Анализ динамики actomyosin на местных сотовых и тканевых весов использованием покадровой фильмы культурных Дрозофила яйцо камер

Ivana Viktorinová; Robert Haase; Tobias Pietzsch; Ian Henry; Pavel Tomancak

doi:10.3791/58587

Методическая статья

Анализ динамики actomyosin на местных сотовых и тканевых весов использованием покадровой фильмы культурных Дрозофила яйцо камер

DOI:

10.3791/58587

⸱

3 июня 2019 г.

Ivana Viktorinová¹^,² , Robert Haase^*¹^,² , Tobias Pietzsch^*¹^,² , Ian Henry¹^,² , Pavel Tomancak¹^,²

¹Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, ²Center for Systems Biology Dresden

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обеспечивает основанную на Фиджи, удобную методологию наряду с простыми инструкциями, объясняющие, как надежно анализировать поведение актомиозина в отдельных клетках и изогнутых эпителиальных тканях. Нет навыков программирования не требуется, чтобы следовать учебник; все шаги выполняются в полуинтерактивной манере с использованием графического пользовательского интерфейса Фиджи и связанных с ними плагинов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дрозофилы незрелые яйца называются яичными камерами, и их структура напоминает примитивные органы, которые претерпевают морфологические изменения от круглой до эллипсоидной формы во время развития. Этот процесс развития называется oogenesis и имеет решающее значение для генерации функциональных зрелых яиц для обеспечения следующего поколения мух. По этим причинам яичные камеры служили идеальной и соответствующей моделью для понимания развития органов животных.

Было разработано несколько протоколов по культивированию in vitro, но в этих протоколах есть несколько недостатков. Один включает в себя применение различных охватывает, которые оказывают искусственное давление на изображения яичных камер для того, чтобы обездвижить их и увеличить изображение плоскости приобретения окружной поверхности проанализированных яичных камер. Такой подход может негативно повлиять на поведение тонкого актомиозина, который генерирует способность вращать яичные камеры вокруг своей более длинной оси.

Таким образом, чтобы преодолеть это ограничение, мы культуры Drosophila яичные камеры свободно в средствах массовой информации для того, чтобы надежно анализировать актомиозина машины вдоль окружности яичных камер. В первой части протокола мы предоставляем инструкцию с подробным описанием того, как анализировать актомиозиновое оборудование в ограниченной плоскости приобретения в локальном сотовом масштабе (до 15 ячеек). Во второй части протокола мы предоставляем пользователям новый плагин на основе Фиджи, который позволяет просто йодицию определенного тонкого слоя окружной поверхности яичных камер. Затем в следующем протоколе описывается, как анализировать сигналы актомиозина в масштабе ткани (Ят;50 клеток). Наконец, мы выявляем ограничения этих подходов как на локальном клеточном, так и в тканевом масштабе и обсуждаем его потенциальное будущее развитие и возможное применение.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Постоянное развитие новых технологий визуализации и программного обеспечения с применением в науке о жизни оказало огромное влияние на понимание основных принципов жизни. Одной из основных задач является надежная визуализация процессов развития в сочетании с их живой визуализацией в различных тканях. Ткани являются частями органов и органов, и, как таковые, большинство из них не легко доступны для визуализации. Таким образом, протоколы, которые позволяют их вскрытия и in vitro культивирования были разработаны для того, чтобы визуализировать биологические события, которые достаточно отражают in vivo ситуации в живом теле.

За последние десяти....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол содержит инструкции о том, как анализировать актомиозин в местной клеточной и ткани масштаба в дрозофилы яйцеклеток. Локальный подход позволяет пользователям анализировать детальное поведение актомиозина в 15 яйцеклетках на одну яичную камеру и требует приобретения TLMs в течение короткого периода времени (5–10 мин) с помощью высокоскоростной визуализации и перевернутого конфокального микроскопа. В отличие от этого, шкала тканей предоставляет пользователям информацию о актомиозине в 50-100 клетках и требует приобретения TLMs в течение длительного периода времени (30 мин) с помощью низкоскоростной визуализации и ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол позволяет ученым исследовать поведение актомиозина сетей в эпителиальных тканях. Это возможно только тогда, когда подробный анализ поведения актомиозина в локальном клеточном масштабе (несколько клеток) сочетается с аналогичным анализом в масштабе тканей (многие клетки). Тем не менее, эпителиальные ткани часто изогнуты и извлечение тонкого слоя этих тканей ранее было не легко возможно, как показано в дрозофилы яичных камер (Рисунок 1). .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги и устранение неполадок для вскрытия и культивирования яичных камер

Если слишком много мух помещаются в небольшой флакон, муха пища может превратиться грязной после 2-3 дней из-за большого количества кормления личинок и взрослых мух попасть в ловушку в мухи пищи. В таком случае, переверните остальные мухи в новый флакон со свежей пищей и уменьшить их количество. В частности, исключить женщин, которые застряли в пище.

Смесь Шнайдера (.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы очень благодарны Мириам Остерфилд для обмена ее советы по in vitro жизни изображения яичных камер, используя подход, принятый из лаборатории Селеста Берг⁴. Мы также благодарим Себастьяна Тоси за сценарий Фиджи, который позволяет сегментации клеток.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-глютамин
пенициллин/стрептомицин	Gibco	15140-122	[ +] 10.000 ЕД/мл пенициллина [+] 10.000 &м; г/мл стрептомицина
фетальная бычья сыворотка	sigma	F135	инактивированный при нагревании
человека	Sigma	I9278
50 мл трубки	Falcon Eppendorf		стерильный
фильтр Millex-GV Millipore		SLGV033NS	33 мм
Стеклянное дно Чашки Microwell	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 мм чашка Петри, 14 мм Microwell, No1.5 покровное стекло
Щипцы	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (краситель для клеточной мембраны)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (краситель для клеточной мембраны)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Предметное стекло для рассечения депрессии	Fisher Scientific	12-560B
<Стронг>Микроскопическое оборудование
Стеромикроскоп	, Zeiss		Stemi SV 6
Инвертированный конфокальный микроскоп	например, Zeiss/Olympus
Вращающийся дисковый микроскоп	например, Zeiss/Andor
Микроскопическое стекло/покровное стекло	например, Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit иглодержатель	Колючка кактуса Hammacher	9160020
	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila использованные в рукописи
AX³/AX³; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			Подробнее см.: Rauzi et al.: Планарные поляризованные актомиозиновые сократительные потоки контролируют ремоделирование эпителиального соединения. Nature 2010, Vol. 468, стр. 1110-1115.
AX³/AX³; sqh-MRLC::GFP; fat2^58D/fat2^103C			Подробнее см. Viktorinova et al.: Вращению эпителия предшествует нарушение планарной симметрии актомиозина и защищает эпителиальную ткань от деформаций клеток. PLoS Genetics 2017, том 13, выпуск 11, стр. e1007107.

Раствор инсулина например, , ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).
Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S.....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Анализ динамики actomyosin на местных сотовых и тканевых весов использованием покадровой фильмы культурных Дрозофила яйцо камер

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи