Здесь мы представляем наши протокол для производства индуцированной эритроидные предшественники (ПРП) от взрослых фибробласты мыши с помощью транскрипции управляемый фактор прямой линии перепрограммирования (DLR).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Прямые, Lineage перепрограммирование взрослых мыши фибробластов в эритроидные предшественники
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эритроидных клеток приверженность и дифференциации перейти через активацию линии ограничена транскрипционный анализ сети, организованные группы клеток судьбы, определение и созревания факторов. Ранее мы намерены определить минимальный набор факторов, необходимых для инструктажа развития красных кровяных клеток, используя прямой линии перепрограммирования фибробластов в индуцированной эритроидные предшественники/прекурсоров (ПРП). Мы показали что Сверхэкспрессия Gata1, Tal1, Lmo2и c-Myc (GTLM) можно быстро преобразовать мышиных и человека фибробластов непосредственно к ПРП, которые напоминают bona fide эритроидные клетки с точки зрения морфологии, фенотип, и экспрессии генов. Мы планируем, что ПРП будет предоставлять бесценным инструментом для изучения эритропоэза и клетка судьба регулирования. Здесь мы описываем процесс поэтапного преобразования мышиных хвостовой оконечности фибробластов в ПРП через транскрипционным фактором driven прямой линии перепрограммирования (DLR). В этом примере мы выполняем перепрограммирования в фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные, которые выражают желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП) под контролем промотора гена (EpoR) рецепторов эритропоэтина, позволяя визуализации эритроидные клетки Судьба индукции после перепрограммирования. После этого протокола фибробласты могут быть перепрограммированы в ПРП в течение пяти до восьми дней.
В то время как еще можно улучшить процесс, мы показывают, что GTLM-опосредованной перепрограммирования быстрый и прямой процесс, уступая клетки с свойствами bona fide эритроидные клетки предшественники и прекурсоров.
Введение
Красные кровяные клетки (эритроциты) важны для всех позвоночных и составляют 84% от всех клеток тела человека1. Из эмбриональных к взрослой жизни наше здоровье сильно зависит от точной регуляции гомеостаза РБК. Текущего производства зрелых эритроцитов на протяжении развития в зрелом возрасте известен как эритропоэза. Серьезной проблемой в эритропоэза исследования заключается в определении главных регуляторов, которые оркестровать РБК развития и переключение между примитивными и окончательного эритропоэза. Прямой линии перепрограммирование эритроидные предшественники представляет возможность для более глубокого понимания эритроидные развития в естественных условиях.
Прямой линии перепрограммирования (DLR), также известный как transdifferentiation, является процесс перепрограммирования один тип ячейки непосредственно в другой, минуя плюрипотентных и Multipotent с прародителем этапов. DLR до настоящего времени был использован для создания многочисленных типов клеток, включая нейронные2, гемопоэтических3,4,5, печеночная6 и нефротическим7, клетки-предшественники. Для развития биологов DLR стал важным инструментом для допрос аспекты приверженность линии и терминала дифференциация процессы8,9. DLR может дополнять и частично заменить в vivo исследований для понимания механизмов судьбы клетки, определяющих факторов во время разработки. DLR протокол для перепрограммирования эритроидные предшественники, описанных в данном документе предоставляет поле бесплатный метод для развития исследований эритропоэза.
Ранее мы показали, что гиперэкспрессия коктейль четырех фактор, GATA1, TAL1, LMO2 и c-MYC (GTLM), достаточно для того перепрограммировать мышиных и человека фибробластов непосредственно к индуцированных эритроидные предшественники (ПРП) 10. GTLM-перепрограммирование эритроидных клеток сильно напоминают bona fide примитивных эритроидные предшественники плане морфологии, фенотип и ген выражение10. Таким образом ПРП имеют ограниченный потенциал распространения и зрелые ядерных эритроцитов аналогичны временно производится в начале эмбриона до начала окончательного эритропоэза. Внеся изменения в перепрограммирования условиях (например, точечные мутации в перепрограммировании факторов или добавление других факторов), можно понять как это приводит к изменениям в развитии эритроидные и дифференциации. Мы например показали, что добавление Klf1 или Myb на GTLM коктейль изменяет Глобин выражения от преимущественно эмбриональных (примитив) в основном взрослых (окончательный). Этот вывод подтверждают обоснованность использования DLR в качестве инструмента для определения развития факторов в эритропоэза.
Здесь мы приводим процесс генерации ПРП от мыши хвостовой оконечности фибробластов (TTF). В результаты нашего представителя, мы провели перепрограммирования на фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные (Epor- Cre R26- eYFP) который Экспресс желтый флуоресцентный белок (eYFP) от Rosa26 Локус во всех клетках, выразили рецепторов эритропоэтина, позволяя легко визуализации приверженность линии эритроидные. С помощью этого метода, рекламы ЯФП позитивные (EpoR +) клетки присутствуют пять дней после передачи в кратчайшие сроки. Этот протокол, таким образом, предлагает быстрый и надежный метод для генерации эритроидные предшественники в пробирке.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Создание и поддержание хвост мыши Совет культуры фибробластов
- Готовить блюда желатин покрытием (рекомендуем 10 см блюдо для одного хвоста), покрывая поверхность с 0,1% желатина и инкубации блюда для примерно 20 минут при 37 ° C. Аспирационная раствор желатина из блюдо и дайте ему высохнуть в течение не менее 2 ч.
- Усыпить мышей от шейки матки дислокации. Удалите хвост с ножницами, резка у основания хвоста. Положите хвост в Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) с 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) до готовой к использованию.
Примечание: Для достижения наилучших результатов, хвосты следует от мышей возрасте около 6-8 недель. Хвосты могут быть взяты из мышей, старше 8-недельного возраста, однако, как возраст мышей, возможность распространения фибробластов и эффективности перепрограммирования уменьшение11. - Выполните все последующие действия настоящего Протокола в культуре ткани капюшоном в стерильных условиях. Приготовляют раствор трипсина разреженных 0,02% трипсина-ЭДТА в DPBS и добавьте 5 мл в блюдо без покрытия 10 см.
- Вымойте хвост, сначала в 70% этанола, а затем в DPBS. В блюдо хвост плоский и использовать пинцет, чтобы удерживать его на месте. Сделайте надрез на хвост вдоль его продольной оси от основания до кончика.
- Возьмите хвост с одной парой щипцов и держать его вертикально. Используя вторую пару щипцов, сцепление кожи рядом с разрез у основания хвоста и чистить его обратно. Сделать это в обе стороны разреза до тех пор, пока кожа может быть снимают, потянув вниз к кончик хвоста.
- Держите очищенные хвост пинцетом над блюдо, содержащих раствор трипсина и отрезать хвост кусочками примерно 1 см длиной. С хвоста штук в раствор трипсина используйте ножницы, чтобы фрагмент частей на более мелкие куски. Инкубируйте хвост кусочки в раствор трипсина при 37 ° C за 10 мин.
Примечание: Чем меньше штук предпочтительны обеспечить каждый кусок высокое отношение площади поверхности к тома. - Утолить трипсина, используя 2 тома фибробластов расширения (ФЕКС) среды (высокий глюкозы Дульбекко изменения Eagle среднего (среде DMEM) с 15% FBS, 2 мм L-глютамином, Non-essential аминокислоты (NEAA) и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина).
- Собрать все содержимое блюдо в 50 мл трубки и центрифуги на 350 × g 5 мин при 4 ° C. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте хвост фрагментов в 10 мл свежего ФЕКС среды.
- Передать желатин покрытием блюдо хвост фрагментов в средних и инкубировать при 37 ° C в 5% CO2 и 4% O2, добавляя свежий ФЕКС среднего каждые 2 дня.
Примечание: После пяти до семи дней, хвост фрагменты придают в нижней части блюда и может рассматриваться фибробластов, удаляясь от них. - После того, как заметили кластеры фибробластов, осторожно встряхните блюдо, чтобы выбить хвост кусочки и аспирационная средне- и все фрагменты костей, оставляя фибробластов, прикреплены к плите. Добавить новое средство ФЕКС и культуре фибробластов до притока.
- Чтобы не загрязнение фибробластов, кроветворные прародителями, отделить клетки от пластины с помощью 1 x трипсина ЭДТА на 5 минут и собирать клетки. Разрушающим клетки, выражая гемопоэтических маркеры (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, анти-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 и тер-119) с помощью системы магнитной сепарации10.
2. ретровируса производство
- Семя ретровирусной упаковка клетки на приблизительно 2,5 × 104 клетки/см2 (2.0 × 106 клеток для 10 см блюдо) на культуре ткани лечили (вакуум газовой плазмы) блюдо и культуры на ночь в среде DMEM высокой глюкозы с 10% FBS, 10 мм натрия Пируват и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина при 37 ° C и 5% CO2.
- На следующее утро измените среде DMEM без добавок, используя половину объема используется для культуры на ночь (5 мл на 10 см блюдо). В послеобеденное время проверьте, что клетки 70-80% притока и начинают transfection.
- Для каждого перепрограммирования фактор Gata1, Tal1, Lmo2и c-Myc, приготовить смесь 2:1 выражение вектор (pMX) и вспомогательные вектора (содержащие гены кляп и ГСМ). Для 10 см блюдо фибробластов используйте 6 мкг вектора выражения и 3 мкг, вспомогательные вектора в окончательном объеме 100 мкл в среде DMEM.
- Для каждого перепрограммирования фактора подготовить 300 мкл комнатной температуры (RT) DMEM в стерильную пробирку полистирола и тщательно 27 мкл Реагента коммерческих transfection.
Примечание: Трансфекции реагент должны быть доведены до RT перед использованием и должны быть добавлены непосредственно в среду, как электростатические свойства соединения можно сделать его придерживаться стенку пластиковой трубки. - Добавить смесь плазмида в трансфекции реагент содержащих трубу, вихревой кратко и инкубировать трансфекции реагент ДНК смесь 15 мин на RT. кратко вихревой смесь и добавить его каплям ретровирусной упаковка клетки так, что Трансфекция Реагент ДНК смесь равномерно распределяется по культуре и инкубировать и при 37 ° C на ночь.
- 24 ч после трансфекции, изменить среде DMEM с 20% FBS и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина. 48 ч после трансфекции, собирать супернатант и процеживают через фильтр шприц размер пор 0,22 мкм.
Примечание: Вирусный supernatants могут быть заморожены до-80 ° C и держали до тех пор, пока требуется, хотя трансдукции является более эффективным, если используется свежих вирусных супернатант.
3. GTLM трансдукция и iEP урожай
- Семян, хвост отзыв фибробластов в 1 × 104 клетки/см2 на 0.1% желатина предварительно покрытием Посуда в среде ФЕКС и инкубировать при 37 ° C в течение 24 ч.
- Следующий день трансдукции смесь готовят следующим образом.
- Добавьте 1 объем вирусных супернатант для каждого перепрограммирования фактора, дополнена 4 мкг/мл реагента ретровирусной инфекции (40%) 6 томов ФЕКС среды (60%).
- Для 10 см блюдо фибробластов, добавляют 1 мл каждого вирусный супернатант (4 × вирусов = 4 мл) дополнены 4 мкг/мл реагента ретровирусной инфекции до 6 мл среды ФЕКС, давая в общей сложности 10 мл смеси трансдукции.
- Аспирационная ФЕКС среднего от культуры фибробластов и заменить его смесью трансдукции. Инкубируйте трансдукции за 4 ч при 37 ° C в гипоксических условиях (5% CO2 и 4% O2).
- Аспирационная трансдукции смесь и заменить его на свежий перепрограммирования среднего (Serum-free расширение среднего (SFEM), 100 U/mLPenicillin/стрептомицина, 100 нг/мл мышиных стволовых клеток фактора (mSCF), 10 нг/мл мышиных интерлейкина-3 (уровня IL3), 2 человеческого рекомбинантного ед/мл Эритропоэтин (hrEPO) и 100 Нм дексаметазон).
- Инкубируйте 8 daysat 37 ° C в гипоксических условиях, добавляя свежий перепрограммирования среднего каждые 2 дня. После пяти до восьми дней успешного перепрограммирования даст кластеры клеток, которые отсоединены от пластины.
- Чтобы собрать перепрограммировать клетки для анализа, мягко вверх и вниз Пипетка собирать их непосредственно из блюдо. Урожай untransduced фибробласты для сравнения, отделить клетки от пластины с помощью 1 x трипсина ЭДТА и собирать.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы представляем воспроизводимый протокол для производства ПРП от взрослых фибробластов, с помощью транскрипции фактор driven DLR. Мы оцениваем перепрограммирования клетки, с помощью проточной цитометрии, образуя колонии анализов и гена анализ выражения. Чтобы помочь в визуализации преобразования эритроидных клеток судьбы, мы провели перепрограммирования на фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные (Epor- Cre R26- eYFP) который Экспресс желтый флуоресцентны...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сверхэкспрессия коктейль четырех фактор, GATA1, TAL1, LMO2 и c-MYC (GTLM), достаточно для того перепрограммировать мышиных и человека фибробластов непосредственно к ПРП10. Перепрограммировать эритроидных клеток сильно напоминал bona fide эритроидные предшественники плане морфологии, фенотип, экспрессии генов и колонии формирование способности. Этот вывод подтверждают обоснование исполь...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы имеют без коллизии интересов в отчет.
Благодарности
Мы благодарим Эвелин Ван и Грегори Хайд (Институт Уайтхед, Кембридж, Массачусетс) для клонирования и Харви Lodish (Уайтхед институт) за предоставление многих плазмид, используется для генерации ретровирусной библиотеки. Мы благодарим Кавитха Шивы и Sofie Singbrant (Кафедра молекулярной медицины и генной терапии, Лундский университет), Гёран Карлссон и Shamit Soneji (Отдел молекулярной гематологии, Лундский университет) за их роль в описании iEP производства. Мы также хотели бы выразить признательность и поблагодарить Julian Пулесьо (Центр восстановительной медицины, Барселона биомедицинская научно-исследовательский парк), Виолета района-Эстрада (Рокфеллеровский университет, Нью-Йорк), Карл Walkley (Сент-Винсент институт медицинских исследований и Кафедра медицины, Сент-Винсент больницы, Университет Мельбурна), Анхель рая (каталонский Институт передовых исследований, Барселона) и Vijay G. Sankaran (широкой институт Массачусетского института технологии и Гарвардского университета, Кембридж ) для их предыдущий вклад в эту работу. Эта работа была поддержана Рагнар Söderberg фонда (J.F.); Шведские исследования Совета (к J.F.); Стифтельсен Олле Engkvist Byggmästare (к J.F.); Шведский фонд стратегических исследований (к J.F.); Åke Wiberg фонд (к J.F.); Мари Кюри интеграции Грант (J.F.).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM без пирувата натрия | GE Life Sciences | SH30022.01 | Питательные среды для клеток PhGP |
| DMEM с пируватом натрия | GE Life Sciences | SH30243.01 | Питательные среды для фибробластов хвостового кончика |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Перепрограммирующие среды |
| Фетальная бычья сыворотка HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Фактор роста |
| Пенициллин/стрептомицин HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Антибиоотические |
| заменимые аминокислоты (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | SNL Medium содержит этот |
| трипсин HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Агент для диссоциации клеток |
| Фактор стволовых клеток мыши (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Добавлен в среду для перепрограммирования |
| Рекомбинантный мышиный Il-3 | Peprotech | 213-13 | Добавлен в среду для перепрограммирования |
| человеческий рекомбинантный эритропоэтин (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Добавлен в среду для перепрограммирования |
| Дексаметазон | Сигма | 50-02-2 | Добавлено в перепрограммирование носителей |
| Желатин из свиной кожи | Sigma | 9000-70-8 | Растворяется в dH2O и используется для покрытия пластин. Перед применением убедитесь в стерильности. |
| Бластицидин S гидрохлорид | Сигма | 3/9/3513 | Селекционный антибиотик. Воздействует как на про-, так и на эукариотические клетки |
| Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Используется для промывки этапов |
| Polybrene | Merck | TR-1003-G | Инфекция / Трансфекция Реагент |
| FuGENE HD Реагент для трансфекции | Promega | E2311 | Реагент для трансфекции для клеточной линии |
| PhGP Millex-GP Шприцевой фильтр 0.22 &; m | Merck | SLGP033RS | Используется для фильтрации супернатанта |
| вирусов BD Emerald Hypodermic Syringe | Becton Dickinson | Артикул: 307736 | Используется для фильтрации супернатанта вирусов |
| 100 мм Culture Dish | Corning | 430167 | Клеточная культура |
| 6-луночная пластина | Falcon | 10799541 | Клеточная культура |
| Jeweler Щипцы #5 | Sklar | 66-7642 | Используется для обработка мелких фрагментов хвоста |
| Sklarlite Iris Scissors | Sklar 23-1149 | Используется для разрезания хвоста на мелкие кусочки | |
| Lineage Cell Depletion Kit, мышь | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Для истощения гемопоэтических клеток в культурах фибробластов |
| CD117 MicroBeads, мышь | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | Для истощения гемопоэтических клеток в культурах |
| фибробластовКлетки PheonixGP | ATCC | CRL-3215 | ретровирусная упаковка клеточной линии |
| EcoPAC vector (pCL-Eco) | Novus Biologicals | NBP2-29540 | ретровирусный хелперный вектор, содержащий гены gag и pol |
| pMX-Gata1 | Клонирован в лаборатории | ||
| pMX-Tal1 | Клонирован в лаборатории | ||
| pMX-Lmo2 | Клонирован в лаборатории | ||
| pMX-cMyc | Клонирован в лаборатории | ||
| программное обеспечение CellSens Standard 1.6 | Программное обеспечение для анализа цитоспинов |
Ссылки
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
- Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
- Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
- Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
- Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
- Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
- Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
- Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
- Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83(2016).
- Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
- Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890(2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
