Методическая статья

Новые методы для интраназального введения при ингаляционной анестезии для оценки доставки лекарств нос к мозг

DOI:

10.3791/58485

⸱

14 ноября 2018 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Nihon University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем два романа методы стабильных интраназального введения при ингаляционной анестезии с минимальной физической нагрузки для подопытных животных. Мы также описывают метод количественной оценки уровней распространения наркотиков в мозг через нос к мозг путь, используя radiolabeled [14C]-инулина как модель субстрат водорастворимый макромолекул.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы быть потенциальные пути для доставки нос к мозг терапевтических агентов, который обходит blood - brain барьер сообщалось интраназального введения. Однако были несколько сообщений, касающихся не только количественный анализ, но и условия оптимального управления и дозировки схемы для расследования нос к мозг доставки. Ограниченный прогресс в исследованиях по нос к мозг путь механизмы, с помощью грызунов представляет собой значительное препятствие с точки зрения разработки систем доставки нос к мозг для кандидата наркотиков.

Чтобы получить некоторый прогресс в этом отношении, мы разработали и оцениваются два новых методов стабильных интраназального введения при ингаляционной анестезии для подопытных животных. Мы также описывают метод для оценки уровней распространения наркотиков в мозг через нос к мозг пути, с помощью радио меченых [14C]-инулин (молекулярный вес: 5000) как модель субстрат водорастворимый макромолекул.

Первоначально мы разработали на основе пипеткой интраназального введения протокол с использованием временно неповрежденный масок, которые позволяют нам выполнять надежный администрации животных стабильной анестезию. С помощью этой системы, [14C]-инулина может быть доставлено в мозг с маленькой экспериментальной ошибки.

Впоследствии мы разработали протокол интраназального введения, влекущие за собой обратный катетеризации со стороны дыхательных путей через пищевод, который был разработан, чтобы свести к минимуму последствия мукоцилиарный клиренс (MC). Эта техника привела к значительно более высокие уровни [14C]-инулин, который количественно был обнаружен в обонятельные луковицы, головного мозга и продолговатого мозга, чем метод пипеткой. Это, как представляется, быть потому что удержания раствора препарата в носовой полости был существенно увеличен администрацией активно, с помощью насоса шприца в направлении, противоположном направлению MC в полость носа.

В заключение можно ожидать, что два метода интраназального введения, разработанных в этом исследовании будет чрезвычайно полезным методы оценки фармакокинетики грызунов. Метод обратного катетеризации, в частности, может быть полезным для оценки в полной мере потенциал нос к мозг доставки наркотиков кандидатов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomedicines пептиды, олигонуклеотиды и антитела считаются потенциальное применение как роман терапевтических агентов для расстройств огнеупорных центральной нервной системы, которые в настоящее время имеют не лечебной терапии. Однако потому что большинство biomedicines водорастворимый макромолекул, Доставка из крови в мозг через внутривенное или устные чрезвычайно затруднено из-за сопротивления гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

В последние годы чтобы быть потенциальные пути для доставки нос к мозг терапевтических агентов, избегает BBB1,2,3,,45сообщалось интраназального введения. Однако были сравнительно мало сообщений о количественного анализа нос к мозг путь доставки6. Кроме того, там были практически никаких сообщений об установленных администрацией оптимальные условия и дозирования схем, таких как объем, время, периоды времени и скорость, для расследования нос к мозг доставки. Вышеупомянутые недостатки можно объяснить следующими причинами: (i оптимальный метод интраназального введения для мышей еще не будет создан, и (ii) интраназального введения, дозирование, который обычно используется, обычно характеризуется изменением межличностных среди животных вследствие мукоцилиарный клиренс (MC), тем самым часто приводит к недооценкам фактической доставки нос к мозг потенциал конкретного препарата.

Ингаляционная анестезия с помощью изофлюрановая (начало: 4%, содержание: 2%) с ингаляцией маска для грызунов получил широкое применение, с целью сокращения или устранения боли, связанные с операции выполняются на экспериментальных животных. Использование масок делает его относительно простой для выполнения типичных медикаментов в подопытных животных при ингаляционной анестезии по маршрутам, подкожно, внутрибрюшинного и внутривенно. Однако в случае интраназального введения, маски необходимо временно удалить от животных для медикаментов. С содержанием менее 2% изофлюрановая, животные обычно пробудить быстро от ингаляционной анестезии. При большой объем администрации за дозу, это может привести к наркотиков решение поступать из носовой полости в пищевод, и поэтому один большой дозы может потребоваться быть разбита на несколько меньших дозах для интраназального введения малых животных. Как интраназального введения требует удаления маски для повторных администрации и достаточного времени для доставки устойчивого носовой полости, существует высокая вероятность того, что мышь будет пробудить от анестезии во время процедуры администрирования. Это делает его очень трудно выполнить интраназального введения под стабильное состояние анестезии и вероятно способствует наблюдаемых межличностных вариации нос к мозг доставки среди грызунов.

В этом исследовании мы разработали два новых методов стабильных интраназального введения при ингаляционной анестезии, устанавливающих минимальный физический стресс на подопытных животных. Для первого метода мы использовали временно неповрежденный маску, которая позволяет интраназального введения при ингаляционной анестезии. Открывающиеся часть маски включает силиконовыми колпачками, которые могут использоваться в соответствии с администрации сроках для содействия стабильной интраназального введения, с помощью пипетки. Для второго метода канюли хирургически был вставлен пройти из пищевода в полость носа, и шприцевый насос был затем прикрепляется к этому так, чтобы раствор препарата может быть непосредственно и надежно доставлено в полость носа при стабильным ингаляции обезболивание. Этот метод может увеличить поставки наркотиков в мозг через нос к мозг, потому что путем существенно минимизации последствий MC, можно было бы улучшить препарата retentively в носовой полости. Кроме того, мы описываем метод количественной оценки уровни распространения наркотиков (% для мозга вводят дозу/g) в головном мозге, с помощью радио меченых [14C]-инулин [молекулярный вес (МВт): 5000] как модель субстрат водорастворимые макромолекул.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это животное исследование (#AP17P004) была выполнена в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Нихон университет животное уход и использование Комитетом (Токио, Япония). Это исследование (#17-0001) был одобрен радиоизотопные центр школа фармакологии Университета Нихон.

1. животных, используемых для интраназального введения при ингаляционной анестезии

  1. Дом экспериментальной мышей в клетках из нержавеющей стали под свет/темно цикла 12-h (свет на 8:00 – 8:00 вечера), с контролируемой температурой на уровне 23 ° c ± 1° C, влажность 50% ± 10%, и ad libitum доступа к продовольствию и воде.
  2. До экспериментов анестезировать мышей через вдыхание 2% изофлюрановая, следующее посвящение в 4% концентрации. Подтвердите требуемый уровень анестезии, установив за исчезновение выравнивание поверхности.

2. Подготовка решения администрации

  1. Подготовить решение администрации [14C]-инулин (50 мкм, 0.5 мкКи/мл на мышь) путем разбавления в фосфат амортизированное saline и хранить при 4 ° C до использования.

3. интраназального администраций для мышей

  1. Микропипеткой метод с использованием временно неповрежденный вдыхании маски (Рисунок 1)
    Примечание: Этот метод является модификацией интраназального введения протокола с помощью микропипеткой, установленные Фрей и др. 3
    1. Исправьте мышей в лежачем положении на пробковой доске, лентой их конечностей при ингаляционной анестезии с 2% изофлюрановая (рис. 1A).
    2. Администрировать общий объем 25 мкл администрации решения для каждой мыши интервалы 30-s, через 1-2 мкл доз в качестве альтернативы в левой и правой ноздри в то время как мыши фиксируются при ингаляционной анестезии (рис. 1B и C).
    3. Примечание: Отходы анестезирующий газ продуваемых активных средствами (вытяжной капюшоном, кабинет-канальные биобезопасности, вакуум и т.д.) при открытии маски и пассивных средств (отходов анестезирующий газ канистра) при закрытии
  2. Обратный катетеризации m ethod со стороны дыхательных путей через пищевод (Рисунок 2)
    Примечание: Этот метод является модификацией интраназального поглощения протокола для крыс, учрежденной Хираи et al. 7
    1. Исправьте мышей в лежачем положении на пробковой доске, лентой их конечностей при ингаляционной анестезии с 2% изофлюрановая.
    2. Волосы на шее побрился и нацелен через Бетадин или хлоргексидином приложения, после чего сполосните алкоголя.
    3. Разоблачить трахеи и пищевода, развернув кожи ниже горла с щипцами после внесения небольшой разрез (1,5 см) с ножницами.
    4. Сделайте надрез (1 мм) в трахею, используя ножницы.
    5. Вставьте канюлю (внутренний диаметр: 0,58 мм, внешний диаметр: 0.965 мм) длиной 1,2 см и подключите противоположный конец канюли внутри вдыхании маски.
    6. Сделать надрез (1 мм) в пищевод, используя ножницы, Вставьте канюлю (внутренний диаметр: 0,28 мм, внешний диаметр: 0,61 мм) длиной 1,4 см к задней части носовой полости и перевязать его (рис. 2A и B).
      Примечание: Процедуры 3.2.2 для 3.2.4 проводились под стереоскопическим микроскопом на увеличение × 10.
    7. Прикрепить иглы (27 g × 1/2) в 1-мл шприц, заполнены с решением администрации и подключитесь к программируемым микро шприцевой насос.
    8. Подключение выше иглы канюля, вставленный в пищевод в 3.2.5 (рис. 2 c).
    9. Администрировать общий объем 25 мкл [14C]-раствор инулина с постоянной скоростью (5 мкл/мин) (рис. 2 c и 2D).

4. количественный эксперимент с использованием радио меченых водорастворимый макромолекул ([14C]-инулин)

  1. Обезглавить экспериментальной мышей под наркозом и открыть их черепа, используя ножницы и со стороны продолговатого мозга, при этом стараясь не повредить мозги.
  2. Экстракт тщательно весь мозг, черпая с помощью микро шпатель из черепной коробки.
  3. Место фильтровальной бумаги, смоченной физиологический раствор на чашку Петри, которая хранится на льду.
  4. Место мозги, извлеченный на смоченную фильтровальной бумаги.
  5. Вытереть кровь, придерживаясь поверхности головного мозга с ватным тампоном, смоченным с физиологическим раствором, чтобы по крайней мере устранить влияние [14C]-инулина в крови на поверхности мозга.
  6. Рассечь мозги быстро и разделить их на три части: обонятельные луковицы, головного мозга и продолговатого мозга (включая Понс).
  7. Поместите образцы мозга в Солюбилизатор ткани при 50 ° C за 1 ч.
  8. Добавьте 10 мкл ЖС коктейль образцов мозга.
  9. Передача 25 мкл Алиготе решения администрации, растворенных в сцинтилляционные коктейль сцинтилляционные флакон для определения радиоактивности прикладного решения.
  10. Измерить распады в минуту [14C] радиоактивность в образце мозга ([14C] Xмозга) и прикладное решение ([14C] Xв дозе) в жидких сцинтилляционный счетчик с соответствующей кроссовер коррекции для 3H и 14C.

5. анализ данных

  1. Вычислите наркотиков распределения уровней (%) вводят дозы (ID %) с помощью следующего уравнения:
    Мозг ⁄g % ID = ([14C] Xмозга/ [14C] Xв дозе) × 100,
    где Xмозга (dpm/g мозга) — это количество [14C] - инулин измеряется в ткани мозга и Xв дозе (dpm/25 мкл раствора) – концентрация [14C] - инулина в раствор для интраназального введения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 3 показывает [14C]-инулин уровни (ID % ⁄g мозга) в обонятельные луковицы (A), головной мозг (B) и продолговатого мозга (C) полученных с помощью двух типов интраназального введения, оценены в настоящем исследовании. Интраназального введения с помощью пипетки включен метод доставки [14C]-инулина в мозг, используя открывающиеся вдыхании маски (рис. 1). При ингаляционной анестезии количественные результа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ожидается, что нос к мозг доставки наркотиков имеют выраженный эффект на центральной нервной системы, потому что это путь представляет прямой транспорт маршрут обходит BBB. Дата8были зарегистрированы три различных пути нос к мозг. Во-первых, путь Обонятельный нерв, который проходит от обонятельной слизистой оболочки в слизистой носа до переднего мозга через Обонятельный нерв. Во-вторых, путь тройничного нерва, которая проходит от слизистую дыхательных путей в слизистой оболочки носа в ствол головн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было частично поддерживается частных исследований университета брендинг проекта от МПКСНТ; субсидий для научных Research (C) (17 K 08249 [к T.K. и т.с.]) из японского общества для поощрения науки (JSP); Грант для совместных исследований от Хамагути фонда для улучшения биохимии [чтобы т.с.] и Такэда научный фонд [т.к.]. Мы благодарим г-н Юя Nito и г-жа Акико Asami за их ценную техническую помощь в проведении экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ddY мышьJapan SLC, Inc.Мужчина, 4-6 недель, 20-30 г
ИзофлуранPfizerv002139
Установка ИзофлуранаSHINANO manufacturing CO. LTD.SN-487-OTAir, SN-489-4
Изофлурановая маскаSHINANO manufacturing CO. LTD.Для мелких грызунов маска
Изофлуран (открывающегося типа)SHINANO manufacturing CO. LTD.По специальным заказам
Бокс для анестезииSHINANO manufacturing CO. LTD.SN-487-85-02
Ножницы для экспериментов на животных-1NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.B-27H
Ножницы для экспериментов на животных-2NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.B-13H
Пинцет-1FINE SCIENCE TOOLS Inc.11272-30Dumont #7 Пинцет Dumoxel-2
NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.Канюля А-12-1
(ПЭ-50)Бектон, Дикинсон и компания.5069773Внутренний диаметр: 0,58 мм, Наружный диаметр: трубка канюли 0,965 мм
(SP-10)NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.KN-392Внутренний диаметр: 0,28 мм, Наружный диаметр: 0,61 мм
ШейверMARUKAN, LTD.DC-381
Стереоскопический микроскопOlympus CorporationSZ61
Игла 27G 1/2 в 13 ммTERUMO CORPORATIONNN-2738R
1 мл шприцTERUMO CORPORATIONSS-01T
Шприцевой насосNeuro scienceNE-1000
Целлюлозная мембранаToyo Roshi Kaisya, Ltd.
МикрошпательShimizu Akira Inc.91-0088
Микропипетка (0,5-10 мкл)Eppendorf AGZ368083
Чип для пипеткиEppendorf AG0030 000.811
ЛентаTimeMed Labeling System, Inc.T-534-RДля фиксации мышей
[14C]-ИнулинAmerican Radiolabeled Chemicals Inc.ARC0124A0,1 мКи/мл
этииWako Pure Chemical Industries, Ltd.054-00461
Счетчик жидкостного сцинтилляцииPerkin Elmer Life and Analytical Sciences, IncTri-Carb 4810TR
00011090

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakane, T., Yamashita, S., Yata, N., Sezaki, H. Transnasal delivery of 5-fluorouracil to the brain in the rat. Journal of Drug Targeting. 7 (3), 233-240 (1999).
  2. Illum, L. Transport of drugs from the nasal cavity to the central nervous system. European Journal of Pharmaceutical Science. 11 (1), 1-18 (2000).
  3. Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery bypasses the blood-brain barrier to target therapeutic agents to the central nervous system and treat neurodegenerative disease. BMC Neuroscience. 9 (Suppl 3), S5(2008).
  4. Chapman, C. D., et al. Intranasal treatment of central nervous system dysfunction in humans. Pharmaceutical Research. 30 (10), 2475-2484 (2012).
  5. Kanazawa, T. Development of non-invasive drug delivery system to the brain for brain diseases therapy. Yakugaku-Zasshi. 138 (4), 443-450 (2018).
  6. Kozlovskaya, L., Abou-Kaoud, M., Stepensky, D. Quantitative analysis of drug delivery to the brain via nasal route. Journal of Controlled Release. 189, 133-140 (2014).
  7. Hirai, S., Yashiki, T., Matsuzawa, T., Mima, H. Absorption of drugs from the nasal mucosa of rat. International Journal of Pharmaceutics. 7 (4), 317-325 (1981).
  8. Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advances in Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2011).
  9. Lalatsa, A., Schatzlein, A. G., Stepensky, D. Strategies to deliver peptide drugs to the brain. Molecular Pharmaceutics. 11 (4), 1081-1093 (2014).
  10. Kanazawa, T. Brain delivery of small interfering ribonucleic acid and drugs through intranasal administration with nano-sized polymer micelles. Medical Devices. 8, 57-64 (2015).
  11. Kanazawa, T., et al. Enhancement of nose-to-brain delivery of hydrophilic macromolecules with stearate- or polyethylene glycol-modified arginine-rich peptide. International Journal of Pharmacology. 530 (1-2), 195-200 (2017).
  12. Kamei, N., et al. Effect of an enhanced nose-to-brain delivery of insulin on mild and progressive memory loss in the senescence-accelerated mouse. Molecular Pharmaceutics. 14 (3), 916-927 (2017).
  13. Suzuki, T., Oshimi, M., Tomono, K., Hanano, M., Watanabe, J. Investigation of transport mechanism of pentazocine across the blood-brain barrier using the in situ rat brain perfusion technique. Journal of Pharmaceutical Science. 91 (11), 2346-2353 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи