Интенсивности осадков денитрификация с использованием ядер и N₂O микросенсоры

Антропогенные изменения круговорота азота является одним из самых сложных проблем для системы земли¹. Деятельность человека по крайней мере вдвое уровень реактивного азота для биосфера². Однако по-прежнему существуют большой неопределенности в отношении как глобального цикла N оценивается. Несколько потоков оценки были количественно с меньш чем ±20% ошибка, и многие неопределенности ±50% и больше³. Эти неопределенности свидетельствуют о необходимости точной оценки темпов денитрификации всей экосистемы и понимание основных механизмов вариации. Денитрификация является микробной активности, через который азотистых оксидов, главным образом нитратов и нитритов, сводятся к диазота газов, N O₂и N₂⁴. Путь является весьма актуальное значение для биосферы наличия химически активного азота, потому что это основной процесс удаления⁵. N₂O является парниковым газом с потенциал потепления почти 300 раз что CO₂ более 100 лет и она является текущей основной причиной истощения стратосферного озона из-за больших количествах, излучаемых^6,7.

Ниже мы представляем собой протокол для интенсивности осадков денитрификация с использованием ядер и N₂O микросенсоров экспериментально (рис. 1). Денитрификация тарифы рассчитаны с использованием ацетилена ингибирование метод^8,9 и измерения накопления N₂O в течение определенного периода (рис. 2 и рис. 3). Мы демонстрируем метод, применяя его к Гора озерных отложениях. Это тематическое исследование подчеркивает производительность метода для обнаружения сравнительно низкие ставки с минимальным нарушением физической структуре отложений.

Особенно трудно измерить¹⁰денитрификации. Существует несколько альтернативных подходов и методов, каждый из которых преимущества и недостатки. Недостатки, имеющиеся методы включают в себя их использования дорогостоящих ресурсов, недостаточной чувствительности и необходимость изменять уровни субстрат или изменять конфигурацию физического процесса с использованием образцов нарушенной¹⁰. Даже более фундаментальный вызов для измерения N₂ является его повышенной фоновых уровней в окружающей среде¹⁰. Сокращение N₂O N₂ тормозится ацетилена (C₂H₂)^8,9. Таким образом денитрификация может быть определена количественно измеряя накопленной N₂O присутствии C₂H₂, который возможно из-за низких экологического N₂O уровней.

Использование C₂H₂ для измерения скорости денитрификации в отложениях был разработан около 40 лет назад¹¹и включение N₂O датчиков произошло около 10 лет позже¹². Наиболее широко применяемый подход, основанный на ацетилен является ядром «статические». Накопленные N₂O измеряется во время инкубационный период до 24 ч после добавления headspace запечатанном отложений ядро¹⁰C₂H₂ . Метод, описанный здесь, следующим за этой процедурой с некоторыми нововведениями. Мы добавляем C₂H₂ , пузырьков газа в водной фазе ядра на несколько минут, и заполняем все headspace образца воды перед началом измерения накопления N₂O с микропроцессоров. Мы также включать систему перемешивания, которая предотвращает расслоение воды без resuspending отложений. Процедура дает количественную оценку скорость денитрификации площадь поверхности отложений (например, мкмоль N₂O m^-2 h^-1).

Высокой пространственной и временной вариации денитрификации представляет еще одна трудность в его точную количественную оценку¹⁰. Обычно накопления N₂O последовательно измеряется газовой хроматографии headspace образцов, которые собираются в ходе инкубации. Метод, описанный обеспечивает улучшение контроля за временной вариации накопления N₂O, потому что микропроцессоров обеспечивает непрерывный сигнал. Мультиметр микропроцессоров является микропроцессоров цифровой усилитель (picoammeter), который взаимодействует с датчик (датчики) и компьютера(рисунок 1). Мультиметр позволяет несколько N₂O микросенсоров использоваться в то же время. Например до четырех отложений ядер с того же сайта исследования могут быть измерены одновременно счет для пространственной изменчивости.

Основной подход едва мешает структуры осадков, по сравнению с некоторыми другими методами (например, растворы). Если целостность отложений изменяется, это приводит к нереалистичным денитрификации ставки¹³ , подходят только для относительного сравнения. Более высокие показатели всегда получаются с методами навозной жижи, по сравнению с основными методами¹⁴, потому что последний сохраняет ограничения денитрификации диффузии субстрата¹⁵. Суспензии меры нельзя считать представителя на месте ставки¹⁶; они обеспечивают относительных показателей для сравнения с точно такая же процедура.

Метод, описанный подходит для оценки показателей денитрификации в любой тип осадка, который может быть порошковой. Мы особенно рекомендуем этот метод для выполнения экспериментальных манипуляций некоторых из движущих факторов. Примерами являются эксперименты, которые изменяют наличие нитратов и температуры, необходимые для оценки энергии активации (E) денитрификации¹⁷ (рис. 2).

Рисунок 1 : Экспериментальная установка. () Генеральной экспериментальной установки для оценки осадков денитрификации ставки использованием ядер и N₂O микросенсоров. Инкубации палата обеспечивает тьмы и контролируемых температурных условий (±0, 3 ° C). Пяти нетронутыми кернах могут обрабатываться одновременно, используя их соответствующие N₂O датчики. (b) N₂O датчик калибровки камеры. Мы приспособили его с резиновыми пробками и шприцы смешать N₂O воды (см. Протокол шаг 3.4.3). Есть термометр для контроля температуры воды. (c) макро отложений базисной выборке с датчиком вставляется в центральное отверстие покрытия ПВХ и суставов, запечатанный клейкой лентой. Мешалка висит в воде, и электромагнитом близка его и крепится к внешней части акриловые трубы. (d) макро N₂O микропроцессоров наконечник защищен кусок металла. (e) осадочных кернов, который только что был восстановлен. Он был пробы с лодки в глубокое озеро; до сих пор акриловые трубы с основной крепится к посланник адаптированных тяжести многокамерного¹⁹. Смотрите Таблицу материалов для всех элементов, необходимых для выполнения этого метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

1. Подготовка

Примечание: Начните это в день, прежде чем измерений.

1. Монтаж установки измерения (рис. 1, смотрите Таблицу материалов).
   Примечание: Чтобы обеспечить постоянное и высокое качество питания, измерения устройство подключено к сцепление через источник бесперебойного питания (UPS), также могут выступать в качестве резервного. В случае сбоя питания длительного автомобильный аккумулятор служить источником дополнительной энергии.
2. Запуск сенсора программного обеспечения и применять -0,8 V напряжения поляризовать N₂O микросенсоров. Сигнал показывает быстрый спуск и последующий рост, то он наконец уменьшается до тех пор, пока это низкая и стабильная.
   Примечание: Производитель микропроцессоров рекомендует поляризации по крайней мере на ночь (или больше) для обеспечения стабильности сигнала датчика. Еще одна рекомендация заключается в держать датчик поляризованных если измерений планируется для нескольких или¹⁸дней подряд.
3. Включите инкубации камеру и Отрегулируйте экспериментальных условий (например, отдельных выключать свет и температуры, будет аналогичен ожидаемый в поле). Поместите контейнер с дейонизированной водой внутри камеры, так что вода доступна позднее при температуре измерения для калибровки датчиков.
   Примечание: Этот шаг может быть сделано в тот же день запланированных измерений, перед отъездом собирать ядра. Для стандартных измерений желательно использовать темных условиях.
4. Упаковать поле основные материалы коллекции: устройство бура, выборки трубы, резиновые пробки, поливинилхлорид (ПВХ) краны, отвертки, глобального позиционирования (GPS) блок, термометр, портативный Эхолот, вейдерсы и надувная лодка (см. таблицу из Материалы). Используйте контрольный список, чтобы убедиться, все материалы включены.

2. осадка основной коллекции

1. В зависимости от глубины воды Следуйте 2.1.1 и 2.1.2.
   1. Для глубоких водоемов
      1. Используйте messenger адаптированных тяжести Бур¹⁹ из лодки или платформы (eрис. 1).
      2. Исправить трубка отбора проб (акрил, ø 6.35 см, длина ≥ 50 см) для бура с помощью отвертки.
      3. Выберите точку выборки согласно целям расследования. Принять к сведению позицию (например, с помощью GPS координаты) и измерения глубины (например, с помощью ручной эхолот). Если выборка с лодки, используйте якорь (например, сумку с камнями), чтобы избежать дрейфующих во время основной коллекции.
      4. Развертывание системы керна, до тех пор, пока трубка отбора проб является ~ 1 м от отложений. Использование веревки с обычных знаков (например, интервалы 1 м) для контроля глубины расположения оборудования для отбора проб.
      5. Стабилизировать оборудование для отбора проб для 60 s (например, чтобы свести к минимуму движения лодки). Это обеспечит правильную отложений проникновения и восстановления едва нарушается осадочных кернов.
      6. Релиз ~ 1 м больше веревки, так, чтобы трубка отбора проб проникает отложений. Имейте в виду, что если трубка отбора проб проникает слишком много, это может нарушить интерфейс воды/отложений.
      7. При попытке сохранить напряженность в веревки, так что бура остается фиксированной, так и в вертикальном положении, отпустите messenger. Когда посланник влияет бура, небольшая разница может ощущаться в натяжение каната. В то время закройте Бур для создания вакуума, который позволяет для восстановления осадочных кернов.
      8. Восстановите бура, потянув веревку, постоянно и аккуратно.
      9. Как только ядро близко к поверхности, но по-прежнему полностью погруженной (включая резиновые части Бур, который обеспечивает вакуум), место резиновую пробку в нижней части трубки выборки. Осмотрите воды/отложений интерфейс; Это должно быть ясно и не заметно нарушена (eрис. 1). Если это не так, отменить ядро, очистить трубу и повторите шаги 2.1.1.4-9.
      10. Поднять всю систему керна из воды. Освободить трубку выборки из многокамерного и место ПВХ покрытия на верхней части. Запечатать его с клейкой лентой. Избегайте формирования воздушного пространства.
   2. Для прибрежных мест обитания и неглубокие водоемы
      1. Платье в Вадер для отбора проб в очень мелких водах (< 0,6 м).
      2. Использовать с трубкой или подводное снаряжение для глубокого выборки (до 3 м).
      3. Выберите точку выборки согласно целям расследования. Принять к сведению позицию (например, координаты GPS). Вручную, вставьте трубку выборки (например, акрил, ø 6.35 см) в отложениях.
      4. Место резиновую пробку в верхней части трубки выборки для получения вакуума.
      5. Удаление основной из отложений и быстро ввести другой резиновой пробкой в нижней части трубки.
         Примечание: Это необходимо для работы с трубки под водой во все времена; на очень мелководных участках мы рекомендуем сократить трубки до 20 см. Иногда отложений имеет высокое содержание воды и стоков, когда трубка удаляется из отложений кровати. В этом случае необходимо ввести Стопор нижний без поднятия ядро вне отложений. Чтобы сделать это, вручную погружать пробку в отложениях вокруг трубки и поместите его внимательно, чтобы закрыть в нижней части трубки.
      6. Из воды заменить верхний резиновой пробкой с покрытием ПВХ и уплотнение junction с клейкой лентой.
2. Защитите основной во время ее передачи в лабораторию, минимизации вращений и тряски.

3. Калибровка микросенсоров закиси азота (N₂O)

1. С помощью компьютера (полоса диаграмма, датчик программное обеспечение), проверьте, что сигнал датчика является стабильным и низким (< 20 МВ).
2. Создайте новый файл (например, с датой и узел выборки (130903_Redon_Lake)) для записи значения калибровки и датчика сигналов.
   Примечание: Датчик сигналов чувствительны к температуре (рис. 4). Используйте же температуры для измерения и калибровки датчика. Датчик реагирует линейно между 0% - 2,5% N₂O²⁰. Таким образом две точки калибровки является достаточно¹⁸.
3. Для калибровки значение с нулевым закиси азота, прочитал сигнал датчика, сохраняя сенсорного наконечника submersed в N₂O-свободной воды (деионизированная).
4. Калибровка N₂O водой в нужной концентрации.
   Примечание: Подготовьте воду с определенной концентрации₂O N, которая слегка превышает ПДК в ходе инкубации. Мы используем ~ 25 мкм N₂O калибровки значение. Помните, не превышающий максимальный датчик диапазон концентрации 500 N₂O мкм.
   1. Получите N₂O-насыщенный водой, восходящей N₂O в деионизированной воде на несколько минут.
      Примечание: Значения растворимости в воде₂O N зависит от температуры и солености²¹; Смотрите таблицу в приложении датчик ручного¹⁸.
   2. Разбавьте N₂O насыщения воды, добавляя некоторое количество насыщенных N₂O воды к объему обессоленной воды. Например при 20 ° C, добавление 0,3 мл насыщенного N₂O воды, которая имеет концентрацию 28.7 мм N₂O, в общей сложности 375 мл воды для получения 22,9 концентрации O N₂мкм. Примечание что 375 мл является общий объем калибровки камеры (рис. 1б).
   3. После смешивания аккуратно N₂O насыщенных водой с деионизированной воды в сосуде калибровки чтобы разбавить его до требуемой концентрации, читать сигнала датчика когда она постоянна. Это чтение это значение калибровки с X µM N₂O водой. При смешивании решение, будьте осторожны, чтобы не создавать пузыри, как это устранит N₂O от калибровочный раствор.
      Примечание: Учтите, что N₂O в воде будет медленно бежать в воздух; Таким образом подготовленный калибровочный раствор может использоваться только на несколько минут.

4. основной подготовки и ингибирование ацетилена

1. Изменение покрытия ПВХ расположен в верхней части каждого осадочных кернов другой крышка с отверстием в центре и висит магнитной мешалкой. Повторная печать перекрестка с клейкой лентой.
2. Уменьшить водной фазы каждого образца приблизительную высоту 12 см (объем ≈ 380 мл). Для этого сначала вставьте трубки силиконовые в центральное отверстие. Затем поставьте осадочных кернов в цилиндре и толкать пробку снизу для создания давления. Пробка и осадка образец идти вверх, и избыток воды проходит через трубку. Сбор воды в сосуде, получателя.
   Примечание: Образцы с грубой зернистости может быть проблематичным во время этого шага. Отложений частиц помещается между пробкой и трубки можно деформировать пробку и открыть отверстие через воздушных пузырей может пройти и нарушить образца. Чтобы избежать этой проблемы, поместите цилиндр в центре нижней пробкой и попробуйте нажать с постоянной силой. Стык между силиконовые трубки используется для эвакуации избыток воды и ПВХ покрытие состоит из твердых части (например, 5 мл наконечник пипетки без его узкого конца) вставлен в силиконовой трубки.
3. Выполните торможение ацетилена, кипит ацетилена газ в водной фазе ядра для примерно 10 мин. Избегайте resuspending отложений.
   Примечание: Как возможной модификация метода, добавить субстрата (нитрат) через концентрированной жидкой среде перед восходящей ацетилена для потенциальных денитрификации измерений (например, как показано на рисунке 3b, c).

5. денитрификации (N₂O накопление мера)

1. Заполните все воздушное пространство в образце с предыдущих остатки воды. Поместите датчик в осадочных кернов через центральное отверстие мякоти верхней крышки ПВХ. Наконечник датчика должен быть расположен в водной фазе выше мешалкой (рис. 1c).
   Примечание: Все соединения трубы акриловые выборки должны быть закрыты для избежания утечки газов и воды во время измерения (рис. 1, c). В нижней части трубки резиновую пробку достаточно для этого. Уплотнения в мякоти верхней части является более сложным. ПВХ покрытия должны быть настроены. Она должна быть нагрета с факелом; затем когда материал становится гибким, но не выжженной, крышка помещается в трубу таким образом, чтобы ее форму можно формовать. После охлаждения, крышку необходимо больше изменений (за исключением покрытия, используемые для транспортировки образцов в лабораторию в шагах 2.1.1.10 или 2.1.2.6). Центральное отверстие, где датчик вставляется должна быть пробурена. Мешалки могут быть проведены с лески, который в свою очередь соблюдается с клеем на внутренней обложке так что мешалки висит на леску в воде (рис. 1c). Кроме того все суставы (крышка трубки ПВХ и ПВХ покрытие датчика) запечатаны с клейкой лентой. Место упругой Скотч для регулировки диаметра датчика для того, чтобы запечатать контактной поверхности между центральным отверстием крышку ПВХ и датчик (рис. 1c).
2. Переключитесь на контуре электромагнитного импульса, который является частью системы перемешивания.
   Примечание: Система перемешивания предотвращает стратификации водной фазы без тревожных (resuspending) отложений. Перемешивания система состоит из контура, который переключает вкл/выкл электромагнит, который привлекает/релизы Магнитная мешалка (см. Таблицу материалов для подробного описания).
3. Переместите электромагнита вокруг внешней частью акриловые трубы мешалки движется непрерывно, а затем исправить его на месте с помощью клейкой ленты (рис. 1c).
4. Закройте инкубации камеру для обеспечения постоянной температуре (например, вариация ±0. 3 ° C).
5. Нажмите кнопку записи (датчик программное обеспечение), чтобы начать запись сигнала датчика. Чтения обычно записываются каждые 5 мин.
6. Нажмите кнопку «Стоп» в конце периода измерения.

6. Заключительные измерения шаги

1. Подождите по крайней мере ~ 10 мин с сенсорного наконечника, погруженной в воду бесплатно N₂O (деионизированная) перед чтением сигнал нулевой N₂O калибровка меру.
2. Выполните калибровку окончательный датчика. Для этого повторите калибровку датчика, после раздела 3, но начиная с шага 3.3.
3. Сохраните файл (датчик программное обеспечение).

7. денитрификации скорость вычислений

1. Начните с сдвига выходного файла, порожденных программного обеспечения датчик, который содержит запись сигнала датчика в МВ и мкм N₂O и калибровочные данные.
2. Участок сигнал датчика против времени визуализировать N₂O накопление тенденции (например, рис. 2).
3. Используйте только диапазон времени с линейной накопления, за исключением первоначального адаптационного периода образца и возможные окончательное насыщение из-за ограничения субстрата (например, Рисунок 2b). Создайте модель линейного сигнала датчика (мкм) с течением времени (h).
   Примечание: Склон является скорость денитрификации (мкм N₂O сердечника^-1 h^-1), который, если разделенная на площадь ядра (πr²), превращается в скорость в мкм N₂O m^-2 h^-1и при умножении на Водный объем (πr²h, где h – высота водной фазы и r внутренний радиус акриловые трубы, в данном случае является 0.12 и 0.03175 м, соответственно) превращается в скорость в мкмоль N₂O m^-2 h^-1.

В общей сложности 468 денитрификации ставки рассчитывались с использованием протокола выше в отложениях от Пиренейских горных озер за период 2013-2014 гг. Мы показываем некоторые из этих результатов, чтобы проиллюстрировать процедуры (рис. 2 и рис. 3). В целом линейная модель между N2O концентрации и времени имеет хорошие корреляции (R2 ≥ 0.9). Наклон отношений дает оценку темпов денитрификации (шаг 7.3; например, Рисунок 2d). Если действие денитрификации является очень низкой, датчик электронного шума становится более важным и добра подходят уменьшается (например, датчики 4 и 5 в Рисунок 2b и Рисунок 3А). Хотя базовый предел обнаружения N2O ~0.1 мкм в воду22, который является промежуточным значение относительно альтернативных методов23, возможность накопления тысячи непрерывных измерений для фильтрации шума разрешает оценки ценам сравнительно низким денитрификации, до ~ 1 мкмоль N2O m-2 h-1 (рис. 2 и Рисунок 3). Ставки (то есть, ~0.4 мкмоль N2O m-2 h-1) может быть оценена путем сужения водной фазы основной выборки на высоту 8 см (см. Протокол шаг 4.2).

Рисунок 2 : Скорость вычисления денитрификации в эксперименте зависимость температуры. Показаны фактические ( и b) и потенциальные денитрификации измерения (fc–). Когда температура измерения является снижение (c), на первом образце остывает и сигнал датчика, который зависит от температуры, снижается. () A аналогичные событие происходит в начале инкубации в измерении фактических денитрификации; теплее лабораторной среде в отношении условий инкубации производит охлаждение образца, снова сопровождается снижением сигнал датчика. (e) когда температура увеличивается, сначала теплой образцы и сигнал датчика увеличивается экспоненциально вместо линейно. Когда образцы достигают постоянной температуры, датчик сигнала увеличивается линейно, как обычно. Во всех случаях это можно рассчитать показатели денитрификации просто используя период линейного N2O накопления (b, dи f). (b) неактивные образца 3 не отображается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Примеры денитрификации оценить расчеты. Были оценены фактические () и потенциальные показатели денитрификации (b и c). Мы только использовали диапазон времени с линейной накопления N2O для расчета ставки денитрификации (наклон линейной модели). Однако, в () для образовательных целей, мы показываем все измерения (модели) с более и менее успех; Мы бы отбросить образца 3 из-за высокой нестабильности датчика и пример 2 из-за насыщения в N2O накопление. () образцы, 4 и 5 с коэффициентом 0,5 и 0,7 мкмоль N2O m-2 h-1, соответственно, являются случаи измерений вблизи предела обнаружения метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.