Методическая статья

Изоляция клубочков и в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков

DOI:

10.3791/58542

⸱

18 января 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, 2Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для мышиных в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков с биотин. Этот протокол содержит информацию о том, как perfuse мыши почек, изолировать клубочков и выполнять эндогенного иммунопреципитации протеина интереса.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеинурия результаты от нарушения клубочковых фильтр, который состоит из перфорированную эндотелия, клубочковых базальной мембраны и podocytes с их щели диафрагмы. Деликатный структура клубочковых фильтра, особенно щели диафрагмы, опирается на взаимодействие различных клеток поверхности белков. Изучая эти клетки поверхности белки до настоящего времени была ограничена в vitro исследования или гистологический анализ. Здесь мы представляем мышиных в vivo biotinylation маркировки метод, который позволяет исследование белков клубочковых клеток поверхности физиологического и патофизиологические условиях. Этот протокол содержит информацию о том, как perfuse мыши почек, изолировать клубочков и выполнять эндогенного иммунопреципитации протеина интереса. Полуфинал количественный поверхностного залегания клубочковых клеток легко доступны с этот новый метод и все белки доступным для перфузии биотина и иммунопреципитации могут быть изучены. Кроме того изоляция клубочков, с или без biotinylation позволяет далее анализ клубочковых РНК и белка, а также первичных клубочковых клеток культуры (т.е. первичной Подоцит клеток).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеинурия является отличительной чертой клубочковых травмы и обычно сопровождает нарушение клубочковых фильтра1. Клубочковой фильтрации состоит из перфорированную эндотелия, клубочковых базальной мембраны и podocytes. Деликатный молекулярной структуры клубочковой фильтрации очень динамичный и подвергать белка клеточной поверхности оборота как здоровые и больные почки2,3,4,5,6 . Эндоцитоза поверхностных белков клеток было показано, быть необходимым для выживания podocytes7. Трансмембранные белки, выраженные на podocytes Nephrin и podocalyxin. Nephrin является основой клубочковых щели диафрагмы, в то время как podocalyxin является sialoglycoprotein, покрытие процессов вторичного ноги podocytes8,9,10. Endocytic оборот ранее было показано, для nephrin и podocalyxin3,11,12,,1314.

В меру наших знаний эндоцитоза белков клеток поверхности не еще был описан в клубочковых клеток эндотелия в литературе. Однако эндотелиальные клетки в целом выразить все необходимые белки для различных типов эндоцитоза (то есть, зависящих от Клатрин, плот зависимая эндоцитоза)15,16. Таким образом, эндотелиальных клеток поверхности людьми может быть изучена с помощью этого метода, используя, например, сосудистого эндотелия (VE)-Кадгерины и внутриклеточных Межмицеллярная молекула (ICAM-2) как клетка поверхности белка маркера для клубочковых клеток эндотелия17 .

К сожалению не существует точного в vitro модели для деликатной трехслойное клубочковых фильтра, в котором ячейки могут быть изучены людьми поверхности белка. Цель этого метода является таким образом изучить клубочковых белка торговли людьми, в естественных условиях. Кроме того этот протокол содержит информацию о том, как изолировать клубочков, позволяя дальнейшего анализа клубочковых РНК, белки или клетки. Подобные клубочковых изоляции, что методы были описаны различные группы18,19.

Ранее мы и другие использовали ex vivo маркировки клубочковых клеток поверхности белков biotinylation2,3,4,,2021. Однако в этом методе ex vivo , изолированные клубочков были подвержены механическому воздействию, которое может повлиять на endocytic людьми. Кроме того Этикетировочный иммунофлуоресценции клубочковых клеток поверхности белков широко использовалась в литературе2,20,22. С помощью этого метода однако, только небольшое количество белков могут быть проанализированы в течение одного слайда, и количественный иммунофлюоресценции изображений часто бывает трудно.

Этот роман в vivo метод предлагает надежный инструмент для изучения клубочковых клеток поверхности белка изобилия и людьми точно в здоровые и больные почки, и он может использоваться как дополнение к иммунофлюоресценции тесты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышей были получены как внутренний породы от местных животных ухода объекта или Жанвье лабораторий во Франции. Согласно руководящим принципам, изложенным в руководстве для ухода и использования лабораторных животных (США национальных институтов из здравоохранения публикация № 85-23, редакция 1996) были проведены расследования. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с соответствующих институциональных утверждений (правительство штата LANUV ссылка номер AZ:84-02.04. 2016.A435).

1. Подготовка документов, решений и оборудования

  1. Подготовка 1 Л-фосфатный буфер дополнена хлорид магния 1 мм (2MgCl) и хлорид кальция 0,1 мм (2CaCl) (PBSCM) и процеживают через стерильную фильтр.
  2. Подготовить 5 мл стерильной PBSCM на мышь для перфузии и поместите его на льду.
  3. Для каждой мыши Подготовьте 5 мл стерильной PBSCM дополнена биотина 0.5 мг/мл.
  4. Для каждой мыши, подготовить 5 мл стерильной PBSCM и добавить 0,8 x 108 магнитные бусы (например., 200 мкл раствора 4 x 108 шариков/мл, без предварительной обработки) для эмболизации клубочков. Готовить это решение под скамейкой культуры клеток держать магнитные шарики в оригинальной трубки стерильные. Место это решение на льду.
  5. Приготовляют раствор закалки, добавив 100 мм глицин PBSCM (5 мл на мыши) и держать его на льду.
  6. Сделайте раствор коллагеназы (0,378 ед/мл коллагеназы A в стерильные PBSCM). На мышь Пипетка 1 мл раствора коллагеназы в 2-мл пробирку и поместите его на льду.
  7. Для стирки, подготовить стерильные PBSCM (см. шаг 1.1) в 50 мл трубки и поместите его на льду.
  8. Для перфузии используйте шприцевый насос с потоком 2.0 мл/мин.
  9. Подготовки шприц 10 мл с иглой 21G. Место кончике иглы в 20-30 см длиной катетер (внутренний диаметр, ID = 0,58 мм). Подключите катетера (ID 0,58 мм) с катетером короткие 10 см (ID 0,28 мм) и отрезать кончик катетера меньше косой для легко вставки в аорту мыши.
  10. Лигатура процедур во время операции сократить три 5-7 см шелковой нити (4-0 6-0) на мышь.
  11. Для хирургии Подготовьте 3 хирургические зажимы, 2 хирургические ножницы, 2 пинцета, 2 штрафа пинцет, 1 штраф ножниц и тампоны. Подготовьте анестезии (например, внутрибрюшинного анестезии кетамином 100 мг/кг веса тела и ксилазина 5 мг/кг веса тела).
  12. Для изоляции клубочков почек используйте стрейнер ячейки 100 мкм, две трубы 50 мл и магнит зрелище.
  13. Подготовить главы литического буфера: 20 мм 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (главы); 20 мм (гидроксиметил) трис-aminomethan (Tris) рН 7,5; 50 мм sodiumchorlide (NaCl); 50 мм sodiumfluoride (NaF); 15 мм Na2O4P7; 0,1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) рН 8,0; sodiumorthovanadate 2 мм; и 2 мм adenosinetriphosphat (АТФ).
  14. Прохладный центрифуги до 4 ° C.

2. хирургии под микроскопом

  1. Анестезировать мыши (например, с кетамином/Ксилазина внутрибрюшинно, см. шаг 1.11). Выполните тест мыс пинча для подтверждения надлежащего анестезии.
  2. Продезинфицируйте вентральной стороне мыши с 70% изопропиловый спирт.
  3. Выполните срединного разреза через кожу от таза до грудины и удалить кожу от брюшной фасции с помощью пинцета. Вырежьте кожу с обеих сторон в середине живота с Ножницы хирургические.
  4. Изменить хирургические инструменты. Применять средний отрезок от мечевидного в мочевой пузырь через слой мышц живота и разделить их на четыре квадранта, используя хирургические ножницы и щипчики. Прикрепите верхнюю сторону два с зажимами к шее мыши с двух хирургических зажимов.
    Примечание: Живот теперь открыт.
  5. Положите висцеральных органов сторону с помощью стерильного тампона и сократить печеночно диафрагмального связки с тонкой ножницами.
  6. Подготовьте перевязки (с шелковой нитью 4-0 6-0) вокруг аорты проксимальных почечных артерий на высоту надпочечников с двумя хорошо пинцетом. Затяните проксимального отдела аорты лигирование отменить поток крови с помощью пинцета.
  7. Бесплатный дистальной части аорты из фасции, жир и другие ткани и подготовить лигирование вокруг печени/верхней брыжеечной артерии черепной почечных артерий, с помощью тонкой хирургического пинцета.
  8. Подготовить перевязки (с шелковой нитью 4-0 6-0) вокруг аорты дистальных почечных артерий и зажим верхней полой вены и аорты на высоте бифуркации.
  9. Вырежьте небольшое отверстие в аорту дистальных почечных артерий так, чтобы отверстие половину диаметра аорты. Поместить катетер в аорту и исправить ее с подготовленной лигатур.
    Предупреждение: Во избежание пузырей в системе перфузии во избежание эмболии.
  10. Начните с ледяной PBSCM при скорости потока 2 мл/мин перфузии.
  11. Вырезать отверстие в почечной Вены на уровне почечных артерий с тонкой Ножницы хирургические и затяните лигирование вокруг печени и верхней брыжеечной артерии.
    Примечание: Почки должны повернуть бледно после запуска перфузии.

3. в Vivo Biotinylation

  1. Изменение шприц, пузырь бесплатно ледяной PBSCM дополнена 0.5 мг/мл биотина для маркировки поверхности и perfuse почками с 5 мл со скоростью потока 2 мл/мин.
    Примечание: Mix PBSCM решения (например, повернув 50 мл трубки) осторожно, чтобы избежать образования пузырьков в рамках решения. После аспирации раствор в шприц эвакуировать или пузырьков воздуха из шприца. Использование дополнительных канюля (21G) на шприц для заполнения пространства в канюли, которая подключена к системе катетера. Наконец вставьте шприц в канюлю с катетер без пузырьков.
  2. Измените шприц пузырей на ледяной PBSCM дополнена 100 мм глицин утолить клубочков и perfuse с 5 мл на поток 2 мл/мин.
  3. Изменение шприц, пузырь бесплатно ледяной PBSCM дополнена 200 мкл магнитных шариков/мл и perfuse почками в 2 мл/мин.
    Примечание: На поверхности почек, эмболизация клубочков с коричневой магнитные бусы будет видимым.

4. изоляция клубочков из двух почек

  1. Почки в рубчик и удалите капсулы. Место на льду в 15 мл PBSCM в 10 см блюдо культуры клеток почек. Усыпить мыши с шейки матки дислокации после сбора урожая почки под наркозом. Процедур хирургии и перфузии длится примерно 20-22 мин.
  2. Нарежьте почки наименьшее возможно с новой двойной край лезвия. Переместите ткани в 2-мл пробирку с 1 мл раствора коллагеназы A (см. шаг 1.6) и дайджест при 37 ° C за 30 мин. До и после переваривания осторожно перемешать с 1000 мкл, вырезать пипеткой.
  3. Промойте переваривается ткани через стрейнер ячейки 100 мкм, с помощью ледяной PBSCM. Аккуратно используйте клетки скребок для фарш оставшиеся корыта ткани клеток сетчатый фильтр и промойте его с ледяной PBSCM потом к общим объемом 50 мл.
  4. Центрифуга подвеска на 4 ° C 500 x g 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с чуть менее 1,5 мл ледяной PBSCM во время vortexing гранул. Впоследствии Положите клубочковых подвеска в новом 2-мл пробирку.

5. мытье

  1. Использование магнита зрелище тянуть клубочков в одну сторону. Подождите 1 мин до клубочков перешли к магниту.
  2. Удалите супернатант с 1000 мкл пипетки 2-мл пробирку остается в магнит зрелище. Во время первой и второй стирки шаги (см. шаг 5.3), 250 мкл супернатанта остается в трубе, во избежание потери клубочков. Выполните эту процедуру быстро, чтобы избежать давая трубчатых структур опускаться на дно трубки.
    Примечание: Процедура стирки будет длиться дольше, в противном случае.
  3. Снять 2-мл пробирку с магнит зрелище и добавить 1 мл PBSCM, Пипетка вверх и вниз (очень важно), затем вихря.
  4. Положить трубку обратно в магнит зрелище и начать с шага 5.2.
  5. Повторите шаги Стиральная чистоту клубочков достигла 90%. Для этого проверьте представитель Алиготе супернатант под микроскопом (40-100 X).
    Примечание: Клубочков будет отображаться как круглые структуры, содержащие коричневый магнитные бусы. Удлиненные структуры трубчатых фрагменты, и свободный магнитные шарики появляются как коричневый круглыми точками. Ячейки мусор может появиться как громоздкие структуры.
  6. Если достигается чистота, оцените количество клубочков, растворяя клубочков в 1 мл PBSCM. После смешивания, возьмите Алиготе 10 мкл и рассчитывать клубочков под микроскопом. Рассчитать количество клубочков с помощью следующего уравнения: окончательное количество клубочков = количество клубочков в 10 мкл аликвота x 100.
  7. Успешной изоляции клубочков приводит к ряду 10000-40000 клубочков.

6. белка добычу и иммунопреципитации (IP)

  1. Собирать клубочков центрифугированием при 4 ° C на 6800 х g для 5 минут удалить супернатант при использовании магнит зрелище и Ресуспензируйте гранулы ледяной литического буфера (например., 30000 клубочков в 300 мкл; РЕБЯТА, смотрите шаг 1.11). Однородный образцы с ткани гомогенизатор на максимальной скорости для 30 s и лизируют их на льду за 30 мин.
  2. Удаление нерастворимый материал центрифугированием на 15000 x г за 30 мин на 4 ° C. Пипетка супернатанта, которая включает в себя клетки lysate в новой 1,5 мл трубку. Выбросите гранулы.
  3. Измерить концентрацию белка супернатант с помощью bicinchoninic (BCA)-на основе метода следуя инструкциям производителя. Успешное лизис 30000 клубочков уступает клубочковых белка, количество 700-1000 мкг/мл. Приспособиться к суммы равной белка с буфера lysis.
  4. Возьмите Алиготе 10% от общего объема для клубочковых lysate и добавить 2 x Лэмли + dithiothreithol (DTT) до инкубации в течение 5 мин при 95 ° C.
  5. Для IP-адреса Инкубируйте остальной части lysate стрептавидина агарозы бисером на ночь при 4 ° C на накладных шейкер.
  6. Центрифуга агарозы бусы на 1000 x g 3 мин при температуре 4 ° C, удалить супернатант и добавить 800 мкл буфера lysis мыть Бусины для связывания неспецифических белков.
  7. Повторить 3 раза мыть и полностью удалить супернатант.
  8. Добавьте 30 мкл 2 x Лэмли + DTT и Инкубируйте на 95 ° C за 5 мин.
  9. Загрузить lysate и IP зонды на 10% SDS гель и Побегите гель SDS 70 V 30 мин, затем 20 мА на гель для 1,5 ч. После этого, пятно гель для 2 h 200 мА на нитроцеллюлозную мембрану.
  10. Блокировать нитроцеллюлозную мембрану на ночь при 4 ° C с 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в отмывающего буфера.
  11. Проинкубируйте мембрану с антителом интерес на ночь при 4 ° C. Промойте отмывающим буфером 3 раза за 5 мин в шейкере и Проинкубируйте мембрану с ПХ тегами вторичное антитело за 1 ч при комнатной температуре. Повторите шаг стирки.
  12. Визуализировать lysate и иммунопреципитации зонды на мембрану с помощью супер-резолюции хемилюминесцентный агента с ПЗС-камеры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы изолировать клубочков точно, надо сначала perfuse мышиных почки с PBSCM. Перфузия с PBSCM поворачивает почки бледно (рис. 1А). Эмболизация клубочков с магнитной бусины будет виден как коричневые точки на поверхности почек (рис. 1Б). Изоляция клубочков с магнитом зрелище может показать загрязнения с почечной tubuli (рис. 1C). До дальнейшего анал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный метод позволяет успешно изоляции клубочков расследовать клубочковых RNA или протеина. Кроме того культуры первичной клубочковых клеток может выполняться из изолированных клубочков. Если биотина применяется перед клубочковых изоляции, маркировки клубочковых клеток поверхности белков может выполняться. С помощью этого метода в естественных условиях клубочковых клеток поверхности белка людьми могут быть изучены, и возможен полу количественный белка изобилия. Наиболее важных шагов для успешного тестир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Blanka Duvnjak за ее исключительной технической помощи. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1-М.В и QU280/3-1-I.Q. Спонсора имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных, анализ данных, решение опубликовать и подготовка рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Motic SMZ168 BLMoticSMZ168BLмикроскоп для мышиной хирургии
KL1500LCDмикроскопия Pulch и Lorenz150500свет для мышиной хирургии
Rompun (Xylazin) 2%BayerPZN:01320422анестезия
MicrofederschereBraun, AesculapFD100Rтонкие ножницы, для разреза в аорте
Durotip Feine ScherenBraun, AesculapBC210Rдля брюшного разреза
Anatomische PinzetteBraun, AesculapBD215Rдля хирургии до вскрытия брюшной полости
Prä parierklemmeAesculapBJ008Rдля хирургии 
SeraflexSerag WiessnerIC108000шелковая нить
Кетамин 10%Medistarанестезия
Rompun (Ксилазин) 2%Байеранестезия
Тонкая полиэтиленовая трубка ID 0,28 мм OD 0,61 ммPortex800/100/100катетер
Тонкая полиэтиленовая трубка ID 0,58 мм OD 0,96 ммPortex800/100/200катетер
Гарвардский аппарат 11 PlusГарвардский аппарат70-2209шприцевой насос
EZ-link Sulfo-NHC-LC-BiotinThermo Scientific21335биотин
Dynabeads Нетронутые мышиные Т-клеткиInvitrogen11413Dдля эмболизации клубочков
Коллагеназа АRoche10103578001для переваривания почечной ткани
DynaMag-2Invitrogen123.21DМагнитоулавливатель
100&микро; m клеточный красительGreiner-bio542000для выделения клубочков
Axiovert 40 CFLZeissнедоступендля подтверждения чистоты клубочков
TissueRuptorQuiagen9002755Гомогенизатор
тканей CHAPSSigma-AldrichC3023для буфера для лизиса
Tris-HCLSigma-AldrichT5941для буфера
NaClVWR химикаты27810295для лизиса
буфер NaFSigma-Aldrich201154для лизиса
EDTASigma-AldrichE5134для лизиса
буфер ATPSigma-Aldrich34369-07-8для лизиса
буфер Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Следуйте инструкциям производителя
антитело к нефринуProgenGP-N2для вестернблоттинга
поликлональные козьи антитела к подокаликсинуR& D SystemsAF15556-SPдля вестернблоттинга
стрептавидина агарозной смолыThermo Scientific20347для иммунопреципитации
белка А сефарозы CL-4BGEHealthcare 17096303для иммунопреципитации
поликлональных антител кролика против p57SCBTsc-8298для иммуногистохимии
мышиного моноклонального анти-бета актина антитела, клон AC-74Sigma-AldrichA2228Western blot load control
rabbit anti-p44/42cell signalling4695for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRPThermo Scientific21130for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 антитело R& D SystemsAF774для вестернблоттинга
поликлональных мышей анти-VE-кадгеринR& D SystemsAF1002для вестернблоттинга
для лизиса

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
  2. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513(2016).
  3. Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
  4. Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
  5. Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32(2017).
  6. Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
  7. Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
  8. Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
  9. Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302(2018).
  10. Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
  11. Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
  12. Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185(2010).
  13. Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
  14. Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
  15. Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
  16. Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
  17. Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
  18. Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
  19. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  20. Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217(2017).
  21. Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
  22. Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
  23. Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
  24. Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502(2018).
  25. Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Glomerular IsolationIn Vivo BiotinylationCell Surface Protein LabelingKidney PerfusionMagnetic Bead PurificationGlomerular Cell Surface ProteinsNephrin Podocalyxin AnalysisImmunoprecipitation MethodProtein Trafficking StudyPrimary Podocyte Culture

Похожие статьи