Методическая статья

Анализ динамики actomyosin на местных сотовых и тканевых весов использованием покадровой фильмы культурных Дрозофила яйцо камер

DOI:

10.3791/58587

⸱

3 июня 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2Center for Systems Biology Dresden

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обеспечивает основанную на Фиджи, удобную методологию наряду с простыми инструкциями, объясняющие, как надежно анализировать поведение актомиозина в отдельных клетках и изогнутых эпителиальных тканях. Нет навыков программирования не требуется, чтобы следовать учебник; все шаги выполняются в полуинтерактивной манере с использованием графического пользовательского интерфейса Фиджи и связанных с ними плагинов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дрозофилы незрелые яйца называются яичными камерами, и их структура напоминает примитивные органы, которые претерпевают морфологические изменения от круглой до эллипсоидной формы во время развития. Этот процесс развития называется oogenesis и имеет решающее значение для генерации функциональных зрелых яиц для обеспечения следующего поколения мух. По этим причинам яичные камеры служили идеальной и соответствующей моделью для понимания развития органов животных.

Было разработано несколько протоколов по культивированию in vitro, но в этих протоколах есть несколько недостатков. Один включает в себя применение различных охватывает, которые оказывают искусственное давление на изображения яичных камер для того, чтобы обездвижить их и увеличить изображение плоскости приобретения окружной поверхности проанализированных яичных камер. Такой подход может негативно повлиять на поведение тонкого актомиозина, который генерирует способность вращать яичные камеры вокруг своей более длинной оси.

Таким образом, чтобы преодолеть это ограничение, мы культуры Drosophila яичные камеры свободно в средствах массовой информации для того, чтобы надежно анализировать актомиозина машины вдоль окружности яичных камер. В первой части протокола мы предоставляем инструкцию с подробным описанием того, как анализировать актомиозиновое оборудование в ограниченной плоскости приобретения в локальном сотовом масштабе (до 15 ячеек). Во второй части протокола мы предоставляем пользователям новый плагин на основе Фиджи, который позволяет просто йодицию определенного тонкого слоя окружной поверхности яичных камер. Затем в следующем протоколе описывается, как анализировать сигналы актомиозина в масштабе ткани (Ят;50 клеток). Наконец, мы выявляем ограничения этих подходов как на локальном клеточном, так и в тканевом масштабе и обсуждаем его потенциальное будущее развитие и возможное применение.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Постоянное развитие новых технологий визуализации и программного обеспечения с применением в науке о жизни оказало огромное влияние на понимание основных принципов жизни. Одной из основных задач является надежная визуализация процессов развития в сочетании с их живой визуализацией в различных тканях. Ткани являются частями органов и органов, и, как таковые, большинство из них не легко доступны для визуализации. Таким образом, протоколы, которые позволяют их вскрытия и in vitro культивирования были разработаны для того, чтобы визуализировать биологические события, которые достаточно отражают in vivo ситуации в живом теле.

За последние десятилетия культивирование и живое изображение яичных камер Дрозофилы, ацинар-подобных структур, напоминающих примитивные органы, внесло огромный вклад в понимание основных принципов развития примитивных органов1 , 2 , 3. В настоящее время существует несколько протоколов культивирования, и их использование зависит от времени приобретения, типа ячейки, подимеющейся на изображении, и их доступности (например, внутренней зародышевой линии против внешней соматической линии)4.

Общей чертой во всех этих протоколах культивирования является необходимость иммобилизации проанализированных яичных камер, которые отображают высокую сократительую активность в жидких носителях. Сократительная активность яичных камер вызвана главным образом мышечным листом, который покрывает длинную строку подключенных яичных камер5,6,7. Таким образом, для достижения надлежащей иммобилизации молодых яичных камер,различные подходы были разработаны, с участием покрытия яичные камеры с крышками 6,8,9 или гибкие одеяла4, 10 или встраивание их в низкоплавительную точку агарозы3,11. Эти подходы популярны, поскольку они также позволяют изображения большего визуального плана из-за тонкого уплощения окружной поверхности яичных камер.

Однако, недавно, было показано, что молодые яичные камеры (этап 1-8) вращаются вокруг их передней задней оси6 и что это движение ткани питается от тонкой сети актомиозина близко к окружной поверхности этих молодых яичных камер 12. Таким образом, искусственное изменение клеточной поверхности, вызванное тонким уплощением этой ткани, может негативно сказаться на поведении силового актомиозина. Контрапункт заключается в том, что если ткань яичной камеры не сплющена, микроскопическая визуализация белков на окружной поверхности яичных камер становится еще более ограниченной уменьшением размера плоскости приобретения.

Таким образом, мы объединили протоколы от Prasad et al.9 и лаборатории Селеста Берг4,10 и далее модифицировали их так, чтобы в разработанном методе не использовалось покрытие/гибкое одеяло/агароз. Дрозофилы яичные камеры свободно культивируются в средствах массовой информации и протокол, представленный здесь применяется только перевернутая микроскопия. Протокола две части. Первая часть сосредоточена на анализе сигналов атомиозина в локальном клеточном масштабе (до 15 клеток) в яйцеклетках. Во второй части мы фокусируемся на преодолении ограничений, связанных с небольшой плоскостью приобретения, вызванной бесплатной культивированием яичных камер. В этой связи мы разработали новый фиджийский вычислительный метод с полуинтерактивным графическим пользовательским интерфейсом, который выборочно извлекает и разворачивает определенные слои поверхности окружной ткани. За этим следует протокол, который описывает, как анализировать актомиозин в масштабе ткани (т.е. клетки. Поскольку селективная экстракция определенного тонкого слоя изогнутых эпителиальных тканей не была легковозможна с помощью классической проекции z-стека(рисунок1), этот простой в использовании метод служит важным условием для всестороннего понимания поведение тонкой (злт;1 мкм) сети актомиозина в масштабе ткани в яйцеклетках Drosophila.

Кроме того, для облегчения протокола, мы предоставляем пример замедленного фильмов (TLMs) и образцы файлов флуоресцентно помечены немышечной обычного поведения Миозина II (см. Дополнительный файл 3). Миозин II является моторным белком и представляет собой активную сократителемую часть актомиозина. Для того, чтобы изображение Myosin II, мы используем Drosophila трансгенных линий, которые содержат модифицированные нормативные световой цепи Myosin II называется MRLC::GFP (см. Таблица материалов для деталей)12,13. Для визуализации клеточных мембран протокол основан на коммерческих красителей (см. ТаблицуМатериалов). Этот протокол подходит не только для анализа малых субклеточных MRLC: GFP сигналы12, но и для любых аналогичных размеров субклеточных частиц вокруг 300 мкм, таких, как те, которые наблюдаются с Life-Act::GFP12,14.

Хотя оба эти протоколы представлены с использованием in vitro культивированных камер дрозофилы яйцо, приобретение сигналов actomyosin также может быть выполнена с использованием других тканей на оптимизацию культивирования средств массовой информации и в зависимости от наличия либо флуоресцентно помеченных белков с соответствующими коммерческими красителями или, например, микроинъекций мРНК для получения преходящих профилей экспрессии генов. Аналогичным образом, фиджийский протокол для извлечения тонкого слоя из окружной поверхности может быть применен в более общем плане к эллипсоидным и органоподобным тканям.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол содержит инструкции о том, как анализировать актомиозин в местной клеточной и ткани масштаба в дрозофилы яйцеклеток. Локальный подход позволяет пользователям анализировать детальное поведение актомиозина в 15 яйцеклетках на одну яичную камеру и требует приобретения TLMs в течение короткого периода времени (5–10 мин) с помощью высокоскоростной визуализации и перевернутого конфокального микроскопа. В отличие от этого, шкала тканей предоставляет пользователям информацию о актомиозине в 50-100 клетках и требует приобретения TLMs в течение длительного периода времени (30 мин) с помощью низкоскоростной визуализации и перевернутого вращающегося дискового микроскопа (см. рисунок 2 и рекомендуемые параметры в каждой шкале в таблице 1). Решение о том, в каком масштабе анализировать сигналы актомиозина полностью зависит от научного вопроса пользователя. Сопровождаемые тестовые TLMs должны помочь принять это решение.

1. Местная клеточная шкала (LCS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вскрыть и изображение в пробирке культивированные камеры яйца Drosophila, следуйте протоколу, описанному в дополнительномфайле 1 . Для анализа приобретенных TLMs, продолжить со следующим протоколом. Ссылки на сопроводительные тестовые файлы TLMs предоставляются в дополнительном файле 3.

  1. Обработка данных TLMs в локальном сотовом масштабе (LCS)
    1. Отбеливатель коррекции TLMs, чтобы компенсировать интенсивность распада флуоресцентных этикеток
      1. Убедитесь, что современное приложение Фиджи устанавливается на компьютер, используемый, следуя этим инструкциям: Фиджи
      2. Разделите цветовые каналы, нажав на изображение
      3. Выполните коррекцию отбеливателя на обоих каналах с помощью изображения
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если получены неудовлетворительные результаты, исследуйте, какие методы коррекции в этом плагине лучше всего подходят (например, используйте Гистограмму соответствия вместо простого соотношения).
    2. Сегментация клеток для создания клеточной маски для TLMs
      1. Если Фиджи еще не открыта, вновь открыть его (и убедитесь, что он является актуальным) после Справка
      2. Если это еще не сделано, скачать макрос TissueCellSegmentMovie.ijm (из http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). Перетащите и падение этого сценария на Фиджи.
      3. Откройте исправленный файл TLM .tiff (см. раздел 1.1.1). Разделите каналы отбеливателя-исправленного файла с помощью изображения
      4. Запустите загруженный скрипт на активном мембранном канале ячейки выбранного TLM, нажав значок Run в открытом скрипте. Установите гауссианское размытие до 2.500 и чувствительность обнаружения клеток до -1 и нажмите OK. Для того, чтобы получить хорошую маску клетки, не меняйте эти параметры выше. Установите расчетную толерантность к шуму между 10-20 для TLMs, приобретенных с целью 63x и нажмите OK.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для других целей могут потребоваться различные параметры. Чем чище фон в TLM, тем ниже расчетная допуск к шуму.
      5. Сгенерированная клеточная маска появляется в анализируемом TLM, а также в новом окне под названием ParticleStack (G),и, кроме того, появляется маленькое окно под названием Action Required. Из клеточной маски на TLM, сосредоточиться только на клетках в центре TLM и выбрать те, которые могут обеспечить полный и четко определенные очертания по всему TLM.
      6. Если выбранные ячейки содержат искусственные/дополнительные контуры ячеек, используйте окно инструмента слияния под названием Action Required в TLM. Для последних следуйте инструкциям в окне.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что контуры клеток четко определены и соответствуют реальным клеточным мембранам в TLM, так как любая неточность может повлиять на последующий анализ. Дополнительные настройки и изменения, такие как удаление нежелательных ячеек, могут быть сделаны позже с помощью инструмента Surface manager (описано в разделе 1.1.3).
      7. Когда выбранные клетки в центре красиво соответствуют реальной клеточной мембраны, сохранить ParticleStack как файл .tiff следующие файла
    3. Загрузка генерируемой ячейки в Surface manager
      1. Установите Surface Manager Plugin15 в использованную установку Фиджи. Следуйте инструкциям Викториновой и др.16.
      2. Открытый Surface Manager с помощью плагинов (ru) и сегментации (3D).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Окно Surface manager отображает несколько кнопок действия справа и пустое окно слева. Чтобы увидеть все кнопки действия, может потребоваться растянуть окно в его высоте / ширине. Обратите внимание, что временные рамки будут отображаться как z-ломтики.
      3. Откройте соответствующий файл ParticleStack .tiff в Surface Manager, нажав файлику и выберите изображение для открытия (например, ParticlesStack1.tif).
      4. В Surface Manager щелкните кнопку изображения Прочитаного контура и установите индекс Jacquard до 60%.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка файла ParticlesStack1.tif может занять до нескольких минут, в зависимости от вычислительной мощности компьютера.
      5. После загрузки каждая ячейка будет назначена с номером S и появится в левой части окна диспетчера Surface.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы показать контуры и имена ячеек для всех ячеек, отметьте флажок Show all и отокажите флажки меток в нижней части окна surface manager. Рекомендуется использовать эту функцию, как только номера клеток были проверены на их правильность.
      6. Нажмите на первый номер S; импортированный контур ячейки из ParticlesStack1.tif отображается на TLM. Проверьте каждый импортированный номер S на качество контура ячейки на протяжении tLM и удалите нежелательные ячейки, отображающие неправильные контуры клеток. Для этого выделите контур ячейки и нажмите на кнопку Удалить.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно исправить неточные контуры клеток и добавить новые контуры клеток. Об этом говорится в разделе обсуждения.
      7. Сохраните все исправленные ячейки в виде файла RoiSet.zip, нажав кнопку «Сохранить на диске».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если сеанс необходимо прервать, можно загрузить файл RoiSet в Surface manager позже: открыть TLM на Фиджи (Файл и открыть)и выбрать TLM. Открытый менеджер поверхности через Плагины (ru) : сегментация (Sgt; Surface manager(3D). Загрузите соответствующий файл RoiSet.zip, нажав кнопку Load с диска и выбрав подходящий файл RoiSet.zip. Дважды проверьте, соответствуют ли загруженные маски клеток загруженным TLM.
    4. Коррекция для дрейфа тканей в TLMs
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время приобретения TLMs эффекты дрейфа могут наблюдаться из-за эпителиального вращения или нежелательного движения. В обоих случаях, мы рекомендуем исправить для любого дрейфа для того, чтобы упростить ручной анализ актомиозина позже. Корректировка дрейфа требуется только для ручного анализа актомиозина. Этот учебник требует современного программного обеспечения Фиджи с MultiStackReg Plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) установлен.
      1. Откройте отбеливатель-исправленный TLM на Фиджи через файл и откройте и выберите отбеливатель-исправленный файл, созданный с помощью учебника, упомянутого выше.
      2. Разделите каналы и выберите тот, который определяет клеточные мембраны с помощью изображения
      3. Используйте следующий протокол, когда контуры клеток не являются заметно гладкими: Процесс Установите его на 1-2 для цели 63x и нажмите OK, а затем да. Нажмите процесс ,gt; Двоичный йgt; Преобразование в маску с помощью настроек по умолчанию; затем нажмите OK.
      4. Загрузите MultiStackReg Plugin следующие Плагины
      5. Убедитесь, что Стек 1 установлен на канал клеточной мембраны, действие 1 настроено на выравнивание, а преобразование настроено на перевод. Проверьте чекбокс Файл преобразования, а затем нажмите OK.
      6. Повторно откройте выбранный TLM, MultiStackReg Plugin, и сохраненный файл преобразования с помощью файла и открыть и выбрать TLM. Разделите цветовые каналы, используя изображение
      7. Загрузите MultiStackReg Plugin, нажав на плагины Выберите файл преобразования нагрузки как действие 1.
      8. Оставьте Преобразование как жесткое тело и нажмите OK. Выберите ранее сохраненный файл трансформации и нажмите OK снова.
      9. Слияние каналов изображения и сохранить зарегистрированных TLM в качестве файла .tiff следующие изображения Сохранить файл, нажав файла (ru) сохранить как
        ПРИМЕЧАНИЕ: Есть альтернативные способы, чтобы исправить для ткани дрейфа на Фиджи, а именно через Плагины (ru)
  2. Анализ импульсов актомиозина в Surface manager в LCS
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап протокола позволяет ученым определить, присутствуют ли импульсы актомиозина в анализируемых тканях, и понять детальное поведение, а также направленность сигналов атомиозина.
    1. Откройте Фиджи и убедитесь, что TLM и соответствующая маска ячейки открыта в Surface manager.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что Фиджи установлен и актуален, а плагин Surface Manager (шаг 1.1.3.1).
    2. Откройте TLM с файлом и откройте и выберите TLM, чтобы открыть (например, TestMovie1'bleach.tif). Загрузите Surface менеджер Plugin через плагины (gt; Сегментация) Загрузите сохраненную маску ячейки, созданную в учебнике здесь (например, ParticlesStack1.tif) через файл и выберите маску ячейки (например, ParticlesStack1.tif). Загрузите соответствующий регион интереса (ROI, например, TestMovie1-RoiSet.zip). Смотрите рисунок 3A.
    3. Переключитесь на канал интереса к выбранной TLM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы различать каналы, следуйте цветовому коду, указанному вокруг TLM.
    4. В Surface Manager щелкните кнопку Статистика, чтобы получить окно под названием Среднее серое значение Slice by Slice (рисунок3B). Обратите внимание, что будут отображаться средние/средние значения интенсивности актомиозина в данном анализируемом канале в определенных контурах ячейки с течением времени, а также другие параметры, связанные с областью клетки и формой клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения интенсивности находятся в арбитражных единицах (A.U.); область ячейки находится в пикселях и должна быть преобразована в квадратные микрометры.
    5. Сохранить полученные значения в виде файла электронной таблицы. Нажмите на окно статистики, файл
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверить полученные статистические значения можно позже следующим образом: открыть tLM, исправленную отбеливателем, на Фиджи и открытый surface manager. Загрузите соответствующий RoiSet.zip в TLM, нажав на кнопку Load с диска и откройте файл. Сохраненная маска с контурами ячейки будет загружена, а имена ячеек будут отображаться в левом окне диспетчера Surface. Нажмите кнопку Статистика для статистических значений.
  3. Ручной анализ отдельных субклеточных атомиозиновых сигналов в LCS
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует наибольшей концентрации и занимает много времени. В общем, один приобретенный TLM может быть удобно проанализирован в течение 1 дня. Это не включает время для подготовки мухи до их вскрытия, само вскрытие и приобретение изображения.
    1. Откройте выбранную, отбеливающую и зарегистрированную (дрифт-исправленную) TLM в обновленном приложении Фиджи. В качестве примера теста используйте tLM, исправленный отбеливателем и дрифт-исправленным TLM (например, TestMovie1-bleach-reg.tif).
    2. Отрегулируйте яркость и контрастность, чтобы увидеть индивидуальные сигналы актомиозина с помощью изображения
    3. Выровняйте TLMs в том же направлении относительно оси ткани/тела. В случае яичных камер, выровнять переднюю сторону яичных камер всегда слева от изображения / submovie / TLM до анализа.
    4. Разделите выбранный фильм на короткие 30 субфильмов и временный проект каждого из них. Сохранить несвоевременно прогнозируемые и проецированные по времени субфильмы с соответствующими названиями. Храните исходный источник.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Submovies могут быть созданы из оригинальных TLMs путем первого удаления нежелательных кадров с помощью изображения Определите, чтобы срезы были удалены, и установите приращение. Преобразуйте в RGB перед использованием удаления среза при приращении No 1. Для времени-проект 30 s submovie, нажмите изображение Пропустите каждый второй 30 s submovie для того, чтобы избежать подсчета сигналов актомиозина 2x в двух последующих 30 s submovies.
    5. Поместите проецируемое во времени изображение рядом с соответствующим подфильмом 30 s(рисунок 4A,B). Определите сигнальную линию на проецируемом на время субфильме. Определите направление движения сигнала актомиозина (0–360 градусов) вдоль этой линии в оригинальном субфильме, вручную воспроизвовав субфильм. Используйте инструмент Угол (в баре Фиджи) вручную измерить направление движения сигнала относительно определенной оси ткани или аналогичного доступного инструмента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиджи работает только по шкале от 0 до 180 дюймов(рисунок 4C),и требуется перерасчет полученных значений по шкале от 0 до 360 градусов. Сигнальная линия соответствует траектории движения сигнала актомиозина с течением времени.
    6. Чтобы избежать дублирования при анализе сигналов атомиозина, отметьте анализируемые сигнальные линии в клетках в проецируемом на время субфильме(рисунок 4B,D).
    7. Проанализируйте все выбранные ячейки в подфильме 30 s и сохраните полученные углы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализировать только субклеточные цитоплазмические актомиозные сигналы в клетках с четко определенными клеточными очертаниями на протяжении TLM. Исключите отдельные клетки с менее чем 15-20 обнаруженными сигналами во всем TLM. Игнорировать сигналы атомиозина, которые перемещаются по клеткам из-за их неизвестного происхождения. Пример количества сигналов для одной исследуемой ячейки в подфильме 30 s показан на рисунке 4D.
    8. Продолжайте до тех пор, пока не будут проанализированы все 30 субфильмов одного TLM, и сохраните все измеренные углы атомиозиновых сигналов одного TLM в файле электронной таблицы.
    9. Суммируйте все измеренные углы по сравнению с соответствующим числом TLMs (в зависимости от эксперимента). Участок процент направления проанализированных сигналов актомиозина, например, в виде диаграммы розы с диапазоном от 0 до 360 "с предпочтительным программным обеспечением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения статистически значимых результатов рекомендуется проанализировать от пяти до десяти независимых яичных камер любой стадии яичной камеры.

2. Шкала тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вскрыть и изображение в пробирке культивированные камеры яйца Drosophila, следуйте протоколу в дополнительномфайле 2 . Для анализа приобретенных TLMs, продолжить со следующим протоколом ниже. Сопровождаемые тестовые файлы TLMs помещаются в дополнительный файл 3.

  1. Селективная поверхностная экстракция изогнутых эпителиальных тканей
    Примечание:Этот протокол позволяет пользователям выборочно извлекать тонкий слой актомиозина в изогнутой эпителиальной ткани с течением времени. Этот этап протокола удобен для пользователя и основан на интуитивно понятном графическом интерфейсе. Можно удобно проанализировать (экстракт поверхности) несколько TLMs. Использование TestMovie2.czi (отДополнительный файл 3) в качестве примера теста TLM.
    1. Открыть до современных приложений Фиджи ( Фиджи
    2. Убедитесь, что Ellipsoid Surface Projection Plugin15 установлен. Следуйте Викторинова идр. 16.
    3. Откройте TLM и экспортировать его в качестве файла XML/HDF5, нажав на плагины (BigDataViewer) и экспортировать текущий образ как файл XML/HDF5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется определить траекторию экспорта. Сохранение само по себе может занять несколько минут и зависит от длины TLM.
    4. Откройте экспортированный файл в Ellipsoid Поверхностная проекция, нажав на плагины (gt; BigDataViewer)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Появится новое окно с сагитальными видами яичной камеры и диалогом для руководства пользователем по обработке. Подробную информацию о том, как перемещаться в представлении срезов, можно найти в https://imagej.net/BigDataViewer.
    5. Окно диалога под названием «Проекция яичников» имеет несколько вкладок. В первой вкладке диалогов под названием Bounding box определите границы x и y яичной камеры в TLM вместе с шириной z ограничивающего ящика (т.е. глубина z-стек/яичной камеры) и набором нажатий (рисунок5A).
    6. Чтобы определить границы, перетащите кнопки рядом с x, y и z или определите координаты числа в коробках x, y и z. Убедитесь, что границы достаточно щедры, чтобы получить часть яичной камеры интереса в поверхности добычи. Выбранные части яичной камеры выделены розовым цветом.
    7. Переключитесь на вкладку под названием «Найти капли в проекции яичников окна». Определите сигму и минимальное пиковое значение; затем, нажмите вычислить для выявления сигналов актомиозина(Рисунок 5B), который будет отображаться как зеленые капли. Повторяй этот шаг с различными параметрами до тех пор, пока не будет найдено достаточное количество пятен (около 100).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Sigma 1'u20123 с минимальным пиковым значением 20 х u2012100 работает лучше всего для выявления атомиозина сигналов стадии-6 до -8 яичных камер. Выявление сигналов атомиозина является важным шагом и зависит от качества сигнала и его размера. Важно подтвердить правильный размер существующих капли. Отсутствие видимых зеленых пятен/blobs на изображении означает, что следующий шаг не будет работать. Просмотрите выбранные самолеты z, чтобы увидеть капли.
    8. Чтобы спроектировать эллипсоид, продолжайте со вкладкой под названием Fit ellipsoid. Установите случайные образцы до 10000, вне / внутри отсечения расстояние до 1'u201210, а затем, нажмите Вычислить (Рисунок5C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чем ниже расстояние отсечения, тем точнее будет желаемый эллипсоид. После этого вкладка под названием Projection автоматически откроется и позволяет определение поверхности извлечения. Настройки должны быть оптимизированы.
    9. Продолжить дальше с вкладкой называется проекция (Рисунок 5D). Наложите минимальное и максимальное расстояние проекции (т.е. ширину желаемого эллипсоида). Необходимо установить минимальное и максимальное расстояние проекции, чтобы розовый определенный эллипсоидный регион включает в себя весь внешний слой яичной камеры. Определите расстояние среза (рекомендуется 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры неправильной и оптимальной эллипсоидной подгонки, приводящей к неверным и оптимальным параметрам проекции, показаны на рисунке 6A,C. Тонкий окружной слой интереса может быть определен позже. Убедитесь, что розовая область эллипсоида с определенной шириной на яичной камере видна перед нажатием вычисления. Важно, чтобы желаемый эллипсоид (розовая одна линия) красиво вписывается в эллипсоидную поверхность яичной камеры для того, чтобы получить наилучшие результаты. Если эллипсоидная подгонка не очень хорошая, организуйте различные настройки до получения желаемой поверхности.
      1. Установите ширину выходного производства (800 фунтов) и высоту (400 фунтов) эллипсоида. Установить, от какого времени, в какой момент времени поверхности извлечения должны быть созданы (т.е., определить длину извлечения TLM). Выберите либо сферическую, либо цилиндрическую проекцию. При необходимости переверните и выровняйте Y.
      2. Нажмите вычислить для получения поверхности извлечения для обоих каналов в новых окнах под названием Image. Отрегулируйте яркость и контраст полученных окон изображения, чтобы иметь возможность увидеть прогнозируемые сигналы актомиозина, нажав на изображение, отрегулируйте яркость/ контрастность.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пример сравнения проекции в результате неправильной и оптимальной эллипсоидной припадок показан на рисунке 6B,D.
    10. Если извлечение поверхности выглядит хорошо, сохраните изображения (оба канала по отдельности) как .tiff. Кроме того, сохраните файл окна журнала для будущей ссылки на то, как была извлечена поверхность этой конкретной яичной камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это особенно важная информация, если извлеченный тонкий слой должен быть возвращен в исходную развернутую форму (только для разработчиков).
    11. Слияние каналов с предпочтительным цветовым кодом на Фиджи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости проект выбрал слои z-stack с актомиозином сигналов. Проекция выбранных слоев z-стека необходима, когда фокус приобретения несколько меняется с течением времени в TLM. Для достижения наилучших результатов проектирует не более одного-двух z-stack слоев.
    12. Сохранить результаты как файлы .tiff.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные примеры тонких слоев (селективная базальная и апикальная поверхность), представляющие сигнал Myosin II (MRLC:GFP) из эпителия фолликула управления и тудентовых яичных камер fat2.
  2. Обработка данных выборочно извлеченной поверхности ткани
    1. Отбеливатель-правильно TLMs для того чтобы компенсировать для распада интенсивности флуоресцентных ярлыков.
      1. Открыть Фиджи. Откройте TLM (например, TestMovie2'extraction.tif из дополнительного файла3) с помощью файла (rugt; Open. Выберите изображение, чтобы открыть его.
      2. Разделите цветовые каналы и преобразовать их в 16-битные изображения, если это необходимо, нажав изображение Преобразуйте каналы в 16-битные изображения (из 32-битных изображений) с помощью изображения
      3. Выполните коррекцию отбеливателя на обоих каналах с помощью изображения
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если получены неудовлетворительные результаты, необходимо изучить, какие методы коррекции в этом плагине подходят лучше всего (например, использовать Гистограмма Соответствие вместо простого соотношения).
      4. Слияние каналов из двух отбеливатель-исправленных изображений, нажав изображение Сохранить слияние изображения в виде файла .tiff, нажав файла
        ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте контраст и яркость для каналов.
    2. Сегментация клеток для создания клеточной маски для TLMs
      1. Если Фиджи еще не открыта, вновь открыть его (и убедитесь, что он является актуальным, нажав Справка
      2. Если это еще не сделано, скачать макрос TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Перетащите и падение этого сценария на Фиджи. Откройте исправленный файл отбеливателя (например, TestMovie2'bleach.tif из дополнительного файла 3, см. также 2.2.1).
      4. Разделите каналы отбеливателя-исправленного файла, нажав изображение Отрегулируйте мембранный канал, чтобы обеспечить четкие контуры клеток, нажав на изображение
      5. Запустите загруженный скрипт на активном мембранном канале ячейки выбранного TLM, нажав значок Run в открытом скрипте. Установите гауссианское размытие до 1.500. Установите чувствительность обнаружения ячейки до -1 и нажмите OK. Установите Ориентировочная допуск шума до 8 фунтов для TLMs, приобретенных с 40x целью и нажмите OK.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы получить хорошую маску клетки, не меняйте эти параметры выше. Для других целей могут потребоваться различные параметры. Чем чище фон в TLM, тем ниже расчетная допуск к шуму.
      6. Сгенерированная клеточная маска появляется в анализируемом TLM, а также в новом окне под названием ParticleStack (G). Кроме того, появляется небольшое окно под названием «Требуемое действие». Из клеточной маски на TLM, сосредоточиться только на клетках в центре TLM и выбрать те, которые могут обеспечить полный и четко определенные очертания по всему TLM.
      7. Если выбранные ячейки содержат искусственные/дополнительные контуры ячеек, используйте окно инструмента слияния под названием Action, требуемое в TLM. Для последних следуйте инструкциям в окне.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что контуры клеток четко определены и соответствуют реальным клеточным мембранам в TLM, так как любая неточность может повлиять на последующий анализ. Дополнительные настройки и изменения, такие как удаление нежелательных ячеек, могут быть сделаны позже с помощью инструмента Surface manager (описано в учебнике ниже).
      8. При выбранных клетках в центре красиво соответствуют реальной клеточной мембраны, сохранить ParticleStack как файл .tiff следующие файла Приступить к выполнению загрузки сгенерированной клеточной маски и анализа актомиозина в Surface Manager, как это было ранее выполнено в разделах 1.1.3 и 1.2 (также подробно описано в разделах 2.2.3 и 2.3).
    3. Загрузка генерируемой ячейки в Surface manager
      1. Если Surface Manager Plugin уже установлен в используемой установке Fiji, приступай к шагу 2. Если нет, следуйте Викториновой и др.16. Для разработчиков, только исходный код также доступен15.
      2. Открытый Surface Manager, нажав на плагины (gt; Сегментация) ( Surface manager (3D).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Окно Surface manager отображает несколько кнопок действия справа и пустое окно слева. Чтобы увидеть все кнопки действия, может потребоваться растянуть окно в его высоте / ширине. Обратите внимание, что временные рамки будут отображаться как z-ломтики.
      3. Откройте соответствующий файл ParticleStack.tif в Surface Manager через файл и выберите изображение, чтобы открыть (например, ParticleStack2.tif из дополнительного файла 3).
      4. В Surface Manager щелкните кнопку изображения Прочитаного контура и установите индекс Jacquard до 60%.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка файла ParticleStack.tif может занять до нескольких минут, в зависимости от мощности компьютера.
      5. После загрузки каждая ячейка будет назначена с номером S и появится в левой части окна surface manager(рисунок 7A).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы показать контуры и имена ячеек для всех ячеек, отметьте флажок Show all и отокажите флажки меток в нижней части окна surface manager. Рекомендуется использовать эту функцию, как только номера клеток были проверены на их правильность.
      6. Нажмите на первый номер S; импортированный контур ячейки из ParticleStack.tif отображается на TLM. Проверьте каждый импортированный номер S на качество контура ячейки на протяжении tLM и удалите нежелательные ячейки, отображающие неправильные контуры клеток. Для этого выделите контур ячейки и нажмите на кнопку Удалить.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно исправить неточные контуры клеток и добавить новые контуры клеток. Об этом говорится в разделе обсуждения.
      7. Сохраните все исправленные ячейки в виде файла RoiSet.zip, нажав кнопку «Сохранить на диске».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если сеанс необходимо прервать, можно загрузить файл RoiSet.zip в Surface manager позже: открыть TLM на Фиджи через файл и выберите TLM. Открытый менеджер поверхности следующим образом: Плагины (ru): Сегментация (SGT; Surface manager(3D). Загрузите соответствующий RoiSet.zip, нажав кнопку Load с диска и выбрав подходящий файл RoiSet.zip (например, TestMovie2-RoiSet.zip). Дважды проверьте, соответствуют ли загруженные маски клеток загруженным TLM.
  3. Анализ импульсов актомиозина у менеджера Surface
    ПРИМЕЧАНИЕ: Откройте Фиджи и убедитесь, что TLM и соответствующая маска ячейки открыта в Surface manager. Убедитесь, что Фиджи установлен и актуален, а также Surface Manager Plugin (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager).
    1. Откройте TLM с файлом и откройте и выберите TLM, чтобы открыть (например, TestMovie2'bleach.tif). Загрузите плагин Surface manager через плагины,gt; Сегментация (SGT; Surface manager(3D). Загрузите сохраненную маску ячейки, созданную в учебнике здесь (например, ParticlesStack2.tif) через файл и выберите маску ячейки (например, ParticlesStack2.tif). Загрузите соответствующую рентабельность инвестиций (например, TestMovie2-RoiSet.zip).
    2. Переключитесь на канал интереса к выбранной TLM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы различать каналы, следуйте цветовому коду, указанному вокруг TLM.
    3. В Surface manager щелкните кнопку Статистика, чтобы получить окно под названием Среднее серое значение Slice by Slice (рисунок7B). Обратите внимание, что будут отображаться средние/средние значения интенсивности актомиозина в данном анализируемом канале в определенных контурах ячейки с течением времени, а также другие параметры, связанные с областью клетки и формой клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения интенсивности находятся в A.U.; область ячейки находится в пикселях и должна быть преобразована в квадратные микрометры.
    4. Сохранить полученные значения в виде файла электронной таблицы: нажмите на окно статистики, файл
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверить полученные статистические значения можно позже следующим образом. Откройте отбеливатель-исправленный TLM на Фиджи. Менеджер open Surface. Загрузите соответствующий RoiSet.zip в TLM, нажав на кнопку Load с диска и откройте файл. Сохраненная маска с контурами ячейки будет загружена, а имена ячеек будут отображаться в левом окне диспетчера Surface. Нажмите кнопку Статистика для статистических значений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается ручного анализа отдельных субклеточных сигналов атомиозина,то невозможно провести ручной анализ субклеточных атомиозиновых сигналов в масштабе ткани. Оптимизация необходима для анализа индивидуальных сигналов атомиозина в полутканевом масштабе, как подчеркивается в разделе обсуждения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол позволяет ученым исследовать поведение актомиозина сетей в эпителиальных тканях. Это возможно только тогда, когда подробный анализ поведения актомиозина в локальном клеточном масштабе (несколько клеток) сочетается с аналогичным анализом в масштабе тканей (многие клетки). Тем не менее, эпителиальные ткани часто изогнуты и извлечение тонкого слоя этих тканей ранее было не легко возможно, как показано в дрозофилы яичных камер (Рисунок 1). ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги и устранение неполадок для вскрытия и культивирования яичных камер

Если слишком много мух помещаются в небольшой флакон, муха пища может превратиться грязной после 2-3 дней из-за большого количества кормления личинок и взрослых мух попасть в ловушку в мухи пищи. В таком случае, переверните остальные мухи в новый флакон со свежей пищей и уменьшить их количество. В частности, исключить женщин, которые застряли в пище.

Смесь Шнайдера (...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы очень благодарны Мириам Остерфилд для обмена ее советы по in vitro жизни изображения яичных камер, используя подход, принятый из лаборатории Селеста Берг4. Мы также благодарим Себастьяна Тоси за сценарий Фиджи, который позволяет сегментации клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Schneider MediumGibco21720-024[+]-глютамин
пенициллин/стрептомицинGibco15140-122 [ +] 10.000 ЕД/мл пенициллина [+] 10.000 &м; г/мл стрептомицина
фетальная бычья сывороткаsigma  F135инактивированный при нагревании
человекаSigma  I9278
50 мл трубкиFalcon Eppendorfстерильный
фильтр Millex-GV MilliporeSLGV033NS33 мм
Стеклянное дно Чашки MicrowellMatTek CorporationP35G-1.5-14-C35 мм чашка Петри, 14 мм Microwell, No1.5 покровное стекло
ЩипцыA. Dumont & Fils #55
CellMask Deep Red (краситель для клеточной мембраны)InvitrogenC10046
FM4-64 (краситель для клеточной мембраны)ThermoFisher/InvitrogenT13320
Предметное стекло для рассечения депрессииFisher Scientific12-560B
<Стронг>Микроскопическое оборудование
Стеромикроскоп, ZeissStemi SV 6
Инвертированный конфокальный микроскопнапример, Zeiss/Olympus
Вращающийся дисковый микроскопнапример, Zeiss/Andor
Микроскопическое стекло/покровное стеклонапример, Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit иглодержательКолючка кактуса Hammacher9160020
Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila использованные в рукописи
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFPПодробнее см.: Rauzi et al.: Планарные поляризованные актомиозиновые сократительные потоки контролируют ремоделирование эпителиального соединения. Nature 2010, Vol. 468, стр. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103CПодробнее см. Viktorinova et al.: Вращению эпителия предшествует нарушение планарной симметрии актомиозина и защищает эпителиальную ткань от деформаций клеток. PLoS Genetics 2017, том 13, выпуск 11, стр. e1007107.
Раствор инсулина например, , ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).
  2. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
  3. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
  4. Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
  5. Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
  6. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
  7. Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
  8. Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044(2013).
  9. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
  10. Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
  11. Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511(2014).
  12. Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107(2017).
  13. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
  14. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
  15. Haase, R. Surface manager. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018).
  16. Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018).
  17. Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017).
  18. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  19. Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
  20. Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
  21. Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Actomyosin DynamicsDrosophila Egg ChambersTime lapse MoviesFiji based PluginSurface ManagerEllipsoid Surface ProjectionCell Mask AnalysisTissue Scale AnalysisLocal Cellular ScaleEpithelial Tissue

Похожие статьи