Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разгадке ключевые игроки гуморального иммунитета: Расширенный и оптимизированный протокол лимфоцитов изоляции от патчи Пейера в мышиных

13.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58490

⸱

21 ноября 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании мы представляем Роман и эффективного протокола для изоляции лимфоциты от Пейера (PPs), которые могут быть впоследствии использованы в vivo и in vitro функциональных анализов, а также поток гранулярных исследования фолликулярной T вспомогательные и зародышевого центра B клетки.

Аннотация

В слизистой оболочке кишечника иммунные клетки представляют собой уникальный иммунологические сущности, которая способствует иммунной толерантности при одновременно присвоении иммунной обороны против патогенов. Хорошо известно, что Пейера (PPs) играют важную роль в слизистой иммунной сети хостинг нескольких эффекторных T и B клетки подмножеств. Некоторая часть этих клеток-эффекторов, фолликулярная Т-хелперов (ЦГЗ) и клетки B зародышевого центра (GC) профессиональную в регуляции гуморального иммунитета. Таким образом характеристика эти подмножества ячеек в PPs с точки зрения их дифференциации программы и функциональных свойств могут обеспечить важную информацию о слизистой иммунитета. С этой целью легко применимые, эффективной и воспроизводимый метод лимфоцитов изоляции от PPs будет ценным для исследователей. В этом исследовании мы стремились создать эффективный метод для изоляции лимфоцитов из PPs мыши с высоким клетки доходности. Наш подход показал, что первоначальный ткани, обработки, например использование пищеварительной реагентов и ткани агитации, а также ячейки окрашивание условий и выбор панелей антитела, имеют большое влияние на качество и личность изолированных лимфоцитов и на экспериментальные результаты.

Здесь мы описываем протокол позволяет исследователям эффективно изолировать популяций лимфоцитов из PPs, позволяя воспроизводимого потока цитометрии-оценки на основе подмножеств T и B cell, сосредоточиваясь в первую очередь на TFH и GC B подмножества ячеек.

Введение

Всего желудочно-кишечного тракта от начала до конца палубных с обширной сетью лимфоидной, содержащий иммунных клеток, больше чем любой другой орган человека и мыши1. Пейера в патчи (PPs) являются одним из основных компонентов кишечника отделения этой клеточных иммунных Организации, так называемые кишечнике связанных лимфоидной ткани (GALT)2,3. В PPs, тысячи миллионов антигенов, производный от пищевых материалов, синантропных микробиоту и патогенов будучи непрерывно, и при необходимости соответствующие иммунных реакций к ним смонтированные таким образом поддерживая кишечной иммунной гомеостаз. В этом смысле PPs может называться «миндалин кишечника». PPs состоят из основных суб отсеков: Субэпителиальная купол (SED), большие зоны B-клеток фолликула; эпителия вышележащих связанные фолликула (инженер) и межфолликулярных области (IFR) где T-клетки расположены4. Этот уникальный дробления PPs позволяет различных эффекторных клеток подмножеств сотрудничать, таким образом, наделяет туберкулина в кишечнике.

PPs не хватает афферентные лимфатические, и по этой причине, антигены, перевезены в PPs из тонкой кишки не проводятся через лимфатические сосуды в отличие от большинства других лимфоидных органов. Вместо этого специализированные эпителиальные клетки, расположенные в фей, так называемые M клеток, отвечают за передачу Люминал антигенов в PPs5. Впоследствии, перевозимых антигены подобрал дендритных клеток (DCs) и фагоциты, которые расположены в регионе Субэпителиальная купол (SED) под FAE6,7. Этот процесс сортировки антигена, DCs в PP важно инициировать адаптивного иммунного ответа8 и последующее поколение IgA, секреции клетки9.

Из-за антигенные бремя от синантропных флоры и пищевых материалов PPs хост эндогенно активированного эффекторных T и клетки B подмножества в большой обилия например TFH и IgA+ GC B клеток10, предложив, что PPs представляют сайт активной иммунной 11ответ. Обнаружение до 20-25% TFH клетки в течение всего CD4+ T Мобильный отсека и до 10 – 15%, GC B клетки в течение всего клетки B возможен в PPs, собранных от неиммунизированных молодых мышей C57BL/612. В отличие от других типов вспомогательные клетки T (т.е., Th1, Th2, Th17 клетки), TFH клетки показывают уникальные тропизм в клетки B фолликулы главным образом благодаря CXCR5 выражение, которое способствует TFH клеток самонаведения вдоль градиента CXCL1313. В зонах B клеток фолликула PPs TFH клетки вызывают рекомбинации переключатель класса IgA и соматические Гипермутационный в активированные клетки B, из которых высокоспецифичные IgA производства клеток дифференцировать14. Впоследствии эти антитела секретирующих плазматических клеток миграции propria пластинки (LP) и регулировать иммунного гомеостаза в кишечнике10.

Определение и характеристика TFH и GC B клеточных популяций в PPs может позволить исследователей для изучения динамики гуморального иммунного ответа в условиях устойчивого состояния без необходимости длительной иммунизации моделей традиционно используется в TFH-GC B клеток исследования15,16,17,18. Анализируя TFH клетки в PPs не так просто, как другие клетки подмножеств. Технические проблемы включают в себя выявление условий приготовления идеальной ткани, поверхности антитела маркер комбинация, а также выбрав соответствующие положительной и отрицательной контроля. TFH и PP поля исследования демонстрируют большое разнообразие с точки зрения экспериментальной процедуры и далеки от наделения консенсуса для установления стандартизованных протоколов по нескольким причинам. Во-первых каждого подмножества ячеек в пределах PPs, как правило, быть затронуты дифференциально условий приготовления тканей, требующих дальнейшего изменения подмножества конкретным образом клетки. Во-вторых существует значительное расхождение среди сообщаемых методов относительно деталей подготовка клетки от PPs. третьего, количество на основе протокола сравнительных исследований, изучения методов подготовки идеально тканей и экспериментальных условий для PP и ЦГВЗ исследования является довольно ограниченной.

Текущие исследования на основе протокола предложил для PP ячейки подготовка19,20,21,22 были не TFH - или GC клетки B ориентированный. Кроме того, были найдены некоторые условия подготовки ткани, рекомендуется для PPs19,20 , например на основе коллагеназы пищеварение негативно повлияли на результат идентификации TFH подачей cytometry18. Исходя из этого мы полагали, что оптимизированные, стандартизированных и воспроизводимые протокол, который может использоваться для изучения TFH и GC B динамика клеток в PPs будет ценным для следователей, работающих по этой теме. Эта потребность дал нам стимул для создания улучшение и современный протокол для изоляции и характеристика лимфоцитов PP, мелко оптимизированную для клеточного восстановления, жизнеспособности и эффективности для потока гранулярных характеристика несколько T и B подмножества ячеек. Мы также стремились исключить несколько трудоемкий подготовительных шагов, предложенных в предыдущих протоколах, таким образом, снижая необходимые манипуляции и времени для подготовки ткани и клетки от PPs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Руководящие принципы согласно институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Бет Израиля Deaconess медицинский центр были проведены все исследования и эксперименты, описанные в настоящем Протоколе.

1. проектирование экспериментальной установки и мыши групп

  1. (Необязательно) Совместное дом экспериментальной мышей для облегчения горизонтальной передачи кишка микробиоты между экспериментальной мышей и уменьшить неспецифической изменчивости в пределах PP лимфоцитов. Кроме того использование элементов управления помёте того же пола для минимизации изменчивости.

2. Хирургическое иссечение и ткани подготовительные шаги:

  1. Хирургическое удаление тонкой кишки (SI)
    1. Усыпить мышей с использованием CO2 удушья или любой эквивалентный метод, одобренный Комитетом по институциональной животных этики.
    2. Передача мыши на выделенной области для хирургического иссечения. Положите зад и дезинфицировать живота с 70% этиловом спирте. Выполните лапаротомия путем разрезания живота кожи и брюшины вдоль средней линии от лобка до грудной клетки, брюшной полости, открывая таким образом.
      Примечание: Выполните первый разрез на относительно небольшой участок кожи, чтобы избежать проникновения брюшной полости и повреждения кишечных тканей. Продолжать иссечение до желаемого анатомические границы.
    3. Определите caecum, который является идеальным вехой для обнаружения терминала подвздошной кишки, которая представляет собой Дистальный сегмент тонкой кишки.
      Примечание: Обычно Caecum расположен на нижней левой части живота мыши.
    4. Определить ileocaecal перекрестка и сделать надрез на этом уровне дистальных, как можно отделить от caecum тонкой кишки. На протяжении следующих шагов Избегайте чрезмерного физического контакта с кишечной стенки, потому что хрупкие PPs свернуть легко на ощупь.
    5. Аккуратно удалите весь кишечник до привратник путем разрезания брыжейке, используя ножницы. Идентифицировать стыке Пилора и двенадцатиперстной кишки, и СНиП двенадцатиперстную кишку на этом уровне, что приведет к полный отряд кишечник от брюшной полости.
      Примечание: (i) Избегайте гиперэкстензии как это может привести к разрыву кишечной стенки. (ii) если LP лимфоцитов изоляции помимо PP лимфоцитов, необходимо полное удаление верхней брыжеечной жира. Однако для изоляции PP только, оставаясь брыжеечных жира может предоставить некоторые преимущества во время дальнейших шагов изоляции; Таким образом она должна быть сохранена.
    6. Отдельностоящий тонкий кишечник в 6-ну пластины, наполненный холодной RPMI + 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и аккуратно агитировать ткани вручную до тех пор, пока все кишечные сегменты погружали в холодной средства массовой информации. Поддержания тканей на льду на протяжении последующих шагов.
    7. После рассечения желаемое количество мыши тонкий кишечник, перейдите к PP иссечение из собранных тонкий кишечник.
  2. Хирургическое иссечение PPs и подготовка одноклеточного подвеска:
    1. Аккуратно передачи в тонком кишечнике на бумажное полотенце, захвата верхней брыжеечной жира с помощью щипцов и место верхней брыжеечной стороной бумажным полотенцем. Смочите весь кишечный сегмент с холодной RPMI + 10% FBS, чтобы избежать обезвоживания тканей и липкость.
      Примечание: Оставшиеся брыжеечных жира может быть полезным на данном этапе потому, что сегменты жировой ткани на участке верхней брыжеечной SI будет прилипать к бумажным полотенцем, сохраняя анти брыжеечных сайта вверх.
    2. Определите PPs, которые появляются как белый мульти lobulated агрегатов в форме «цветной капусты как» на стороне анти брыжеечных кишечной стенки.
      Примечание: Промывка Люминал содержимого не рекомендуется до тех пор, пока все PPs обрезанию. Опорожнение Люминал содержание может привести к краху PPs и предотвратит цветового контраста между PPs и кишечной стенки, которая очень полезна для визуальной идентификации PPs.
    3. После выявления PPs на стороне анти брыжеечных, место хирургический изогнутый конец ножниц на PPs (кривая должна противостоять) запретительных PP от проксимальных и дистальных границы.
      Дополнительно: Push PP плавно спускающемся лезвия ножниц с помощью пальца. Этот маневр приведет к лучше исключение окружающие ткани-PP. Акцизный PPs мягко, исключая окружающие ткани кишечника.
      Примечание: (i) этот шаг имеет решающее значение для получения максимальной доходности PP клеток при сведении к минимуму загрязнение клетки из соседних кишечных отсеков как LP и кишечного эпителия, которые также богаты в Т-клеток. (ii) от одного SI иссечена от мыши C57BL/6 5-10 PPs (средний размер, мульти lobulated) могут быть собраны. С целью еще меньше PPs (не мульти lobulated), коллекция до 12-13 PPs на мышь (C57BL/6) можно, используя этот протокол.
    4. Передачи подакцизным PPs плиты культуры ткани 12-хорошо наполненный ледяной RPMI + 10% FBS и поддерживается на льду, с помощью щипцов или изогнутые ножницы хирургические.
      Примечание: (i) сразу же после иссечения PPs, слизи и кишечного содержимого на PP поверхности могут быть очищены, потерев ткани мягко на бумажное полотенце. Этот шаг поможет улучшить жизнеспособность лимфоцитов PP. (ii) вместо передачи PPs на тарелку, передачи отделены трубы могут также считаться в зависимости от числа общей выборки.
    5. Опционально: После завершения PP иссечение и последующего размещения в пластину хорошо, количество и размер PPs, собранных из различных экспериментальных/мыши групп может быть документально принимая картину пластину культуры ткани, содержащие PPs.
    6. Подготовить набор 50 мл конические трубы заполнены с 25 мл RPMI + 10% FBS (предварительно нагревают при 37 ° C). Использование ножницами, вырежьте края кончик 1000 мкл от расстояния, которое позволит стремление PPs с Пипетка 1 мл. Аспирационная PPs с 1 мл пипетки и передавать их от плиты культуры ткани 12-хорошо подготовленные 50 мл конические трубы.
      Примечание: Используйте новый наконечник для каждого образца мыши чтобы избежать перекрестного загрязнения среди образцов.
    7. Безопасный крышку и трубок вертикально в орбитальный шейкер при 37 ° C, с непрерывной агитации за 10 мин на 125 – 150 об/мин. Тем временем подготовить новый набор 50 мл трубки и место стрейнер клеток 40 мкм на вершине каждой трубе, через который будет подготавливаться одноклеточного подвеска.
      Примечание: (i агитация шаг удалит оставшиеся кишечных содержание, слизи и ячейки мусор, который уменьшить жизнеспособность клеток и восстановления PP лимфоцитов, если не удалены. (ii) не применяются любые виды пищеварительных ферментов на PP ткани, потому что процесс пищеварения приводит к драматической потере CXCR5 выражения из клеточной поверхности.
    8. После агитации передать PPs ситечко клеток 40 мкм, помещены на вершине свежеподготовленные конические 50 мл трубки. Используя закругленными сторону поршень шприца 10 мл, аккуратно сорвать PPs через сито ячейки, чтобы генерировать одну ячейку подвеска. Промойте ситечко с 15 – 20 мл холодного RPMI + 10% FBS.
      Примечание: (i) до фильтрации, встряхните пробирки, содержащие PPs горизонтально. Этот короткий трясти будет способствовать передаче PPs в ячейки сита. (ii) с помощью стрейнер ячейки 70 мкм для изоляции не лимфоидные клетки иммунной системы (например., моноциты, макрофаги, DCs) рекомендуется.
    9. Центрифуга для одной ячейки суспензий на 350 – 400 x g 10 мин при 4 ° C.
    10. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в концентрации 10 х 106 клеток/мл. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
      Примечание: (i) до подсчета клеток, общий мобильный номер для каждой мыши PP группы можно приблизительно оценить по следующей формуле: «0.5-1 х 106 клеток x (количество PPs) = Общая клеток». Могут потребоваться дальнейшие разведений с Трипановый синий для подсчета клеток. (ii) в качестве альтернативы ручной подсчет может использоваться автоматизированные ячейки счетчики.
    11. 2-2,5 х 106 клеток в соответствующий объем передачи (например., 200 мкл) в 96-луночных раунд-днище.
      Примечание: Для одного цвета и отрицательных контрольных образцов, 0.5-1 х 106 клеток может быть достаточно.
    12. Центрифуга пластину на 350 g x 5 мин при 4 ° C. Проведите пластины.
    13. Вымойте клетки в 200 мкл буфера пятнать.

3. поверхности антитело пятная

  1. Жизнеспособность окрашивание:
    1. После окончательной стирки Ресуспензируйте клетки в 100 мкл поправимо жизнеспособности краски разводят в PBS (1:1, 000). Инкубируйте 30 мин на льду или на 4 ° C в темноте.
      Примечание: (i) внутриклеточных окрашивания для выявления ключевых транскрипции такие факторы, как Foxp3 или Bcl-6 требует фиксации клеток. В этом случае не поправимо жизнеспособности красители (например., 7-AAD, DAPI) не может использоваться. (ii) для разбавления поправимо жизнеспособности красителя, не использовать любой окрашивание буфер, который содержит белок. Средства массовой информации, используемые в этом этапе должна быть белка бесплатно. (iii) исключения омертвевших клеток с помощью окрашивания жизнеспособности важно, потому что мертвые клетки могут вызвать серьезные технические трудности в анализе потоков цитометрии, испуская аутофлюоресценция и связывая поверхности антител nonspecifically, которые могли бы привести к ложь положительные результаты.
    2. Вымойте клетки дважды с пятнать буфера. Центрифуга на 350 x g 5 мин при 4 ° C. Проведите пластины.
  2. Блок ФК и поверхности - слоя I:
    1. Приготовляют раствор Fc блока путем разбавления антитела анти CD16/32 (1: 200) в пятнать буфера.
    2. Ресуспензируйте клетки в 20 мкл приготовленный раствор Fc блок. Инкубируйте 15 мин на льду.
    3. Без стирки, добавьте 80 мкл поверхностных антител коктейль (см. таблицу 1 на суммарные антитела) подготовлен на соответствующих разведений. Инкубируйте на льду, по крайней мере 30 минут.
    4. Мыть дважды добавляя чрезмерное окрашивание буфера. Центрифуга на 350 x g 5 мин при 4 ° C. Проведите пластины.
  3. Поверхности - слой II:
    1. Подготовьте окрашивание решения стрептавидина путем разбавления конъюгированных флюрохром стрептавидина окрашивание буфера.
    2. После окончательной стирки Ресуспензируйте клетки с 100 мкл предварительно разбавленного стрептавидина (1: 100), окрашивание раствора. Инкубируйте по крайней мере 15 минут на льду в темноте.
    3. Дважды промыть пятнать буфера. Центрифуга на 350 x g 5 мин при 4° C. Проведите пластины.
      Необязательно: Если внутриклеточного пятная для обнаружения фолликулярной регулирования Т-клеток не желателен, после последнего мыть, Ресуспензируйте клетки в 200 мкл окрашивания буфер и передачи в соответствующие трубы для получения данных в проточный цитометр. Когда образцы не являются фиксированными, приобретение данных подачей cytometry должно выполняться в течение 3-4 ч для получения точных результатов.

4. клетки фиксации

  1. Подготовьте фиксации/permeabilization (исправить/Пермь) рабочим раствором с помощью реагентов от Foxp3/транскрипция фактор пятнать буфера набора. Смешайте одну часть фиксации/permeabilization концентрат с тремя частями фиксации/permeabilization разбавителя для желаемого конечного объема.
  2. После окончательной стирки Ресуспензируйте клетки в 200 мкл рабочего раствора исправить/Пермь.
  3. Инкубируйте пластину на льду или на 4 ° C в течение 20 мин. Не превышать 20 минут для этого шага. Длиннее время инкубации может серьезно уменьшить восстановления клеток.
  4. Центрифуга на 350 x g 5 мин при 4 ° C. Проведите пластины. (Необязательно) После этого шага, фиксированные клетки могут храниться в течение нескольких дней на 4 ° C в буфере с бычьим сывороточным альбумином (БСА) пятнать или FBS до последующего приобретения внутриклеточных пятнать или потока цитометрии.
  5. Ресуспензируйте клетки в 200 мкл permeabilization буфера (x1) свежезаваренным предварительно разводят в очищенной деионизованной воде.
  6. Центрифуга на 350 g x 5 мин при комнатной температуре (RT).
  7. После промойте 200 мкл буфера permeabilization и центрифуги на 350 x g 5 мин на RT.

5. внутриклеточных пятнать

  1. Приготовляют раствор Fc блока путем разбавления антитела анти CD16/32 (1: 200) в буфер permeabilization.
    Примечание: После фиксации шага, клетки должны поддерживаться в буфер permeabilization до конца процесс внутриклеточного окрашивание.
  2. После окончательной стирки Ресуспензируйте клетки в 20 мкл раствора Fc блок. Инкубируйте на 10-15 мин на RT в темноте.
  3. Без стирки, добавьте 80 мкл внутриклеточных антитела коктейль (100 мкл окончательный объем) предварительно разводят в буфер permeabilization. Инкубируйте 30 мин на RT.
  4. Добавить 100 мкл буфера Пермь, и центрифуги на 350 g x 5 мин на RT.
  5. Один раз Помойте с 200 мкл буфера permeabilization, центрифуги на 350 x g 5 мин на RT.
  6. После окончательной стирки Ресуспензируйте клетки в 200 мкл окрашивания буфера и передавать клетки в соответствующие трубы (окончательный объем 400 мкл окрашивание буфера) и приобретать данные подачей cytometry. Образцы, окрашенных в 96-луночных пластины могут также работать без передачи в трубы, если проточный цитометр с пластины читателя параметр доступен. Этот шаг минимизирует потери клеток во время передачи клеток.
  7. Приобрести не менее 5 х 105 всего клеток на проточный цитометр, чтобы иметь возможность выполнить воспроизводимость анализа ЦГВЗ, ОКР, а также клетки GC B.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В отличие от предыдущих протокол20, мы наблюдали, что PPs не распределяются равномерно по всему Си, но локализованы более плотно к проксимальных и дистальных концов Си, как показано в Рисунок 1A. Потока гранулярных анализ показал, что, если правильно выполнены, наш протокол дает населения лимфоцитов PP, который демонстрирует вперед стороне разброс распределение похож на splenocytes (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем протокол, оптимизированный для потока характеристика гранулярных клеток TFH и GC B. Одним из основных преимуществ нашего протокола является, что он позволяет изоляции до 107 (в среднем 4-5 х 106 клеток) всего PP клеток из одной мыши (штамм C57BL/6) без каких-либо процесс пищеварения. Мы отметили, что доходность ячейке положительно коррелирует с числом PPs и может быть оценена из следующих простое уравнение, которое является полезным для планирования экспериментальных: «общее колич...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Отсутствие конфликта интересов объявил.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Лаура Штраус и Питер Sage за полезные обсуждения и поддержки с cytometry анализ потоков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
антимышиное антитело CD4eBioscience, Biolegend*17-0041-81 ,10054*Для подробной информации см. Таблицу 1
антитело против мыши CD19eBioscienceMA5-16536Для подробной информации см. Таблицу 1
антитело против мыши PD-1eBioscience61-9985-82Для подробной информации см. Таблицу 1
антитело против мыши ICOSeBioscience12-9942-82Для получения подробной информации см. Таблицу 1
антитело против мыши GL7Biolegend144610Для подробной информации см. Таблицу 1
антитело против мыши CXCR5Biolegend*, BD Bioscience145512*, 551960Для подробной информации см. Таблицу 1
антитело против мыши BCL-6 Biolegend358512Для подробной информации см. Таблицу 1
антитело против мыши Foxp3 АнтителоeBioscience17-5773-82Подробная информация см. в таблице 1
Streptavidin-BV421BD Bioscience563259Подробная информация в таблице 1
Изменяемая жизнеспособность красителяeBioscienceL34957Подробная информация в таблице 1
7AADBiolegend420404Подробная информация в таблице 1
FcBlock (CD16/32)BD Bioscience553141Для получения подробной информации см. Таблицу 1
Коллагеназа IIWorthingtonLS004176
Коллагеназа IVWorthingtonLS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00
6-луночные, 12-луночные и 96-луночные планшетыFalcon/Corning353046,353043/3596
50 мл конические пробиркиFalcon3520
40 & микро; m клеточный фильтрFalcon352340
10 мл шприц-поршеньExel INT26265
RPMICorning15-040-CV
PBSCorning21-040-CM
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Орбитальный шейкерVWRModel 200
изогнутым концом
Тонкие зубчатые щипцы
Маленькие изогнутые
Ножницы с ножницы

Ссылки

  1. van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  3. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  4. Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
  5. Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
  6. Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
  7. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
  8. Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
  9. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
  10. Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
  11. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  12. Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
  13. Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
  14. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  15. Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
  16. Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
  17. Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
  18. Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
  19. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114(2016).
  20. De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167(2013).
  21. Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282(2014).
  22. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225(2011).
  23. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  24. Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
  25. Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
  26. Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
  27. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
  28. Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
  29. Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
  30. Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
  31. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  32. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
  33. Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
  34. Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
  35. Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
  36. Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Проточная цитометрияТ-фолликулярные хелперы (TFH-клетки)B-клетки герминативного центраокрашивание клетокпанель антителпереваривание тканейжизнеспособность клетокэкспрессия CXCR5
Разгадке ключевые игроки гуморального иммунитета: Расширенный и оптимизированный протокол лимфоцитов изоляции от патчи Пейера в мышиных
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.