-цветных изображений.
  2. Общий белок добыча и Immunoblotting
    1. Подготовьте денатурации буфер, содержащий 2,5% (w/v) лаурилсульфат натрия (SDS) и 2% (v/v) 2-меркаптоэтанол.
      Примечание: Белка импорта в хлоропластах могут быть количественно измеряя степень транзитных пептид обработки через immunoblot анализ с использованием антител анти GFP.
    2. Перевести протопластов в пластиковых пробирок и центрифуги на 46 x g на 4 мин.
    3. Удалить супернатант и 80 мкл буфера денатурации. Энергично Вортекс для 5 s и добавить 5 x буфер образца SDS (250 мм трис-Cl (рН 6,8), 0,5 М DTT, 10% (w/v) SDS, 0,05% (w/v) бромфеноловый синий и 50% (v/v) глицерин). Хорошо перемешать и варить 10 мин.
    4. Тема этот образец протеина к стандартным SDS-PAGE и immunoblotting с антителами anti-GFP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Импорт белков в хлоропластах может проверяться с помощью двух подходов: флуоресцентной микроскопии и immunoblot анализ после разъединения SDS-страницы опосредованной. Здесь, мы использовали БС-nt:GFP, слияние построить кодирования 79 N-терминальный аминокислотных остатков RbcS, содержащих транзита пептид, сливается с GFP. Когда белки импортируются в хлоропластах, зеленая Флуоресценция сигналы от целевого белка БС-nt:GFP должен слиться с красной флуоресцентной сигналы от auto флуоресценции...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предоставили подробный протокол для использования протопласта Arabidopsis для изучения белков импорта в хлоропластах. Этот метод является мощным для изучения процесса импорта белка. Этот простой, универсальный метод полезен для изучения нападения на предполагаемых грузов белков в хлоропластах. С помощью этого метода, протопласта готовятся из листовой ткани Arabidopsis11,12 , которая может быть получена из растений на многих стадиях различных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была проведена с поддерживает программы совместных исследований для сельского развития науки и технологий (проект № PJ010953012018), Управление по развитию сельских районов и Грант Национальный исследовательский фонд (Корея), финансируемого министерством науки и ИКТ (№ 2016R1E1A1A02922014), Республика Корея.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
GAMBORG B5 СРЕДА С ВИТАМИНАМИDuchefa BiochemieG0210.0050
САХАРОЗАDuchefa BiochemieS0809.5000
MES МОНОГИДРАТDuchefa BiochemieM1503.0250
Агар, порошокJUNSEI24440S1201
Микропористая хирургическая лента3M1530-0
Хирургическое лезвие нержавеющая сталь No.10FEATHER Недоступная
коническая трубка, 50млSPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Недоступная
целлюлаза ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Недоступный
АЛЬБУМИН, БЫЧИЙ (BSA)VWR0332-100G
D-MannitolSIGMAM1902-1KG
КАЛЬЦИЯ ХЛОРИД, ДИГИДРАТMP BIOMEDICALS0219463505-5KG
ТвистерVISION SCIENTIFICVS-96TW
Чашка для экрана CD-1SIGMAS1145
Экран для CD-1SIGMAS3895
Чашка ПетриSPL LIFE SCIENCES10090
Пипетка ПастераHILGENBERG3150102
ЛАБОРАТОРНАЯ ЦЕНТРИФУГА / НАСТОЛЬНОЕЗРЕНИЕ SCIENTIFICVS-5500N
Хлорид натрияJUNSEI19015S0350
Хлорид калияSIGMAP3911-1KG
D-ГЛЮКОЗА, БЕЗВОДНЫЙБИО БАЗОВЫЙGB0219
Гидроксид калияDUKSAN40
Тетрагидрат нитрата кальцияSIGMAC2786-500G
Поли(этиленгликоль)SIGMAP2139-2KG
Гексагидрат хлорида магния гексагидратSIGMAM2393-500G
Туба 13мл, 100x16мм, PPSARSTEDT55.515
Предметные стекла для микроскопаMARIENFELD1000412
Чехлы для микроскопаMARIENFELD101030
Счетная камераMARIENFELD650030
Axioplan 2 МикропробиркаCarl ZeissНедоступная
микропробирка 1,5 млSARSTEDT72.690.001
2- МеркаптоэтанолSIGMAM3148-250ML
додецилсульфата натрия (SDS), протеомный классVWRM107-500G
TRIS, ультрачистый классVWR0497-5KG
DTT (DL-ДИТИОТРЕИТ), БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ КЛАССVWR0281-25G
бромфенол синяя натриевая соль ACSVWR0312-50G
глицеринJUNSEI27210S0350
Living Colors A.v. Моноклональное антитело (JL-8)TAKARA632381

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
  4. Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
  5. Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
  6. Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
  7. Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
  8. Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
  9. Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
  10. Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
  11. Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
  12. Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
  13. Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
  14. Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
  15. Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
  16. Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Protein Import ChloroplastsProtoplast IsolationFluorescence MicroscopyImmunoblotting AnalysisChloroplast Protein TargetingArabidopsis ProtoplastsProtein Import AssayGFP Fusion ProteinCentrifugation ProtocolsSucrose Gradient

Похожие статьи