Здесь мы представляем технику инъекций непосредственно Интратекальное, с использованием 1% лидокаина гидрохлорида в вирусного решение для обеспечения эффективного аденоассоциированный вирус доставки мелких животных и создать систему скоринга для прогнозирования эффективности трансдукции в Центральной нервной системы по степени переходных слабость, вызванных лидокаина.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Непосредственный впрыск Интратекальное рекомбинантного адено связанные вирусов у взрослых мышей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Интратекальное (ИТ) для инъекций аденоассоциированный вирус (AAV) привлекла большой интерес в ЦНС генной терапии в силу его безопасность, неивназивности и отличные трансдукции эффективность в ЦНС. Предыдущие исследования продемонстрировали терапевтического потенции AAV-доставлены генной терапии нейродегенеративных расстройств, его администрации. Однако были зарегистрированы высокие темпы непредсказуемым отказа из-за технического ограничения ИТ-администрирования в мелких животных. Здесь мы создали систему скоринга для обозначения степени успех поясничный прокол в мелких животных, добавив 1% лидокаина гидрохлорида в инъекционного раствора. Далее мы покажем, что степень переходных слабость после инъекции может предсказать эффективность трансдукции AAV. Таким образом этот метод впрыска ИТ может использоваться для оптимизации лечебные испытания в моделях мыши ЦНС заболеваний, которые поражают широким регионов центральной нервной системы.
Введение
AAV может посредничать экспрессии генов долгосрочный и широко распространенных в ЦНС трансдукция с несколько побочных эффектов и таким образом стал одним из наиболее перспективных транспортных средств для генной терапии для лечения заболеваний ЦНС, включая боковой амиотрофический склероз (ALS), Хантингтон болезнь (HD), болезни Альцгеймера (AD), хранения лизосомных заболеваний (ЛСД), болезнь Гоше (GD) и нейрональных цероид lipofuscinosis (NCL)1. В настоящее время более чем 100 AAV серотипов были изолированы от людей и животных. Среди них, по крайней мере 12 были использованы в доклинических и клинических испытаний, в том числе наиболее часто исп....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
FVB/NJ мышей были разведены в объекте животных ключ лаборатории неврологии Хэбэй. Все мыши эксперименты были утверждены второй больницы из провинции Хэбэй медицинского университета этики Комитетом и осуществляется согласно положениям о лабораторных животных управления, принятые министерством науки и техники Китайской Народной Республики Китай.
1. Подготовка 20% раствор лидокаина гидрохлорид
- Весят 2 г лидокаина гидрохлорида. Добавьте 5 – 6 мл стерильной воды и вихревой мягко. Увеличьте громкость в общей сложности 10 мл стерильной водой.
- 1.2 фильтр Стоковый раствор через фильтры 0,2 мкм. Алиготе Стоковый раствор, 1 мл на 1....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мышей показал разной степени переходных слабость сразу после его инъекционного раствора AAV лидокаина гидрохлорид 1% из-за различных качества Интратекальное инъекции. Согласно полуколичественного 5-класс скоринговая система мы создали, мы протестировали трансдукции шаблоны AAV мышей с разной степенью лидокаин индуцированной конечности слабость (оценка 0, n = 2; Оценка 1, n = 1; Оценка 4, n = 4; Оценка 5, n = 3). EGFP иммуноокрашивания спинной мозг показал нет или мало трансдукции поясничн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Технически есть несколько критических шагов во время инъекции IT проснулись мышей. Во-первых, надлежащий контроль жест и фирма мышей на протяжении всей операции является необходимым условием для успешной доставки. Во-вторых самые сложные точки чувство межпозвонкового пространства с кончика иглы, как это не нужно вставить слишком глубоко без сопротивления или принудительно вставить под сильное сопротивление в случае ранения животных или изгиб кончик иглы. В-третьих хотя временный паралич благодаря лидокаина обеспечивает о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа финансировалась грант от ХЭБЭЙ провинций Департамент людских ресурсов и социального обеспечения (CY201605) и гранта от фонда естественных наук провинции Хэбэй (H2017206101), и мы очень благодарны доктора для ГАО Гуанпин, которые предоставили AAV для Это исследование.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| FVB/NJ мыши | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV Вирусный вектор Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | |||
| 25 µ Л Шприц Hamilton/игла 27-30 G | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | ||
| сыворотка для коз | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 Разведение |
| второго антитела (козы-антикролика) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1,000 |
| Разведение VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Монтажная среда для флуоресценции с DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| 2PO4· 2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4· 12H2O | Yong Da Химический | ||
| параформальдегид | Yong Da Химический | 307699 | |
| адгезионный микроскоп Предметные стекла | CITOGLAS | 17083 | 25 мм x 75 мм |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Электромикроскопия | Размеры 72236-60 | 24 мм x 60 мм |
| 15 мл Центрифужная трубка | CORNING | 430790 | |
| 96 лунок кластер клеточных культур | Coster | 3599 | |
| 24 лунки кластер клеточных культур | Coster | 3524 | |
| 70% этанол | WEN ZHI | ||
| Марля | Wei AN | 05171112 | 8 см x 10 см x 12 см |
| 1 мл шприц | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | Наконечники eppendorf | ||
| Peppet Rainin | |||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Регератор | Haier | BCD-539WT | |
| Фильтр | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Насос | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Микроскоп | Olympus | BX53 | |
| Замораживающий микротом | Leica | CM1520 |
Ссылки
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
