Изучая белка импорта в хлоропластов, используя протопластов

Junho Lee; Hyangju Kang; Inhwan Hwang

doi:10.3791/58441

Method Article

Изучая белка импорта в хлоропластов, используя протопластов

DOI:

10.3791/58441

⸱

December 10th, 2018

Junho Lee¹ , Hyangju Kang¹ , Inhwan Hwang¹^,²

¹Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, ²Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол выразить белков в протопласта, используя метод PEG-опосредованной преобразования. Этот метод обеспечивает простой выражение протеинов интереса, и эффективное расследование локализация протеина и процесс импорта для различных экспериментальных условий в vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хлоропластов является важным органелл, который отвечает за различные клеточные процессы в растениях, таких как фотосинтез и производство многих вторичных метаболитов и липиды. Хлоропласты требуют большое количество белков для этих различных физиологических процессов. Более 95% белков хлоропласта ядро кодировке и импортированы в хлоропластах от цитозоль после перевода на цитозольной рибосом. Таким образом правильного импорта или ориентации этих белков ядро кодировке хлоропластов в хлоропластах имеет важное значение для надлежащего функционирования хлоропластов, а также растительной клетки. Ядро кодировке хлоропласта протеины содержат сигнальные последовательности для конкретной ориентации в хлоропластах. Молекулярные машины, локализованные в хлоропласте или цитозоль признать эти сигналы и выполнения процесса импорта. Для изучения механизмов импорта белка или ориентации хлоропластов в естественных условиях, мы разработали быстрого, эффективного метода, основанного на протопластов, для анализа белка импорта в хлоропластах арабидопсиса. В этом методе мы используем протопласта, изолированных от листовой ткани Arabidopsis. Здесь мы предоставляем подробный протокол для использования протопласта исследовать механизм, по которому белки импортируются в хлоропластах.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хлоропластов является одним из наиболее важных органеллы в растениях. Одна из основных функций хлоропласты — осуществлять фотосинтез¹. Хлоропласты осуществляют также многих других биохимических реакций для производства жирных кислот, аминокислот, нуклеотидов и многочисленные вторичные метаболиты¹^,². Для всех этих реакций хлоропласты требуют большое количество различных типов белков. Однако хлоропласта геном содержит только около 100 генов³^,⁴. Таким образом хлоропласты необходимо импортировать большинство их белков из цитозоль. В....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. рост растения арабидопсис

Подготовка 1 Л Gamborg B5 (B5) среднего, добавив 3.2 g B5 среды включая витамины, 20 г сахарозы, 0,5 г этана 2-(N-morpholino) сульфоновой кислоты (MES) до приблизительно 800 мл деионизированной воды и скорректировать рН до 5,7 с гидроксидом калия (KOH). Добавить больше деионизированной воды довести общий объем до 1 л добавить 8 g phytoagar и автоклав для 15 мин при температуре 121 ° C.
Разрешить средне-и охладить до 55 ° C и налить в чашку Петри (9 см в диаметре, 1,5 см в высоту) на лавочке чистой 20-25 мл среды, B5. Сухой плиты 2-3 дней, упаковать их чистой пленкой и держать их в холодильник до использования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Импорт белков в хлоропластах может проверяться с помощью двух подходов: флуоресцентной микроскопии и immunoblot анализ после разъединения SDS-страницы опосредованной. Здесь, мы использовали БС-nt:GFP, слияние построить кодирования 79 N-терминальный аминокислотных остатков RbcS, содержащих транзита пептид, сливается с GFP. Когда белки импортируются в хлоропластах, зеленая Флуоресценция сигналы от целевого белка БС-nt:GFP должен слиться с красной флуоресцентной сигналы от auto флуоресценции.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предоставили подробный протокол для использования протопласта Arabidopsis для изучения белков импорта в хлоропластах. Этот метод является мощным для изучения процесса импорта белка. Этот простой, универсальный метод полезен для изучения нападения на предполагаемых грузов белков в хлоропластах. С помощью этого метода, протопласта готовятся из листовой ткани Arabidopsis¹¹^,¹² , которая может быть получена из растений на многих стадиях различных .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была проведена с поддерживает программы совместных исследований для сельского развития науки и технологий (проект № PJ010953012018), Управление по развитию сельских районов и Грант Национальный исследовательский фонд (Корея), финансируемого министерством науки и ИКТ (№ 2016R1E1A1A02922014), Республика Корея.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
GAMBORG B5 СРЕДА С ВИТАМИНАМИ	Duchefa Biochemie	G0210.0050
САХАРОЗА	Duchefa Biochemie	S0809.5000
MES МОНОГИДРАТ	Duchefa Biochemie	M1503.0250
Агар, порошок	JUNSEI	24440S1201
Микропористая хирургическая лента	3M	1530-0
Хирургическое лезвие нержавеющая сталь No.10		FEATHER Недоступная
коническая трубка, 50мл	SPL LIFE SCIENCES	50050
Macerozyme R-10	YAKULT PHARMACEUTICAL IND.	Недоступная
целлюлаза ONOZUKA R-10	YAKULT PHARMACEUTICAL IND.	Недоступный
АЛЬБУМИН, БЫЧИЙ (BSA)VWR		0332-100G
D-Mannitol	SIGMA	M1902-1KG
КАЛЬЦИЯ ХЛОРИД, ДИГИДРАТ	MP BIOMEDICALS	0219463505-5KG
Твистер	VISION SCIENTIFIC	VS-96TW
Чашка для экрана CD-1	SIGMA	S1145
Экран для CD-1	SIGMA	S3895
Чашка Петри	SPL LIFE SCIENCES	10090
Пипетка Пастера	HILGENBERG	3150102
ЛАБОРАТОРНАЯ ЦЕНТРИФУГА / НАСТОЛЬНОЕ	ЗРЕНИЕ SCIENTIFIC	VS-5500N
Хлорид натрия	JUNSEI	19015S0350
Хлорид калия	SIGMA	P3911-1KG
D-ГЛЮКОЗА, БЕЗВОДНЫЙ	БИО БАЗОВЫЙ	GB0219
Гидроксид калия	DUKSAN	40
Тетрагидрат нитрата кальция	SIGMA	C2786-500G
Поли(этиленгликоль)	SIGMA	P2139-2KG
Гексагидрат хлорида магния гексагидрат	SIGMA	M2393-500G
Туба 13мл, 100x16мм, PP	SARSTEDT	55.515
Предметные стекла для микроскопа	MARIENFELD	1000412
Чехлы для микроскопа	MARIENFELD	101030
Счетная камера	MARIENFELD	650030
Axioplan 2 Микропробирка	Carl Zeiss	Недоступная
микропробирка 1,5 мл	SARSTEDT	72.690.001
2- Меркаптоэтанол	SIGMA	M3148-250ML
додецилсульфата натрия (SDS), протеомный класс	VWR	M107-500G
TRIS, ультрачистый класс	VWR	0497-5KG
DTT (DL-ДИТИОТРЕИТ), БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ КЛАСС	VWR	0281-25G
бромфенол синяя натриевая соль ACS	VWR	0312-50G
глицерин	JUNSEI	27210S0350
Living Colors A.v. Моноклональное антитело (JL-8)	TAKARA	632381

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
Rolland, N., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Изучая белка импорта в хлоропластов, используя протопластов

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles