Методическая статья

В Vitro модель параллельно плита перфузии системы для изучения бактериальных приверженность графт тканей

DOI:

10.3791/58476

⸱

7 января 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем доме разработан в vitro потока камеры модель, которая позволяет исследование бактериальных приверженность графт тканей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для замены клапана тракта (Антиангинальную) правого желудочка отток в больных с врожденным пороком сердца используются различные клапанами трубопроводы и клапаны смонтированы стента. При использовании протезов материалов, однако, эти трансплантаты восприимчивы к бактериальной инфекции и различных принимающих ответы.

Идентификация бактериальных и принимающих факторов, которые играют жизненно важную роль в эндоваскулярной прилипание микроорганизмов имеет значение лучше понимать патофизиологию начала инфекций, таких как инфекционный эндокардит (IE) и развивать превентивные стратегии. Таким образом необходима разработка моделей компетентным расследовать бактериальной адгезии в условиях физиологического сдвига. Здесь мы описывают использование недавно разработан в vitro перфузии камеры на основе параллельных пластин что позволяет исследование бактериальных присоединения к различным компонентам лоскута ткани, такие как открытые внеклеточного матрикса, эндотелиальных клеток и инертных районы . Этот метод в сочетании с колонии формирование подразделения (CFU) подсчет является достаточным для оценки склонности трансплантата материалов к бактериальной адгезии под поток. Далее, камерная система потока может использоваться для изучения роли компонентов крови в бактериальной адгезии условиях сдвига. Мы продемонстрировали, что источник ткани, их поверхности морфологии и бактериальных видов специфика не основных определяющих факторов в бактериальных приверженность графт тканей с помощью наших собственных разработан в vitro перфузии модели.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Золотистый стафилококк (S. aureus) использует различные стратегии вирулентности обойти системе хозяина иммунной обороны колонизации биологических и небиологических поверхностей, имплантированные в человека циркуляции, что приводит к тяжелой внутрисосудистого инфекций, таких как сепсис и IE1,2,3,4,5. IE остается важным лечение связанных осложнением у больных после имплантации протезов сердечных клапанов при отдельных факторов, способствующих начала IEare не еще полностью понятны6,7. Условиях потока бактерии сталкиваются сдвига, которые им необходимо преодолеть для того, чтобы придерживаться судна стены8. Модели, которые позволяют изучать взаимосвязь между бактерий и протезирование клапана тканей или эндотелием под поток, представляют интерес, поскольку они отражают в естественных условиях ситуация больше.

Несколько конкретных механизмов содействия бактериальных присоединение к эндотелиальных клеток (ECs) и подвергаются subendothelial матрица (ECM), ведущих к ткани колонизации и созревания растительностями, будучи важным первые шаги в IE9. Различные стафилококковых поверхности белки или MSCRAMMs (микробной поверхности компонентов, признавая молекул клея матрица) были описаны как посредники адгезии клеток хозяина и ECM белков, взаимодействуя с молекул, таких как фибронектин, фибриноген, коллаген и Виллебранда фактор (VWF)8,10,11. Однако учитывая складывающиеся внутри молекулярная некоторых факторов вирулентности, главным образом изучены в статических условиях, многие из этих взаимодействий могут иметь различные отношение в эндоваскулярной инфекции в циркулирующей крови.

Таким образом мы представляем доме разработан в vitro параллель плита потока камеры модель, которая позволяет оценивать бактериальной приверженность различных компонентов в контексте Tканевые трансплантаты, имплантированные в положении Антиангинальную ECM и ECs. Общая цель метода, описанного в этой работе является изучение механизмов взаимодействия между бактериями и базовой эндоваскулярных тканей в условиях потока, которые тесно связаны с в естественных условиях окружающей среды кровоток патогенов, таких как S. aureus. Этот новаторский подход фокусируется на восприимчивость трансплантат ткани поверхности бактериальной присоединения для выявления потенциальных факторов риска для развития IE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка лоскута тканей In Vitro исследования

Примечание: Три типа тканей были использованы: патч бычьего перикарда (BP), замораживают Homograft (CH) и говядину яремной графтов (BJV). В случае BJV каналом и CH (ткани Европейского банка по Homograft (EHB) обрабатываются и хранятся в жидком азоте до использования) были использованы как стены, так и клапанной листовки. BP патч и BJV каналом были приобретены от производителей. Перед использованием оттепель CH после инструкции EHB12.

  1. Промойте все ткани с 0,9% NaCl до использования.
  2. Подготовьте биопсия тканей с помощью биопсии кожи одноразовые удар сократить круговая ткани штук (10 мм в диаметре).
  3. Вырежьте все патчи ткани на одинаковой высоте, используя одноразовые стерильные скальпели.
  4. Для тканей с глутаровый (например , каналом BJV) Инкубируйте трансплантата штук на ночь при 4 ° C с 200 г/Л человеческого альбумина для нейтрализации фиксатором.
  5. Промывают остатки глютаральдегид с 0,9% NaCl в микротитровальных плиту.  Повторите 3 раза за 1 минуту.

2. Подготовка бактерий для перфузии экспериментов

Примечание: Три бактериальных изолятов были использованы: S. aureus Коуэн (ATCC 12598), S. epidermidis ATCC 149900 и S. sanguinis НКТЦ 7864. S. aureus и S. epidermidis были выращены при 37 ° C в tryptic соевый бульон (TSB) и S. sanguinis был выращен при 37 ° C с 5% CO2 в мозг сердца вливания бульона (BHI).

  1. Подготовьте ночь культуры бактерий на твердых крови агар тарелку.
    1. Используйте стерильные цикл соскрести замороженных бактерий и прививать на тарелку крови агар Мюллер Хинтон ночь культуры при 37 ° C.
  2. Использовать стерильные прививка цикл подобрать единую колонию от ночи культуры крови агар и инокуляции в 10 мл TSB или BHI в 14 мл трубки и культуре на ночь при 37 ° C.
  3. Центрифуга ночь культур (3000 x g, 4 ° C, 10 мин) и Ресуспензируйте гранулы в 10 мл-фосфатный буфер (PBS). Место 14 мл пробирок на льду.
  4. Подготовить Алиготе 3,7 мг/мл раствора 5 (6) - карбоксильную - флуоресцеин N-гидрокси succinimidyl эфира (CF) в этаноле и хранить при температуре от-20 ° C. Далее разбавляют фондовой CF до 150 мкг/мл, используя «сверхчистого» воды.
    Примечание: Защитить трубы от света с помощью алюминиевой фольги и хранить при температуре от-20 ° C.
  5. Центрифуга для бактерий (3000 x g, 4 ° C, 10 мин) и Ресуспензируйте гранулы в 800 мкл PBS и 200 мкл раствора CF 150 мкг/мл (конечная концентрация 30 мкг/мл, для перфузии экспериментов). Защитить трубы от света с алюминиевой фольгой и Инкубируйте 30 мин, с использованием орбитальный шейкер.
  6. После маркировки, блок с 2% раствора бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS и вращаться (3000 x g, 4 ° C, 10 мин). Выполните с помощью центрифугирования (3000 x g, 4 ° C, 10 мин) 10 мл PBS и Пелле бактерий мыть шагом.
  7. Разбавьте бактерий с PBS для получения 10 единиц, образуя колонии 7/мл (CFU) (проверено путем подсчета на плитах агара крови Мюллер Хинтон кое), что соответствует ОД600 (оптическая плотность) 0,65. Держите трубы в темноте на льду до перфузии экспериментов.
    Примечание. Имейте в виду, что измерения600 ОД отражает приблизительное количество бактерий. Чтобы подсчитать эффективной вакцинации дозы, метод последовательного растворения является необходимые дополнительный шаг для проверки ОД на основе чисел, как описано в разделе 3.8.

3. в vitro перфузии эксперименты с использованием потока палата параллель-плита

  1. Смонтируйте биопсия тканей 10 мм в диаметре и такой же толщины (подготовлен в шагах 1.1-1.5) в систему камеры потока с внутренней поверхностью вверх, чтобы войти в контакт с бактериальной подвеска.
    Примечание: Такой же толщины ткани через различные графтов гарантирует, что такой же высоты ткани достигается в канале, позволяя ламинарного потока в любых условиях. Все элементы потока камеры представлены и описаны в рисунке 1.
    1. Чтобы начать протокол, место кусок раунда ткани между микроскопа с круговой перфорации 8 мм и резиновой прокладкой.
      Примечание: Микроскопа обладает ультра-тонкий нижней фильм, чтобы позволить поколение отверстия 8 мм. Вместе с резиновый лист он фиксирует ткани для включения прямого контакта между образца и течет средних, а также предотвращает дислокации биопсии во время эксперимента. Поверхности исследуемых тканей, которая подвергается воздействию потока (меньшего диаметра) не может быть манипулирован щипцы.
    2. Вставьте держатель с ткани в прокладка листа, которая встроена в металлический каркас нижней палаты.
    3. Прикрепите верхнюю металлический каркас с соответствующего листа прокладку на нижней части камеры с держателем ранее вставленных ткани. Впоследствии смонтировать всю камеру с восьми винты и гайки. Убедитесь, что высота камеры является всегда то же самое через графтов.
      Примечание: Высота камеры должен всегда определяться после затяжки винтов. Используйте суппорт или правитель.
  2. Подключите камеру потока с перистальтического насоса и резервуара с трубками.
  3. Perfuse ткани с подвески 107 кое/мл (Проверено CFU подсчета и ОД600 измерения)-дневно обозначенных бактерий в PBS с касательное напряжение 3 Дин/см2 (Дина на единицу давления квадратный сантиметр) средства перистальтического насоса (расход 4 мл/мин) за 1 ч, с использованием 400 мл бактериальных водохранилище (внутренний дизайн, рис. 1) выдержаны при 37 ° C, с помощью пластины термостат (Таблица материалов).
  4. Непрерывно рециркуляции бактериальных подвеска 100 мл, используя же накопительного резервуара.
  5. После перфузии Демонтируйте палата освободить трансплантата и мыть кусок ткани два раза с 4 мл PBS в 12-ну пластине с помощью лабораторных орбитальный шейкер 3 мин. Впоследствии вырежьте внутреннюю часть лоскута с помощью биопсии кожи удар меньшего диаметра.
  6. Место каждого биопсия тканей в отдельном 14 мл, содержащие 1 мл стерильного 0,9% NaCl. Этикетке трубки как #1.
  7. Отсоединить бактерии из ткани, с помощью sonication ванна для 10 мин (амплитуда = 100% и частота = 45 кГц).
    Примечание: Полный отряд бактерий из ткани, что трансплантаты должны оцениваться по инкубации патчей на ночь при 37 ° C в жидкой среде TSB следуют ОД600 измерений по сравнению с управления патчи, лечение бесплатно раствором бактерий.
  8. Используйте метод последовательного разрежения на плитах агара крови Мюллер Хинтон рассчитывать CFUs.
    1. Подготовка единого 14 мл тюбик 10 мл стерильного физиологического раствора сделать серийных разведений бактериальных подвески, полученные после sonication. Ярлык этой трубки #2.
      Примечание: Для каждой ткани эксперимент одной трубы с 10 мл 0,9% NaCl является необходимым.
    2. Подготовить три 14 мл пробирки с 10 мл стерильного 0,9% NaCl для серийных разведений первоначальных бактериальных подвески из шага 2.7. Метки трубы следующим #3, #4, #5.
      Примечание: Этот шаг необходим знать реальный номер кое в бактериальных подвеска для эксперимента перфузии.
    3. Вихревой mix каждую пробирку для 15 s. Vortex трубы с биопсия тканей, а также первоначальный бактериальных подвеска сделать серийных разведений.
    4. Подготовьте три плиты агара, два для эксперимента ткани (перфузии бактерий и контроль перфузии PBS) и третье для первоначального бактериальных подвеска, используемые для орошений.
    5. Ярлык три сектора на пластину для эксперимента ткани в следующим образом 10-1, 10-3 и 10-4. Чтобы подсчитать количество CFUs в бактериальных перфузатов, ярлык пластину следующим: 10-1, 10-3, 10-5 и 10-7.
      Примечание: Все указания на агаре пластин например 10-1, 10-3 и так далее ссылаются на окончательное количество КОЕ/мл, рассчитанной на следующий день. Пластина управления не требует каких-либо секторов. Перед использованием плиты агара крови должны быть под ламинарных капюшоном и открыт для удаления избыточной влаги.
    6. Продолжать подготовку серийных разведений, передать трубку #2 100 мкл трубки #1 и энергично перемешивают с вихревой.
    7. Распространение 100 мкл содержимое тюбика #1 и #2 на соответствующие секторы 10-1 и 10-3 плиты агара. Кроме того распространение 10 мкл трубки #2 на сектор 10-4, повторите этот шаг 4 раза получить 4 отдельных наросты от каждого тома 10 мкл.
      Примечание: Из-за малого объема используется для обшивки на сектор 10-4, рекомендуется иметь несколько количество капель сделать среднее количество выросли CFUs.
    8. Подготовить серийных разведений первоначальной культуры, передать трубки #3 100 мкл бактериальной подвеска из шага 2.7 и энергично перемешивают с вихревой. Добавить 100 мкл трубки #3 трубки #4 и хорошо перемешать, повторите процедуру для последующих трубки #5.
    9. Распространение 100 мкл содержимое трубки #3, #4, #5 и скорректированные бактериальных подвеска (шаг 2.7), соответственно, на секторы 10-3, 10-5, 10-7 и 10-1 агар крови пластины.
    10. Оставьте плиты агара крови в ламинарном вытяжки воздуха сухой бактериальных распространяется, как правило, за 10 минут. После этого поместите пластины при 37 ° C для ночи инкубации.
    11. После ночи инкубации граф бактериальных колоний, чтобы получить количество CFUs результате адгезии биопсия тканей, а также CFUs/мл в начальный бактериальных подвеска для перфузии. Экспресс результаты как CFU/см2.

4. флуоресцентной микроскопии придерживался бактерий, чтобы прививка тканей после перфузии

  1. После перфузии, промыть куски ткани с PBS (см. шаг 3.5) и отрезать внутреннюю часть лоскута с помощью штампа меньшего диаметра.
  2. Подготовка 6-ну тарелку и место капельки монтажа средних (Таблица материалов).
  3. Поместите каждый кусок ткани с его перфузии поверхностью вниз на одной капли среднего монтажа.
  4. Читайте тарелку с использованием сканера флуоресцирования (Таблица материалов). Задать параметры волн возбуждения и выбросов согласно Флюорофор, используется для маркировки бактериальных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы лучше понять механизмы за IE развития, эта модель позволяет оценки бактериальных и ткани, связанные факторы представляют в ситуации в естественных условиях наступления инфекции.

В деталях, Роман в vitro подход позволяет дать количественную оценку бактериальной адгезии в условиях потока в разных лоскута ткани, perfusing дневно обозначенные бактерий через ткани, оказывают касательные напряжения в ф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Последние клинические наблюдения дают специальные осведомленности для IE как осложнение у пациентов, прошедших Замена клапана Антиангинальную6,13. Дисфункция имплантирован клапан в IE является результатом бактериального взаимодействия с эндоваскулярных трансплантата, ведущих к обширных воспалительных и procoagulant реакции1,14. Модель представлена Роман в vitro позволил нам исследовать, если разл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было организовано предоставление исследовательский фонд ку Лёвен (OT/14/097) для RH. TRV был после защиты докторской сотрудник исследовательского фонда FWO - Фландрия (Бельгия; Предоставить номер - 12K0916N) и RH поддерживается клинических исследований фонда UZ Лёвен.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пластырь из перикарда крупного рогатого скота (АД), гибкий перигард Pericardiumsynovis Хирургические инновации, СШАPC-0404SN
Кондуиты яремной вены крупного рогатого скота (BJV)Контегра кондуит; Medtronic Inc, СШАM333105D001
CH криоконсервированный гомотрансплантатEuropean Homograft Bank (EHB)-
Acu-PunchAcuderm Inc, СШАP850 (8 мм); P1050 (10 мм)
человеческий альбуминflexbumin; Baxter, БельгияBE171464
LOT:16G12C
Триптический соевый бульон (TSB)Fluka, Steinheim, Германия22092-500G
Сердечный инфузионный бульон (BHI)Fluka53286-500G
Фосфатно-солевой буфер (PBS).Gibco14190-094
5(6)-Карбоксифлуоресцеин N-гидроксисукцинимид эфир (CF)Sigma-Aldrich, Германия21878-100MG-F
Перистальтический насос (МОДЕЛЬ ISM444B)Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Германия631942-2
Ультразвуковой очиститель ультразвуковой ванныVWR; VWR, Раднор, Пенсильвания142-6044230 В/50 -60 Гц 60 ВА; HF45kHz, 30 Вт
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen от ThermoFisherP36930
InCell Analyzer 2000 (флуоресцентный сканер)GE Healthcare Life Sciences, Питтсбург, Пенсильвания29027886
Arium Pro VF - сверхчистая вода - H2O MilliQMillipore87206462
микроскопические слайды - Камеры для культивирования тканей (1-лунка)Sarstedt94.6140.102
1-луночный на Lumox съемныйSarstedt94.6150.101
Нержавеющая сталь - хирургические лезвияSwann-Morton311
Tygon Силиконовая трубка, 1/8"ID x 1/4"ODCole-ParmerEW-95702-06Температурный диапазон: – от 80 до 200°; C
Стерилизация: с окисью этилена, гамма-облучением или автоклавом в течение 30 мин, давлением 15 фунтов на квадратный дюйм
PharMed BPT ТрубкаSaint-GobainAY242012автоклавирование 30 мин при 121°°; C
Tygon LMT-55 ТрубкаSaint Gobain Performance Plastics&торговля;
ТермостатBMG BIOMEDIZINTECHNIK300-0042230В, 90ВА, 50Гц
15312022

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Que, Y. A., Moreillon, P. Infective endocarditis. Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).
  2. Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
  3. Moreillon, P., Que, Y. A. Infective endocarditis. The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).
  4. Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
  5. Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
  6. Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
  7. Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
  8. Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
  9. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
  10. Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
  11. Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
  12. Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
  13. Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
  14. Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
  15. Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
  16. Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
  17. Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
  18. Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
  19. Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Staphylococcus aureus

Похожие статьи