Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Кристаллическая структура N-концевой домен рианодиновыми рецепторов от Plutella xylostella

6.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58568

⸱

30 ноября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Tianjin Key Laboratory for Modern Drug Delivery & High-Efficiency, Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering, School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, 2State Key Laboratory of Ecological Pest Control for Fujian/Taiwan Crops and Institute of Applied Ecology, Fujian Agriculture and Forestry University, 3Joint International Research Laboratory of Ecological Pest Control, Ministry of Education, Fuzhou, 4Fujian-Taiwan Joint Centre for Ecological Control of Crop Pests, Fujian Agriculture and Forestry University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы опишем протоколы протеина выражение, очистка, кристаллизации и структуры определения N-концевой домен рецептора рианодиновыми от diamondback моли (Plutella xylostella).

Аннотация

Разработка мощных и эффективных инсектицидов, ориентация насекомых рианодиновыми рецепторы (RyRs) был большой интерес в области сельскохозяйственными вредителями. На сегодняшний день, несколько diamide инсектициды против вредителей, которые освоено RyRs, которые генерируют годовой доход в 2 миллиарда долларов США. Но понимание действия инсектицидов, RyR ориентация ограничивается отсутствием структурной информации о насекомых RyR. Это в свою очередь ограничивает понимание развития резистентности к инсектицидам в вредителей. Бугорчатая моли (ДБМ) является разрушительных вредителей, уничтожив крестоцветных культур во всем мире, который поступили также показать резистентности к инсектицидам diamide. Таким образом она имеет большое практическое значение для разработки новых инсектицидов, ориентация RyR дБм, особенно ориентация региона отличается от традиционной diamide привязки сайта. Здесь мы представляем протокол для структурно характеристики N-концевой домен RyR от дБм. X-ray Кристаллическая структура была решена путем молекулярной замена с разрешением 2,84 Е, который показывает бета трилистник складной мотив и фланкируя альфа-спираль. Этот протокол может быть адаптирована для выражения, очистки и структурных характеристик других доменов или белков в целом.

Введение

Рианодиновыми рецепторы (RyRs) являются конкретные ионные каналы, которые посредником проникновение ионов Ca2 + через мембраны саркоплазматический ретикулум (SR) в мышечных клетках. Таким образом они играют важную роль в сокращении возбуждения муфты процесса. В своей функциональной формы, RyR собирает как гомо Тетрамер с молекулярной массой > 2 MDa, с каждого подразделения, состоящий из ~ 5000 аминокислотных остатков. В млекопитающих, существует три изоформ: RyR1 - скелетных мышц, типа RyR2 - сердечной мышцы и RyR3-повсеместно выражена в различных тканях1.

В насекомых существует только один тип RyR, который выражается в мышечной и нервной ткани2. Насекомое RyR больше похож на млекопитающих RyR2 с идентификатором последовательности около 47%3. Diamide инсектициды, ориентированные на RyR чешуекрылых и Coleoptera разработаны и продаются в крупных компаний, как Bayer (flubendiamide), DuPont (Хлорантранилипрол) и "Сингента" (cyantraniliprole). С момента своего запуска относительно недавно diamide инсектициды стали одним из быстро растущих класса инсектицидов. В настоящее время продажи этих трех инсектицидов ежегодно пересекли 2 миллиарда долларов США с темпами роста более чем на 50% с 2009 года (Agranova).

Недавние исследования сообщили развитие резистентности у насекомых после нескольких поколений использования этих инсектицидов4,5,6,,78. Сопротивление мутаций в трансмембранных доменов RyRs от diamondback моли (ДБМ), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) и соответствующие позиции в томатном яблонный, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) показывают, что регион могут быть вовлечены в diamide инсектицид привязки, как этот регион известен быть критическим для стробирования канала4,8,9. Несмотря на обширные исследования в этой области точные молекулярные механизмы diamide инсектицидов остаются недостижимой. Кроме того неясно, затрагивают ли мутации сопротивления взаимодействия с гидразиды прямо или allosterically.

Ранее проведенные исследования сообщили структуру нескольких доменов RyR от видов млекопитающих и структура полнометражных RyR1 млекопитающих и RyR2 рентгеноструктурного анализа и крио электронная микроскопия, соответственно10,11, 12,13,14,,1516,,1718,19,20,21 . Но пока что, нет структуры насекомых RyR сообщалось, который запрещает нам понимание молекулярных тонкости функции рецепторов, а также молекулярные механизмы действия инсектицидов и развития резистентности к инсектицидам.

В этой рукописи мы представляем обобщенных протокол для структурной характеристики N-терминальный β-трилистник домена рецептора рианодиновыми от моли diamondback, разрушительных вредителей, заражая крестоцветных культур во всем мире22. Конструкция была разработана согласно опубликованной кролик RyR1 NTD кристалл структур23,24и крио EM структурной модели16,,1718,19, 20 , 21. это первый разрешением структура для насекомых RyR, который раскрывает механизм для стробирования канала и предоставляет шаблон важные для развития вегетационных инсектицидов, с использованием проектирования на основе структуры наркотиков. Для разяснения структуры мы заняты рентгеноструктурного анализа, который рассматривается как «золотой стандарт» для определения структуры белка в вблизи атомных резолюции. Хотя процесс кристаллизации является непредсказуемым и трудоемкий, этот шаг за шагом протокол поможет исследователям выразить, очищают и в целом характеризуют другие домены насекомое RyR или любые другие белки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. клонирование гена, выражение протеина и очистки

  1. PCR усиливает ДНК, соответствующий протеин интереса (остатки 1-205 дБм RyR, Genbank соотв. нет. AFW97408) и клонов в ПЭТ 28a-HMT вектор клонирования перевязка-независимые (LIC)25. Этот вектор содержит гистидина, MBP тег и сайт расщепления протеазы ТэВ на N-го15.
    1. Дизайн LIC Праймеры для амплификация гена целевой с LIC-совместимых 5' расширений:
      Форвард LIC грунт:
      5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3'
      Обратный LIC грунтовка:
      5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'
    2. Объединить компоненты реакции (50 мкл): 1 мкл ДНК шаблонов (100 нг/мкл), 1 мкл вперед праймера (10 мкм), 1 мкл обратного праймера (10 мкм), 0.5 мкл ДНК полимеразы (нос), 5 мкл реакции 10 x буфер, 1 мкл dNTP (25 мм) , 40,5 мкл РНКазы бесплатно ddH2O.
      1. Поместите смесь реакции в машину ПЦР и запускать следующую программу.
      2. Инкубируйте на 95 ° C в течение 3 мин, а затем запустить 30 циклов (95 ° C за 30 сек, 58 ° C 15 s, 72 ° C в течение 1 мин). Инкубируйте на 72 ° C за 5 мин и затем провести на 4 ° C.
      3. Запуск всего реакция смеси (50 мкл) на 2% агарозном геле и извлекать с комплектом извлечения геля. Следуйте производителя протокол.
    3. Перевязка независимые клонирования (LIC)
      1. Выполнять SspI пищеварения (60 мкл): 20 мкл дна вектора (50 нг/мкл), 6 мкл 10 x буфер реакции, 4 мкл SspI и 30 мкл ddH2O. инкубировать при 37 ° C для запуска всего реакция 3 h. mix на гель агарозы 1% и извлекать с комплектом извлечения геля. Следуйте производителя протокол.
      2. Проводить лечение T4 полимеразы дна вектора и вставьте ДНК. Объединить следующее: 5 мкл вектор или Вставка ДНК (50 нг/мкл), 2 мкл 10 x T4 ДНК-полимеразы буфера, 1 мкл dGTP (25 мм) для вектора или 1 мкл дЦТФ (25 мм) для вставки ДНК, 1 мкл DTT (100 мм), 0,4 мкл T4 ДНК полимеразы (уточненное LIC) и 9.6 мкл ddH2O. инкубировать реакций при комнатной температуре за 40 мин, тепло инактивирует фермент на 75 ° C в течение 20 мин.
        Примечание: LIC вектор и вставка ДНК должны рассматриваться в отдельном реакциях.
      3. Выполните LIC, отжиг реакции. Объединить следующее: 2 мкл лечение T4 Вставка ДНК, 2 мкл лечение T4 LIC вектор ДНК. Инкубируйте реакции при комнатной температуре в течение 10 мин.
  2. Трансформировать BL21 (DE3) E. coli клетки с этой рекомбинантных плазмид.
    1. Оттепель сведущие клетки (50 мкл в микро пластиковых пробирок) на льду.
    2. Добавить примерно 1 мкл (50 нг) плазмидной в трубу. Смешайте клетки и ДНК, нежно стряхивая трубки 2 – 3 раза. Место труб на льду за 20 мин.
    3. Тепло шок при 42 ° C 40 s. место трубки на льду снова добавить по 1 мл 2 мин комнатной температуре LB СМИ к трубе.
    4. Место смесь трубки в шейкер 250 об/мин при 37 ° C на 45 мин распространение 150 – 200 мкл смеси на выбор плит. Инвертировать пластину и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  3. Выберите один колонии и культуры клетки в 100 мл 2YT среде, содержащей 50 канамицин мкг/мл при 37 ° C на ночь. Следующее утро, прививать 1 Л 2YT среде, содержащей 50 мкг/мл канамицин с 10 мл на ночь культуры и инкубировать в 37 ° C шейкер инкубатор на 250 об/мин, до тех пор, пока ОД600 достигает ~ 0,6. После этого вызвать культуры с IPTG до конечной концентрации 0,4 мм и расти еще 5 ч на 30 ° C.
  4. Урожай клетки центрифугированием в 8000 x g 10 мин при температуре 4 ° C, собирать клетки и клетки каждые 10 г в 40 мл буфера lysis (10 мм HEPES рН 7,4, 250 мм KCl, β-меркаптоэтанол 10 мм, 25 мкг/мл лизоцима, 25 мкг/мл DNase Ресуспензируйте 1 мм PMSF).
    1. Срывать его, sonication на 65% амплитуды на 8 мин с 1 s на и 1 s выкл. Удалите мусор клетки центрифугированием на 40000 x г за 30 мин при 4 ° C. Фильтр супернатанта, проходя через 0,22 мкм фильтр и загрузить его в пример цикла.
  5. Очистить протеин сплавливания, Клив тег и повторно очищают целевого белка.
    1. Очистить протеин сплавливания с помощью Ni-НТА столбца (привязки буфера: 10 мм HEPES рН 7,4, 250 мм KCl; Элюирующий буфер: 10 мм HEPES рН 7,4, 250 мм KCl, 500 мм имидазола) и очистить системой очистки, с помощью линейного градиента имидазола 20 – 250 мм.
    2. Рассекающий удар eluted целевого белка с ТэВ протеазы (1:50 соотношение) на ночь при 4 ° C.
    3. Очистить смесь реакции расщепления с помощью столбца амилоза смолы (привязки буфера: 10 мм HEPES рН 7,4, 250 мм KCl; Элюирующий буфер: 10 мм HEPES рН 7,4, 250 мм KCl, мальтоза 10 мм) и столбец Ni-НТА удалить тег и ТэВ протеазы. Целевого белка будет в проточную часть этих двух столбцов.
    4. Dialyze образец против диализа буфера (10 мм трис-HCl рН 8,8, 50 мм KCl, β-меркаптоэтанол 10 мм для уменьшения концентрации соли. Очищение образца на анион обменной колонны (привязки буфера: 10 мм трис-HCl рН 8,8, 10 мм β-меркаптоэтанол; Элюирующий буфер: 10 мм трис-HCl рН 8,8, 1 M KCl, 10 мм β-меркаптоэтанол) линейный градиент 20 – 500 мм KCl в Элюирующий буфер.
    5. В качестве последнего шага в процессе очистки концентрат белка, используя концентратор центробежные (10 кДа MWCO) и вставляют Superdex 200 26/600 лари фильтрации столбца для проверки однородности.
  6. Проверьте чистоту белка, запустив его на 15% SDS страницы.
    Примечание: Все столбцы запущены на систему очистки белков с 2 мл/мин скорость потока привязки и скорость потока элюции 4 мл/мин за исключением гель фильтрации в 1 мл/мин.

2. белка подготовка и кристаллизации

  1. Концентрат очищенный протеин образца до 10 мг/мл, используя концентратор центробежные (10 кДа MWCO) и буфер обмена кристаллизации буфер перед сохранением на-80 ° C.
  2. Выполнить проверки кристаллизации (соотношение 1:1, 200 nL белков и 200 nL водохранилище буфера), сидя падение метод диффузии паров на 295 K с несколькими кристаллизации наборы, с помощью автоматизированных жидкости, робототехнические системы в формате 96-луночных обработки.
    Примечание: Мы использовали наборы от молекулярных размеров и Hampton исследований и грифона автоматизированной системы обработки жидких.
  3. Уплотнение 96-луночных кристаллизации пластины для предотвращения испарения и позволить уравновешивания белка падение с буфером водохранилище. Затем сохраните пластины в инкубаторе кристалл на 18 ° C.
  4. Проверьте 96-луночных пластины, периодически с помощью световой микроскоп для мониторинга роста и формирования кристалла.
  5. Чтобы дифференцировать белковых кристаллов от кристаллов поваренной соли, используйте краска белка. 1 мкл красителя, падение целевой. Подождите около 1 h и наблюдать под микроскопом. Кристаллы белка будет синим.
  6. Используйте положительные кристаллизации условия (сульфат аммония 1,5 М, 0,1 М трис pH 8.0) для дальнейшей оптимизации кристаллы, используя висит drop метод диффузии паров в 24-ну пластины.
    1. Оптимизируйте pH от 7,0 до 8,5 с 0,5 рН единичный интервал каждый шаг. Оптимизируйте концентрации сульфата аммония от 1,2 М до 1,7 М с интервалом 0,1 М каждый шаг. (В нашем случае лучшие условия производства крупных кристаллов, плита образный был сульфат аммония 0,1 М HEPES pH 7.0 и 1.6 М)

3. Монтаж, кристалл рентгеновские сбора данных и определения структуры

  1. Монтировать кристаллы в cryoloop и флэш прохладно в жидком азоте с помощью водохранилище раствора, содержащего 20% глицерин как крио Протравитель. Место кристаллы в unipuck для хранения и транспортировки.
  2. Предварительно просматривать белковых кристаллов с помощью Rigaku доме рентгеновского diffractor. Выберите лучшие из них с высоким резолюций для сбора данных на объектах синхротрона (наш набор данных была собрана из BL17U1 в Шанхае синхротронного излучения).
    1. Используйте программное обеспечение для контроля излучение BluIce26 монтировать и центр кристаллы функцией автоматической или ручной центрирования. Выполните тест воздействия для определения стратегии сбора данных, включая начиная угол, выдержка, детектор расстояния, ширина кадра и чисел.
    2. Сбор данных соответственно (мы собрали 180 кадры с 1 s выдержка, ширина кадра 1° и детектор расстояние 350 мм).
  3. Индекс, интегрировать и масштаб dataset с помощью HKL2000 люкс27. Сначала выполняют функцию поиска пик найти дифракции пятна и затем индекс пятна и выберите группу правой пространства. После интеграции пик масштаб набор данных с моделью надлежащего ошибки и сохраните файл вывода .sca.
  4. Решить проблему фазы, молекулярные замены с помощью Phaser28 в Феникс29.
    1. Вычислите количество белковых молекул в группе асимметричных копии Xtriage30.
    2. Посмотрите для надлежащей структуры шаблонов с высокой последовательности идентичности и структурно сходство как целевого белка, используя известные структуры из литературы или модели, создаваемые сервером Предсказание структуры таких Phyre231 (мы использовали кролик RyR1 NTD как Поиск модели, PDB ID 2XOA).
    3. Запустите Phaser, используя файл данных дифракции, шаблон структуры файла и файл последовательности белка найти решение.
  5. Выполните автосборки32 в Феникс29 для создания первоначальной модели с помощью выходного файла от Phaser и файл последовательности от целевого белка.
  6. Создание структуры в модифицированных экспериментальной электронной плотности, используя Лысуха33 и уточнить с помощью phenix.refine34 в итерационные циклы вручную.
  7. Проверка конечной модели, с помощью средств проверки в PHENIX18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Очистка

N-концевой домен дБм RyR была выражена как синтез белка с hexahistidine тегов, тег MBP и ТэВ протеазы расщепления сайта. Мы последовали за пять этапов очистки стратегию для получения чистого белка, подходит для цели кристаллизации. Во-первых синтез белка был очищен от растворимая фракция lysate клетки по колонке Ni-НТА (HisTrap HP). Далее синтез белка был подвергнут ТэВ протеазы расщепления и hexahistidine-MBP остаток был у...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье мы описать процедуру recombinantly выразить, очищают, кристаллизация и определить структуру дБм RyR NTD. Для кристаллизации важнейшее требование заключается в получении белки с высокой растворимости, чистоты и однородности. В нашем протокол мы решили использовать ПЭТ 28a-HMT вектор, как он содержит тег hexahistidine и тег ПМБ, оба из которых могут быть использованы для очистки для получения более высокой чистоты раза. Кроме того тег MBP СПИДа в растворимость целевого белка. Мы очищенный протеин пять последо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Финансирование этого исследования была предоставлена: Национальный исследовательский ключ и Программа развития Китая (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), национальный характер науки фонд Китая (31320103922, 31230061) и программа проекта национальных фундаментальных исследований (973) Китай (2015CB856500, 2015CB856504). Мы благодарны сотрудникам на излучение BL17U1 на объекте Шанхай синхротронного излучения (SSRF).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pET-28a-HMTЭтот модифицированный вектор pET содержит метку гексахистидина, гибридный белок MBP и сайт расщепления протеазы TEV на N-конце (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli штамм BL21 (DE3) Novagen69450-3CN
HisTrapHP колонка (5 мл)GE Healthcare45-000-325
колонка амилозной смолыNew England BiolabsE8021S
Q Высокопроизводительная колонка для сефарозы GE Healthcare17-1154-01
Концентраторы Amicon (10 кДа MWCO)МиллипороваяUFC901008
Superdex 200 26/600 гелевая фильтрационная колонна GE Healthcare28-9893-36
Автоматизированная роботизированная система для работы с жидкостями Art Robbins InstrumentsGryphon
96 Well CrystalQuickGreiner bio-one82050-494
Uni-PuckMolecular DimensionsMD7-601
Mounted CryoLoop - 20 микронHampton ResearchHR4-955
CryoWandMolecular DimensionsMD7-411
Инструмент для зарядки шайбыМолекулярный РазмерыMD7-607
Nano dropThermo ScientificNanoDrop One
Crystal инкубаторМолекулярные размерыMD5-605
Рентгеновский дифракторRigakuFRX
ПЦР аппаратEppendorfNexus GX2
Plasmid мини-набор для подготовкиQiagen27104
Экстракция гелем наборQiagen28704
SspI рестрикция эндонуклеазаNEBR0132S
T4 ДНК-полимеразаNovagen2868713
KanamycinScientific Chemical25389940
IPTGGenview367931
&бета;-меркаптоэтанолGenview60242
ЦентрифугаThermo ScientificSorvall LYNX 6000 
SonnicatorScientzII-D
Система очистки белкаGE HealthcareAkta Pure
Light микроскопNikonSMZ745
IzIt кристаллический красительHampton ResearchHR4-710
Установка для электрофорезаBio-Rad1658005EDU
Шейкер ИнкубаторZhichengZWYR-D2401
Индексный кристаллический экранHampton ResearchHR2-144
Структура кристаллического экранаМолекулярные размерыMD1-01
Кристаллический экран ProPlexМолекулярные размерыMD1-38
PACT главный кристаллический экранМолекулярные размерыMD1-29
JCSG-plus кристаллический экранМолекулярный РазмерыMD1-37
Вектор HEPES Genview 7365459

Ссылки

  1. Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
  2. Takeshima, H., et al. Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster. FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).
  3. Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals. Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).
  4. Steinbach, D., et al. Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).
  5. Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China. Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).
  6. Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).
  7. Guo, L., et al. Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole. Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).
  8. Troczka, B., et al. Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).
  9. Roditakis, E., et al. Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).
  10. Borko, L., et al. Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).
  11. Sharma, P., et al. Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor. FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).
  12. Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface. Nature Communications. 4, 1506(2013).
  13. Lau, K., Van Petegem, F. Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain. Nature Communications. 5, 5397(2014).
  14. Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
  15. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
  16. des Georges, A., et al. Structural Basis for Gating and Activation of RyR1. Cell. 167 (1), 145-157 (2016).
  17. Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).
  18. Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science. 354 (6310), (2016).
  19. Wei, R. S., et al. Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1. Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).
  20. Yan, Z., et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).
  21. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  22. Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects. Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).
  23. Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
  24. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
  25. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
  26. Stepanov, S., et al. JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).
  27. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  30. Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation. CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).
  31. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  32. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).
  33. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  35. Lin, L., et al. Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).
  36. Qi, S., Casida, J. E. Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

cabbage moth diamondback mothSDS PAGE
Кристаллическая структура N-концевой домен рианодиновыми рецепторов от Plutella xylostella
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.