Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Как определить долю флуоресцентных белков Photoactivated навалом и в живых клеток

6.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58588

⸱

7 января 2019 г.

 , 
1Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, который включает в себя генетически спаренных спектрально собственный photoactivatable и флуоресцентных белков. Эти флуоресцентный белок химер количественной фракции ПА-FP, это photoactivated быть флуоресцентные, т.е., photoactivation эффективность. Протокол показывает, что различные виды photoactivation принести различные photoactivation эффективность.

Аннотация

Photoactivatable и - кабриолет флуоресцентных белков (ПА-FPs) использовались в микроскопии флуоресцирования клеток для анализа динамики клеток и белков ансамблей. До настоящего времени, метод не был доступен для количественного определения навалом и в живой клетки, как многие из ПА-FPs выразили являются photoactivated флюоресцируют.

Здесь мы представляем протокол с участием внутренних правителей, т.е., генетически связан флуоресцентные белки спектрально собственный (photoactivatable), ratiometrically количественно доля всех ПА-FPs, выраженные в ячейку, включаются в флуоресцентные. Используя этот протокол, мы показываем, что различные виды photoactivation принесли различные photoactivation эффективность. Коротких мощных photoactivation с конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM) привели к до четыре раза ниже photoactivation эффективность чем сотни низкого уровня воздействия применяются CLSM или короткого импульса, применяемые widefield освещения. Хотя протокол был примером здесь (ПА-) GFP и (ПА-) вишня, он может в принципе применяться к любой спектрально собственный пары флуоресцентный белок photoactivatable или photoconvertible и любой экспериментальной установки.

Введение

В 2002 году были описаны первый широко применимым photoactivatable (1ПА-GFP) и photoconvertible (2Каэдэ) флуоресцентных белков. Эти оптические маркера флуоресцентные белки изменить их спектральных свойств после облучения УФ-светом, то есть, они становятся яркими (photoactivatable флуоресцентные белки, т.е., PA-FPs), или изменить их цвет (photoconvertible FPs). На сегодняшний день, несколько обратимого и необратимого photoactivatable и photoconvertible флуоресцентные белки были развитыми3,4. В ансамбль или массовых исследований оптические маркеры используются для изучения динамики ячейки целиком или белки и подключение субцеллюлярные отсеков. Кроме того оптические маркеры включен один молекулы на основе сверхразрешение методы, такие как PALM5 и6FPALM визуализации.

Хотя фотохимических процессов во время photoactivation - преобразование или были описаны многие оптические маркеры и даже кристаллографических структур до и после photoactivation, / - преобразования были сделаны доступно7 , 8, Фотофизический механизм photoactivation и - преобразования полностью не поняты. Кроме того, до настоящего времени только сырая оценки существует эффективности photoactivation и - преобразование, то есть, часть флуоресцентных белков, выразил это на самом деле photoconverted или photoactivated быть флуоресцентные. В vitro исследования ансамбль сообщалось количественной оценки изменения спектров поглощения и объем встроенной и активированного протеина в гель9,10,11.

Здесь мы представляем протокол с участием флуоресцентный белок химер оценить долю флуоресцентных белков photoactivated навалом и в живых клеток. Всякий раз, когда работа с генетически закодированный флуоресцентных белков, абсолютное количество белка выразил варьируется от ячейки к ячейке и неизвестна. Если одну ячейку, выражая ПА-FP показывает сигнал ярче после photoactivation чем другой ячейки, не смогите быть продифференцировано, если это ярче сигнала из-за выше выражение ПА-FP или более эффективным photoactivation PA-FP. Чтобы стандартизировать выражение уровня в клетках, мы представляем внутренней правителей генетически спаренных спектрально собственный флуоресцентных белков. Путем сцепления генетической информации о photoactivatable флуоресцентный белок спектрально собственный всегда на флуоресцентные белки, внутренние правители создаются, будет по-прежнему выражена неизвестного общую сумму, но в фиксированной и известных относительное количество 1: 1. Эта стратегия позволяет количественная характеристика различных схем УФ света photoactivation, т.е. оценку относительного объема PA-FPs, который может быть photoactivated с различными видами photoactivation и тем самым позволяет определение photoactivation схемы, которые являются более эффективными, чем другие. Кроме того эта стратегия позволяет в принципе оценки абсолютной количественной оценки доли photoactivated ПА-FP. В этой связи важно понимать, что представленные ансамбль исследования на основе интенсивности который делает анализ более сложные, изложенные в настоящем Протоколе. Параметры определения измерений интенсивности флуоресценции, т.е. различных молекулярных яркость, поглощения и выбросов спектры и эффекты ладу, необходимо учитывать при сравнении интенсивности флуоресценции различных флуоресцентных белков.

Представлены ratiometric на основе интенсивности количественной оценки эффективности photoactivation является примером для PA-GFP и ПА-вишня в живых клеток, но в принципе широко применимым и может быть использован для любого photoactivatable флуоресцентный белок при любых экспериментальные условия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. плазмида строительство

  1. Генерировать фьюжн-двухцветный зонды. Используйте выражение вектор mammalian клетки (см. Таблицу материалы) в котором mCherry112 и ПА mCherry113 были вставлены с ограничением сайтов АИОД и BsrGI.
  2. Порядок пользовательских oligo нуклеотиды для того чтобы усилить мономерные варианты eGFP и ПА eGFP, содержащие A206K мутации, т.е., mEGFP и ПА mEGFP14 без остановки кодоном как фрагмент Сали-BamHI . Использование N-терминальный грунтовка 5'-AAT TAA CAG ВРЧ ACG ГПТ GTG СМЖЛ AAG GGC кляп G 3' и C-терминал грунтовка 5'-AAT ATA TGG УВД CCG CTT GTA CAG КТК GTC CAT GC 3' и вставьте этот фрагмент Сали-BamHI в несколько клонирования сайт вектора выражения. Это создаст пять аминокислоты компоновщика RNPPV между красный и Зеленый флуоресцирующий белок. Мы будем обращаться к Флюорофор химеры как GFP — вишня, ПА-GFP — Черри и GFP — ПА-вишня на оставшуюся часть этой статьи.
    Примечание: Муфта флуорофоров и создание внутреннего правителей для оценки эффективности photoactivation может быть сделано с любой парой спектрально собственный Флюорофор, например superfolder ПА-GFP 15/ PA-TagRFP 16, и т.д. Многие из photoactivatable флуоресцентные белки являются производными от GFP. Следовательно грунтовка последовательность, приведенную выше может использоваться для многих флуоресцентных белков для построения Флюорофор Химера в векторе выражение mammalian клетки.

2. Культура и Transfection клетки

  1. Используйте либо любой стандартной ячейки строки например HeLa, NRK, Cos-7 или определенной ячейке строки может использоваться для конкретных photoactivation экспериментов. Используйте DMEM (дополненная плода бычьим сывороточным 10% и глютамин 2 мм) и трипсина без фенола красного (см. Таблицу материалы), для уменьшения фона флуоресценции.
  2. Отсоединить клетки вырожденная культуры трипсин, подсчитать количество клеток в суспензии клеток, используя камеру Нойбауэр и семя 5000 – 10 000 ячеек на хорошо. Альтернативно используйте 1 капля из пипетки 2 мл ячейки 10-мл суспензии из вырожденная клеточной культуры вырос в колбе T 25-клеточной культуры или 3 капли из клеток 5-мл суспензии из вырожденная культуры, выращенные в колбе 12,5 клеточной культуры T.
  3. Рост клеток в 8-Ну камер с крышкой #1.0 стекла (см. Таблицу материалы) для микроскопии флуоресцирования клеток.
  4. Transfect клетки 24 ч после покрытия с использованием коммерческих реактивов (см. Таблицу материалы) на распределитель в протокол с GFP — вишня, ПА-GFP — Черри и GFP — PA-вишня химер.
  5. Изображение клетки после в общей сложности 20 h пост трансфекции для выражения протеина, складные и созревания.

3. томография и Photoactivation

  1. Изображение клетки в увлажненные и подогревом экологической палаты в 37 градусов по Цельсию. Буфера ячейка СМИ при физиологическом рН и сделать его CO2-независимый, добавить 20 мм HEPES, или использовать газ CO2 , равным 5% потока.
  2. Во-первых, изображение клетки, выражая GFP-вишневый конструкции. Задать параметры, определяющие время интегрированной лазерной интенсивности на пиксел в конфокальное изображение, т.е., пиксель останавливаться время в микросекундах, передачи Акусто оптический перестраиваемый фильтр (AOTF) в % и цифровой зум.
    Примечание: Использование 60 x цель и цифровой зум 3 x позволяет визуализации ячейки во всей его полноте при обеспечении достаточного увеличения. Задать время нахождения пиксель μs и AOTF передачи для 488 нм и 561 Нм лазер 2-4 таким образом, что изображения показывают хорошее соотношение сигнал шум без каких-либо отбеливания и не пикселей, определяющее Насыщенность интенсивность флуоресценции.
  3. Изображения, используя набор лазерной энергии, AOTF передачи, время нахождения пикселей и цифровой зум, 15-20 клеток, выражая GFP-вишня.
  4. Затем, изображение с же набор лазерной энергии, время нахождения пикселей, AOTF передачи и цифровой зум клетки, выражая GFP — PA-вишня и ПА-GFP — Черри. Поиск для выражения ячейки в зеленый канал или красный канал, соответственно. Избегайте длительного воздействия клеток во время поиска для выражения ячейки для того, чтобы не отбеливать флуоресцентных белков.
  5. Настройка мини-временных рядов с одного изображения предварительной активации и три изображения после активации. После активации изображений поможет выявить потенциальные переходных темные государства вследствие воздействия УФ-света.
    Примечание: В наших руках, были изменения в интенсивности обнаруженных флуоресценции за счет переходные темные государств < 1% и может быть упущено, но те темные государства должны оцениваться для каждой экспериментальной установки.
  6. Для определения эффективности photoactivation, т.е. доля ПА-FPs, который включается для флуоресцентных, в конкретных photoactivation экспериментов, которые уже созданы, применить те же параметры photoactivation 15-20 клеток, выражают внутреннего правителей, представил здесь и продолжить с анализом изображений (раздел 4). Если начало настроить photoactivation эксперименты, найти здесь несколько различных параметров, на основании нашего экспериментального опыта с PA-GFP и ПА-вишня; Внесите необходимые изменения.
    1. Для мгновенной photoactivation PA-GFP и ПА-вишня с помощью конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM) применяют 90 МВт 405 нм лазерного света в 3 или 5 итераций, соответственно.
      Примечание: С нашей микроскопические структуры, с помощью передачи собой 38% и время выдержки пикселя 2 μs, мы измерили эту мощность лазера 405 нм в режиме строка сканирования на объективе. С этими параметрами около 8% и 16% Па-GFP и ПА-вишня выразил может быть photoactivated быть флуоресцентные. Серии весь титрования, используя CLSM для мгновенной photoactivation был ранее опубликован17.
    2. Если выше часть photoactivated ПА-GFP и ПА-вишня флуорофоров выгодно например для достижения более высокий коэффициент сигнал шум, и photoactivation не должны быть немедленно, применяют 40 мкВт 405 нм лазерного света с 2 μs пиксель время задержки и 6% AOTF передача для 450 итераций. Затем photoactivation будет принимать до 4 мин, а не только 1-2 секунды, но эффективность photoactivation для PA-GFP будет 29%, а не 8%, что позволяет более высокий коэффициент сигнал шум.
  7. Если доступна система цифровой освещения мозаика, которая содержит микро зеркало массивы в пространственный модулятор света, свет лазера 405 нм может использоваться для widefield-photoactivation. Это позволяет эффективно photoactivation в течение миллисекунд.
    Примечание: Мощностью 1,6 МВт лазер измеренные на объективе и время воздействия 250 мс, 29% ПА-GFP может быть photoactivated быть флуоресцентные.
  8. Изображения с любыми параметрами set photoactivation 15-20 клеток, выражая ПА-GFP — Черри и GFP-PA-вишня, соответственно.
  9. Поскольку photoactivation эффективности могут влиять рН, реактивнооксигенных видов и других экологических факторов, может быть важно оценить эффективность photoactivation PA-FPs в соответствующих внутриклеточных micromilieu где протеин интереса расположен. Путем соединения Флюорофор химер протеина интереса, как авторы сделали с плазматической мембраны белка VSVG 18, photoactivation можно оценить эффективность в отсеке конкретных субцеллюлярные интерес.

4. анализ и изображений алгоритм для Ratiometric на основе интенсивности количественной оценки эффективности Photoactivation

  1. Анализ изображений может быть сделано с открытым исходным кодом изображения обработки платформ ImageJ или Фиджи. Определите интенсивность флуоресценции фон в не transfected клеток в зеленый (1Б) и красный (2B) канал. Избегайте perinuclear или любой области показаны увеличение auto флуоресценции.
  2. Для определения интенсивности флуоресценции в transfected клеток, изложить клетки тела с средство произвольной выборки. Опять же Избегайте perinuclear или любых других областях, показаны auto флуоресценции.
  3. Вычитание фона от интенсивности измерений флуоресценции в каждом канале.
    ЯG =Green_measured -B1
    ЯR =Red_measured -B2
  4. Используйте GFP — Черри конструкции для расчета коэффициента красно зеленый (RtoGr) и исправления для закалки доноров за счет передачи энергии резонансной флюоресценции (лад). Эффективность лад E преисполнена решимости быть 0,3 в предыдущих экспериментов для GFP — Черри конструкцию с использованием же аминокислоты компоновщика между двумя флуорофоров18.
    RtoGr = (яRed_measured – B2) / (яGreen_measured – B1)
    RtoGrКорр = RtoGr * (1-Е)
    Примечание: В этом интенсивность-на основе подхода, доноров, закалки для mEGFP и ПА mGFP может отличаться с учетом возможных различных спектральных свойств, которые не характеризуются. Скорость ладу (kET) и Foerster расстояние (R0) зависят от квантовый выход донора, который не был определен для mEGFP и ПА mGFP.
  5. Использовать GFP-PA-вишня конструкцию оценить долю photoactivated ПА-вишня. Определить ожидаемый флуоресценцией интенсивности ПА-вишня путем умножения измеренной неутоленной зеленой флуоресценцией интенсивность GFP — PA-вишня построить до photoactivation с исправлениями красно к зеленый отношение (RtoGrКорр ).
    ЯRed_expected = (IGreen_measured -B1) * RtoGrКорр
    Примечание: Как указывалось выше, молекулярные яркости всегда на FP и photoactivatable FP может отличаться. Смотрите обсуждение для получения дополнительной информации о том, как учитывать эти различия.
  6. Рассчитайте эффективность PA-Черри photoactivation как часть измеренных красной флуоресценцией интенсивности после photoactivation и ожидаемый флуоресценцией интенсивности красного канала.
    (ПА вишняF) = (яRed_measured – B2) / яRed_expected
  7. Используйте ПА-GFP — Черри конструкцию оценить долю photoactivated ПА-GFP. Определите ожидаемый флуоресценцией интенсивности ПА-GFP путем деления измеренного красной флуоресценции интенсивности ПА-GFP — Черри построить до photoactivation, красное на зеленый соотношение (RtoGr). Здесь RtoGr не должны быть исправлены для доноров закалки, потому что GFP и ПА-GFP подлежат доноров закалки на ту же сумму.
    ЯGreen_expected = (яRed_measured – B2) / RtoGr
  8. Рассчитайте эффективность photoactivation PA-GFP как часть измеренных зеленой флуоресценцией интенсивности после photoactivation и ожидаемый флуоресценцией интенсивности в зелёном канале.
    (ПА GFPF) = (яGreen_measured – B1) / яGreen_expected

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол, представленные здесь показывает ratiometric количественной оценки доли флуоресцентных белков, которые photoactivated быть флуоресцентные (рис. 1). Эта часть отличает зависящ на режим photoactivation.

Типичный результат с помощью мощных photoactivation короткое время с конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM) показано на рисунке 2 c. После титрования ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Пока метод не существовало навалом определить долю PA-FPs в живых клеток, photoactivated быть флуоресцентные. Представленные протокол может использоваться для любой пары спектрально собственный флуоресцентный белок. Хотя здесь примером для необратимого ПА-FPs ПА-GFP и ПА-вишня, этот подход является в принципе применима к photoconvertible белки также. Спектрально собственный флуоресцентный белок, однако, должен быть выбран внимательно к минимуму спектрального наложения, учитывая, что photoconvertible флуоресцентные белки ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Дориго лабораторные и Imaging службы неврологии в Стэнфордский Школы медицины университета для предоставления оборудования и пространства для этого проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pEGFP-N1 вектор экспрессии клеток млекопитающихClontech
DMEM без фенолакрасного Thermo Fisher Scientific11054020
трипсин без фенолакрасного Thermo Fisher Scientific15400054
L-глутамин (200 мМ)Thermo Fisher Scientific25030081
HEPESThermo Fisher Scientific15630080
8-луночные камеры LabTek #1.0Thermo Fisher Scientific12565470
Fugene 6PromegaE2691

Ссылки

  1. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  3. Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).
  4. Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
  5. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  7. Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
  8. Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
  9. Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  10. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944(2008).
  11. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  12. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  13. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
  14. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  15. Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
  16. Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
  17. Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
  18. Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Как определить долю флуоресцентных белков Photoactivated навалом и в живых клеток
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.