Методическая статья

Очищение сродства хлоропласта Translocon белковых комплексов с помощью тега крана

DOI:

10.3791/58532

⸱

1 ноября 2018 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Plant Physiology, University of Neuchatel, 2Institut fur Biochemie und Biotechnologie, Martin-Luther-Universitat Halle-Wittenberg

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем проверенных и протестированных протокол для очистки хлоропласта импорта комплексы протеина (TOC TIC комплекс) с помощью крана тега. Близость изоляции протокол одношаговый потенциально может быть применен к любой белок и использоваться для выявления новых взаимодействия партнеров по масс-спектрометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хлоропластов биогенеза требует импорта тысячи ядро кодировке белков в пластидно. Импорт этих белков зависит от translocon на внешние (TOC) и внутренней мембраны хлоропластов (TIC). Оглавление и TIC комплексы являются multimeric и вероятно содержат еще неизвестные компоненты. Одна из главных целей в области — наладить полная инвентаризация компонентов TOC и ТИЦ. Для изоляции TOC TIC комплексов и выявление новых компонентов preprotein рецептор, который был TOC159 изменение N-неизлечимо путем добавления тандем сродства очищения (TAP) тега привело кран-TOC159. TAP-тег предназначен для двух последовательных сродства очистки шагов (отсюда «тандем affinity»). TAP-тег, используемый в этих исследованиях состоит из N-терминальный IgG связывающий домен, получаемые от золотистого стафилококка белка (ProtA) после Кальмодулин привязки пептид (УТПО). Между этими двумя сродство теги, табак etch расщепления протеазы вируса (TEV) сайт был включен. Таким образом TEV протеазы может использоваться для нежный элюции после привязки к IgG бусы TOC159-содержащих комплексов. В протоколе, представленные здесь второй шаг Кальмодулин сродства очищения был опущен. Протокол очистки начинается с подготовки и солюбилизация всего клеточных мембран. После моющее средство лечение растворимых мембранных белков инкубируют с IgG Бусины для иммуноизоляции TAP-TOC159-содержащих комплексов. После привязки и обширные Стиральная содержащий комплексы TAP-TOC159 расщепляется и освобожден из бисера IgG, используя ТэВ протеазы, при котором удаляется S. aureus IgG связывающий домен. Западный blotting из изолированных TOC159-содержащих комплексов может использоваться подтвердить наличие известных или подозреваемых TOC и TIC белков. Что еще более важно TOC159-содержащих комплексы были использованы успешно для выявления новых компонентов TOC и TIC комплексов масс-спектрометрии. Протокол, который мы представляем потенциально позволяет эффективной изоляции любого белка мембраны прыгните комплекс для использования для идентификации неизвестных компонентов масс-спектрометрии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растения зависит хлоропластов для фотосинтеза и фотоавтотрофная роста1. Подавляющее большинство белков хлоропласта кодируются в ядре, синтезируется в цитозоле и импортированы в хлоропласте через TIC TOC комплексов в конверт мембраны2. Ядро TOC комплекс состоит из белка проведение канала Toc75 и двух рецепторов GTPases Toc33 и Toc1593,4,5. TOC159 необходим для биогенеза хлоропластов и опосредует массовое накопление связанных фотосинтеза белки6. ТИЦ комплекс состоит из TIC20 белка проведение канала, а также TIC110 и TIC40,78. Недавно транслокации белка 1MD, комплекс на внутренний конверт мембраны был изолирован и содержится ранее неизвестные компоненты9, один из которых был TIC56. Недавно мы совместно изолированных TIC56 1 MDa, комплекс, с помощью протокола очищение сродства ТКП-TOC159. Данные свидетельствуют о «канонического» TOC/TIC комплексов и 1 MDa комплекс10структурных перекрываются. Ранее неизвестных компонентов, таких как KOC1 были также определены новые взаимодействия партнеров TOC и TIC комплексов с использованием метода TAP описанным здесь10,11.

Таким образом TAP-тег очистки является эффективным методом для изоляции белковых комплексов и выявление взаимодействия партнеров по последующим масс-спектрометрических анализ12. Нажмите тег состоит из двух IgG привязки повторяется отделены от Кальмодулин привязки пептид (УТПО) табак etch сайт расщепления протеазы вируса (TEV). Оригинальный метод, состоящий из IgG сродства очищения шага следуют ТэВ расщепления и последующих Кальмодулин аффинной хроматографии разрешается родной очистки больших и очень чистого белка комплексы13,14 . Мы упростили процедуру и продемонстрировал, что комплексы TOC159-содержащих белков также могут быть очищены эффективно, используя только IgG сродства очищения шаг следуют ТэВ расщепления для элюции15. В нашем опыте бездействие Кальмодулин близость шаг привело к повышению урожайности и поэтому может быть целесообразным для низкого залегания белков.

Короче говоря, мы инженерии стабильной трансгенных A. thaliana линии, выражая TAP-TOC159 в ppi2 (toc159 KO мутант) фон и установил его в качестве надежного источника для очистки TOC TIC комплексов. Протокол для изоляции TOC TIC комплекса начинается с гомогенизации растительного материала в буфере моющее средство бесплатно. После центрифугирования отбрасывается супернатант. Гранулы, содержащие часть всего мембраны является солюбилизирован с помощью моющих средств содержащих буфера. После шага ультра центрифугирования супернатанта, содержащий растворимых комплексов TOC TIC применяется к IgG смолы для очищение сродства. После нескольких Стиральная шаги, элюирование осуществляется с использованием ТэВ протеаз содержащие буфер чтобы выборочно Рассекающий удар вниз по течению IgG связывания доменов и осторожно освободить родной TOC159-содержащих комплексов. TEV элюата могут быть проанализированы на Западный blotting или масс-спектрометрии для определения взаимодействия партнеров по TOC15910,11,15. Этот метод используется также для идентификации столб-поступательные изменения TOC15915. В будущем родной TOC159-содержащих комплексов может использоваться для структурных исследований с использованием cryoelectron микроскопии.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка Arabidopsis растений

  1. Подготовка 1 Л половину численность среднего включая витамины с 1% сахарозы, фотосинтетическую и Скуг (МС) и Отрегулируйте пэ-аш до 5,7 с гидроксидом калия (KOH). Добавить 0,8% phytoagar и автоклав для 20 минут при температуре 120 ° C.
  2. Налить 75 мл среды MS на пластину Петри (диаметр 14,5 см, высота 3 см) и позволяют затвердевания на 1 ч.
  3. Добавление отцентрифугировать 1,5 мл, 30 мг Arabidopsis thaliana семян и поверхности стерилизации с 70% (v/v) этанола, содержащие 0,05% (v/v) Тритон X-100 за 5 мин, следуют 100% (v/v) этанола за 10 мин удалить этанола.
  4. Передать семена стерильные фильтровальная бумага для сушки. Посыпать стерилизованные семена равномерно на MS пластину (каждого генотипа требует по крайней мере 8-10 пластины) и печать каждой пластины с хирургическая лента.
  5. Инкубируйте пластины на 4 ° C на два дня в темноте, чтобы синхронизировать прорастания семян. Трансфер в камере роста с следующих свет цикла: 8 h 120 мкмоль m−2 s−1 света и 16 h темных в 22-20 ° C.

2. подготовка HsIgG агарозы бусины

  1. Приостановить CNBr активированный агарозы бусины (4 g) в 100 мл 1 мм HCl и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
  2. Перевести агарозы бусины в спеченных стеклянных фильтр, мыть под вакуумом с 100 мл 100 мм HCl и повторять 2 - 3 раза.
    Примечание: Precool промывочный раствор до 4 ° C.
  3. Ресуспензируйте в агарозном бусины в 1 мл холодного 100 мм HCl и передачи 50 мл конические пластиковых пробирок. Промойте фильтр спеченные стекла с 3 мл 100 мм HCl и передать же трубки жидкости.
  4. Спина на 400 × g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант с пипеткой.
    Примечание: Не сцеживаться трубки.
  5. Ресуспензируйте бисер в 50 мл муфта буфера (Таблица 1); перемешать кратко и затем спина на 400 × g 5 мин при 4 ° C.
  6. Растворяют в 10 мл буфера муфта 50 мг лиофилизированных гомо сапиенс IgG (Hs-IgG), осторожно перемешать агарозы бусины и инкубировать в Ротари шейкер на ночь при 4 ° C.
  7. Спина на 400 × g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант с пипеткой.
  8. Вымойте IgG агарозы бусины с 50 мл сцепления буфер и спина на 400 × g 5 мин при 4 ° C.
  9. Ресуспензируйте IgG агарозы бусины с 50 мл блокирующий буфер (Таблица 1) и спина на 400 × g 5 мин при 4 ° C. Повторите один раз.
  10. Ресуспензируйте IgG агарозы бусины в 50 мл блокировки буфера, вращать смесь для 2 ч в RT и спина на 400 × g 5 мин при 4 ° C.
  11. Удалить супернатант и ресуспензируйте IgG агарозы бусины в 200 мл NaCl муфта буфера (Таблица 1).
  12. Чтобы заблокировать любые оставшиеся cross-linking CNBr группы, мыть IgG агарозы бусины с 100 мл 0,1 М глицин-HCl, рН 2.8. Спина на 400 × g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Вымойте с 0,2 М глицин HCl, рН 2.8, спина на 400 × g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Наконец мыть IgG агарозы бусины с 200 мл сверхчистой воды.
  13. Вымойте IgG агарозы бусины с 200 мл сверхчистой воды, а затем 200 мл PBS буфера (Таблица 1).
  14. Ресуспензируйте IgG агарозы бусины в 20 мл буфера PBS с 0,01% НАН3 (азид натрия) и хранить при 4 ° C.

3. изоляция и солюбилизация мембраны дроби

  1. Растереть 10 g трех недель A. thaliana саженцев в жидком азоте с использованием холодного ступку и пестик с песком.
  2. Добавить 20 мл холодной, шлифовка буфера (Таблица 1) 10 g земли ткани, хорошо перемешать и оттепели на льду.
  3. Фильтр огневки через два слоя быстрой фильтрации материала в 50 мл конические пластиковых пробирок. Замочите быстро Биофильтрационный материал с измельчением буфера до фильтрации.
  4. Центрифуга фильтрат 10 мин на 1500 × g при 4 ° C и передачи супернатант охлажденные 50 мл конические пластиковых пробирок, повторить то же шаг еще раз и собирать супернатант. Сохранить 200 мкл пример «Общая часть» и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа
  5. Супернатант передать холодной 38.50 мл ультрацентрифуга трубы и топ до 35 мл с холодной заточки буфера. Центрифуги для 1 h на 100 000 × g при 4 ° C в ультрацентрифугирования.
  6. Передать супернатант 50 мл конические пластиковых пробирок. Сохраните 200 мкл пример «растворимая фракция» и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа.
  7. Вновь приостановите зеленые гранулы с использованием стекла тефлон гомогенизатор, шлифовальные буфера. Центрифуга для 1 h на 100 000 × g при 4 ° C в ультрацентрифугирования и удалить супернатант.
  8. Ресуспензируйте зеленые гранулы в 18,75 мл 1 x шлифовальные буфер с использованием гомогенизатора тефлон стекла и добавьте 9,375 мл 1 x шлифовальные буфера.
  9. Добавление 9,375 мл раствора 4 x solubilisation (Таблица 1) (содержащие моющего средства TX-100) дать 37,5 мл и Инкубируйте 30 мин на «вращающейся шейкер» при 4 ° C.
  10. Центрифуги для 1 h на 100 000 × g при 4 ° C в ультрацентрифугирования. Передать супернатант 50 мл конические пластиковых пробирок. Сохраните 200 мкл пример супернатант (будущий «нагрузка фракция») и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа.
  11. Ресуспензируйте гранулы в 37,5 мл шлифовальных буфера. Сохранить образец нерастворимых части и хранить при температуре-80 ° C

4. иммунопреципитации

  1. Сбалансировать 100 мкл Упакованные IgG агарозы смолы в буфере A (Таблица 1) и спина на 100 × g 5 мин при 4 ° C.
  2. Удалить супернатант и ресуспензируйте IgG агарозы смолы в 100 мкл буфера A при 4 ° C.
  3. Передать 37,5 мл растворимых оболочек промывают IgG агарозы смолы и инкубировать на ночь на вращающейся шейкер в 50 мл конические пластиковых пробирок при 4 ° C.
  4. Отложениях IgG агарозы смолы на 100 × g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант с пипеткой. Сохранить 200 мкл пример «через поток» и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа.
  5. Вымойте IgG агарозы смолы в 37,5 мл буфера A и проинкубируйте втечение 10 мин на вращающейся шейкер.
  6. Отложениях IgG агарозы смолы на 100 × g 5 минут при температуре 4 ° C, удалить супернатант с пипеткой, добавить 5 мл измельчения буфера A 15 мл пластиковых пробирок и центрифуги на 100 × г, 4 ° C, 5 мин сохранить 200 мкл пример «Стирка 1» и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа.
  7. Повторите 5 мл промывки шаг три раза с буфером а.
  8. Осуществлять два последних шага стиральные без ингибиторы (NaF, ингибитор протеазы и PMSF)
    Примечание: Ингибиторы больше не требуется на данном этапе и пропуск для уменьшения стоимости. Сохраните 200 мкл пример последнего Стиральная шаг «окончательный стирка (Рейсы W6)» и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа.
  9. Передать столбец спин 500 мкл IgG агарозы смолы с 35 мкм фильтром и мыть бусины вдвое с 300 мкл ТэВ Элюирующий буфер (Таблица 1) (не содержащие AcTEV) для уравновешивания. Закройте столбце спина.
  10. Добавьте 300 мкл ТэВ Элюирующий буфер, содержащий 50 единиц (10 мкл) AcTEV. Подготовьте смесь в трубке перед добавлением смолы.
  11. Инкубировать столбце спин с бисером в thermomixer на 16 ° C, 350 об/мин – 2 ч. инвертировать столбце нежно несколько раз каждые 30 мин.
  12. Откройте столбце спин, поместите его в новой чистой 1,5 мл трубки и спина на 100 × g 5 минут при температуре 4 ° C для сбора элюата.
  13. Сухой (к примеру) 10% (v/v) eluted образца (~ 25 мкл) в центробежных испарителя и использовать для других дальнейшего анализа или масс-спектрометрии.
  14. Аликвота оставшиеся элюата (~ 275 мкл) разделены на одиннадцать центрифуги 1,5 мл трубки (25 мкл каждого), сушат в центробежных испарителя и хранить при температуре-80 ° C.
  15. Анализ образцов, сохранил всей процедуры, а также элюаты стандартом SDS-PAGE следуют immunoblotting. Для пробоподготовки, осадок 50 мкг из всего (T), нагрузка (L), поток через (FT), вымыть 1 (W1) и 200 мкл мыть 6 (Рейсы W6) хлороформ/метанола извлечения16.
  16. Добавьте 10 мкл 2 x SDS-PAGE загрузки буфера (Таблица 1) осажденный образцов и 25 мкл eluted сушеные образца. Вортекс и варить 10 мин при 95 ° C в блоке тепла.
  17. Анализ всего (T), нагрузка (L), поток через (FT), мыть 1 (W1), стирать 6 (Рейсы W6) и элюции (E) с использованием антител анти TOC159 для определения эффективности процедуры изоляции immunoblotting.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описали протокол для очистки комплекс от трансгенных A. thaliana TAP-тегами хлоропласта конверт белков растений. Как показано на рисунке 1A, растения, выражая 35S:NTAP-TOC159 конструкции, были использованы для изолировать этот комплекс, в то время как растения, выражая 35S:NTAP конструкции были использованы в качестве элемента управления. Рисунок 1 B показывает подробные шаги очистки белковых комплексов TAP-TOC159 следуют масс-спектрометрии, чтобы разрешить идентификации взаимодействующих белков. Анализ immunoblot (Рисунок 2, справа) подтверждает, что изолированные TAP-TOC159 взаимодействует с TOC75 и TOC33 комплекса TOC. Внешней мембраны хлоропластов киназы KOC1 знаны, что фосфорилировать TOC159 также совместно изолированных с кран-TOC159 комплекс (рис. 2B, справа). Наличие TIC110 показывает, что изолированные TAP-TOC159 комплекс также содержит компоненты комплекса TIC. FBN1A антитело против plastoglobule белок, не связанные с белком импорта не признают ТКП-TOC159 комплекс, указывающее отсутствие загрязнений. В отрицательный контроль immunoprecipitated NTAP белок не сделал совместно изолировать с любым из белков TOC TIC (рис. 2, левая сторона) и подтверждает специфика ТКП-TOC159 очистки.

figure-results-1
Рисунок 1 . Схема конструкции и процедура очищения сродства. (A). 35S:NTAP-TOC159 конструкции, кодирование NTAP-TOC159 было стабильно выражена в проростках Arabidopsis thaliana. Отрицательный контроль растений выразили 35S:NTAP конструкции, кодирование только TAP-тег. (B). шаг мудрый сродства очищения протокол состоит из мембраны изоляции и солюбилизация, IgG иммуно Очищение агарозы, моет, TEV протеазы расщепления и элюции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2 . Очищение сродства тандем белка TOC159. N-неизлечимо TAP-тегами TOC159 был очищен от NTAP-TOC15:ppi2 арабидопсиса растений и нажмите белков, очищенного от крана: WT растений был использован в качестве отрицательного контроля. Общий белок экстрактов (T), солюбилизирован мембранных белков = нагрузки дроби (L), поток через (FT), первый и последний мыть фракций (W1 и Рейсы W6) и 10% ТэВ элюата были проанализированы Западный blotting. Мембрана был исследован с антителами против TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) и FBN1A (AT4G04020). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица буферов
Муфта буферNaHCO3
Отрегулируйте к пэ-ашу 8.5 настроить рН с 0,1 М Na2CO3 		100 мм
 
Блокирует буферТрис HCl
Отрегулируйте к пэ-ашу 8 с HCl.		100 мм
 
PBS буферNa2HPO4
KH2PO4
NaCl
ДКК
Приспособиться к рН 7.3 с HCl.		4.3 мм
1,4 мм
137
2.7
 
NaCl, муфты буфераМуфта буфер
NaCl		 
1 M
2 x шлифовальные буфераТрис-HCl, рН 7,5 с HCl.
NaCl
NaF
PMSF
Завод коктейль ингибитор протеазы		100 мм
200 мм
5 мм
1 мм
0,20%
4 x solubilisation растворГлицерин
Тритон-X100		40%
3%
Буфер A 
2 x шлифовальные буфера
1 x шлифовальные буфера
4 x solubilisation раствор		100 мл
50 мл
25 мл
25%
TEV Элюирующий буферТрис-HCl, рН 8 с HCl
ЭДТА, рН 8 с HCl
NaCl
Глицерин
Тритон-X100
DTT		50 мм
0,5 мм
100 мм
10%
0.75%
1 мм
2 x SDS-PAGE загрузки буфераТрис-HCl pH 6.8 с HCl
SDS
Глицерин
Бромфеноловый синий
DTT		0,1 М
4%
20%
0,20%
0,2 М

Таблица 1. Рецепты буфера.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы показали, что один шаг крана тег очистки является конкретный и эффективный метод для очистки Arabidopsis TOC TIC комплекса. Хотя TAP-тегов позволит (IgG-следуют очищение сродства Кальмодулин после ТэВ протеаз расщепление) двух последовательных очистки шагов, мы считаем, что во многих случаях первый шаг сродство следуют ТэВ протеазы расщепление будет достаточно. Наша цель, TOC159, является низкая обильные и включение на втором шаге Кальмодулин близость чрезмерно уменьшается урожайность белка, который был главной причиной для исключения его из нашего настоящего Протокола. ТРВ элюции само по себе является весьма конкретные и нежной очистки шаг, который освободит только TAP-тегами целевые вместе со связанной взаимодействия партнеров, хотя заражение белки-специально придерживаться IgG смолы будет оставаться там. Таким образом в сочетании с шагом IgG близость, элюирование ТэВ приводит к достаточно эффективной очистки для наших и вероятно многих других целей.

Необходимо позаботиться что конструкция крана тегами является полностью функциональной в естественных условиях. TAP-тегов может иметь потенциально пагубное влияние на активность белка, стабильности или локализации. TOC159 состоит из трех доменов, в N-терминальный кислой, центре ГТФ связывающий домен и C-терминала мембраны домене, что якоря TOC159 в наружной хлоропласта мембраны2. Во избежание возникновения помех вставки мембраны мы сплавили TAP-тега N-го TOC159. Сплавливание к N-го является скорее исключением, чем правилом. Многие белки содержат N-терминальный сведения и должны поэтому, отмеченных в C-terminus. Мы уверены, что TOC159 является функциональной в естественных условиях путем дополнения ppi2 мутанта (Альбино мутант, не хватает TOC159) с кран-TOC159. Спасение зеленой, дикого типа фенотип указал, что ТКП-TOC159 функциональные15.

Протокол очистки использовался для выявления новых партнеров взаимодействия TOC159, которая включала10,KOC1 и TIC5611. В общей сложности около 30 белки были связаны с комплексом, предполагая, что новые формы взаимодействия партнеров будут изолированы и характеризуется в ближайшем будущем. Хотя мы рекомендуем TAP-тег для сложных очистки, мы по-прежнему хотели бы отметить, что дополнительные версии к представленному здесь существуют и могут быть очень полезны для некоторых приложений.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют не конкурирующие интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работы было поддержано грантов от швейцарского национального научного фонда (31003A_156998 и 31003A_176191) и в Невшательском университете.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NaHCO3PanReac  AppliChemA0384
TrisBiosolve0020092391BS
Na2HPO4SigmaS7909
KH2PO4PanReac  AppliChemA2946
NaClPanReac  AppliChemA2942
NaFSigmaS1509Токсичный
PMSFPanReac  AppliChemA0999Токсичный
коктейль ингибиторов протеазыSigmaP9599
ГлицеринPanReac  AppliChemA0970
Triton X100Roche10789704001
GlycinePanReac  AppliChemA1067
EDTACarl Roth8043
Дитиотреитол (DTT)PanReac  AppliChemA1101
SDSPanReac  AppliChemA0675
Бромофенол синийSigmaB0126
HClVWR20252-290Коррозионная
сахарозаPanReac  AppliChemA3935
Мурашиге и Скуг среда с витаминамиDuchefa BiochemieM0222
ФитоагарDuchefa BiochemieP1003
ТарелкаПетри Greiner Bio-one639102
1,5 мл микрофуге пробиркиSarstedt72.706
ЭтанолFisher chemicalE/0600DF/15
Фильтровальная бумага Ватман10311804
Хирургическая лента3M1530-1
CNBr-Активированные агарозные шарики (сефароза 4B)GE Healthcare17-0430-01
Фильтр из спеченного стеклаDURAN2515703
Центрифужная трубка 50 млTPP91050
Очищенный иммуноглобулин G (HsIgG)MP Biomedicals855908
Шейкер вращающийсяIKA4016000
NaN3 (азид натрия)Sigma71290Токсичный
материал быстрой фильтрации (Miracloth)Merk-Millipore475855
ультрацентрифуб XNP-80Beckman CoulterA99839
Ротор SW 32 TiBeckman Coulter369650
Ультрацентрифужные пробиркиBeckman Coulter326823
Стеклянный тефлоновый гомогенизатор (Potter)Wheaton357426
Спиновая колонка (Mobicol)Mo Bi TecM1003
Filter 35µ m для спиннинговой колонки (Mobicol)Mo Bi TecM513515
AcTEVInvitrogen12575-015
Центробежный испаритель (Speed Vac)Eppendorf5305000100
FBN1A(PGL35) антителоAgriSeraAS06 116RRID:AB_2247012
Sand, FontainebleauVWR27460.295

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., López-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Kessler, F., Schnell, D. Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus. Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).
  3. Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. Isolation of components of the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).
  4. Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).
  5. Jarvis, P., et al. An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science. 282 (5386), 100-103 (1998).
  6. Bauer, J., et al. Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane. The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).
  7. Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation. Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).
  8. Nakai, M. The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts. Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).
  9. Kikuchi, S., et al. Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane. Science. 339 (6119), 571-574 (2013).
  10. Kohler, D., et al. Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts. Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).
  11. Zufferey, M., et al. The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery. The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).
  12. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  13. Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants. The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).
  14. Rohila, J. S., et al. Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice. PloS one. 4 (8), 6685(2009).
  15. Agne, B., et al. The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein. Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).
  16. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TOC TIC ComplexesTAP Tag PurificationMembrane SolubilizationIgG Beads IncubationTEV Protease ElutionWestern Blot AnalysisMass Spectrometry IdentificationArabidopsis Thaliana

Похожие статьи