Методическая статья

Оптимизированный интерферона гамма ELISpot Assay мера Т-клеток ответов в модели морской свинки после вакцинации

23.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58595

⸱

20 января 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inovio Pharmaceuticals, Inc, 2Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria, Robert Koch Institute

В этой статье

Краткое содержание

Разработка интерферона гамма ELISpot assay для морской свинки получения позволяет характеристик Т-клеток ответов в этой весьма актуальны модели для изучения инфекционных заболеваний. Мы применили assay для измерения Т-клеток ответов, связанных с внутрикожное введение вакцины ДНК.

Аннотация

Морская свинка играл ключевую роль как модель соответствующих мелких животных в разработке вакцин против инфекционных заболеваний, как туберкулез, гриппа, дифтерии и вирусных геморрагических лихорадок. Мы продемонстрировали, что плазмида ДНК (pDNA) вакцинации в кожу вызывает надежные гуморальные ответы в морской свинки. Однако использование этого животного к модели иммунные реакции было несколько ограничены в прошлом из-за отсутствия доступных реагентов и протоколов для изучения ответов Т-клеток. Т-клетки играют ключевую роль в иммунопрофилактики и иммунотерапевтических механизмов. Понимание Т-клеток ответов имеет решающее значение для развития инфекционных заболеваний и онкологии вакцин и размещения поставки устройств. Здесь мы описываем assay энзим соединенный immunospot (ELISpot) интерферона гамма (ИФН γ) для морской свинки мононуклеаров периферической крови (получения). Assay позволяет исследователям характеризуют вакцины специфических Т-клеток ответов в этой важной грызунов модели. Способность к assay клетки изолированы от периферической крови предоставляет возможность отслеживать иммуногенности в отдельных животных.

Введение

Протокол, описанные здесь позволяет обнаружить интерферона-гамма (ИФН γ) секреции клетки после отзыва антигена в периферической крови мононуклеарных клеток (КСДОР) населения, добываемых из морских свинок Хартли. Мы применили assay охарактеризовать кинетику и величины антиген специфические Т-клеток ответов схема вакцинации против гриппа в морской свинки. Мы считаем, что этот протокол будет значительно продвинуть доклинические развития программ вакцинации в этой весьма актуальны модели на животных.

Т-клетки, вызвал вакцины играть важную роль в деле защиты против инфекционных агентов и иммунотерапевтических пути, связанные с другими заболеваниями. В нескольких исследованиях вакцины была подчеркнута важность Т-клеток. Иммунизации хорьки и мышей с плазмида ДНК (pDNA) кодирования для H5 гемагглютинин и N1 нейраминидазы представил защите от заболеваемости и смертности в вызов вирус гриппа в отсутствие нейтрализующих антител, указывая значение Т-клеток иммунитета1. В дополнение к сильным нейтрализации гуморального иммунного ответа, Т-клетки играют важную роль не только Вирусный Распродажа2 , но и защиту от инфекции с респираторно-синцитиальный вирус (RSV) в мышей3. В организме человека, ранее существовавших CD8 + Т-клетки были связаны с снижение болезнь тяжести во время H1N1 пандемии в 20094. CD4 + Т-клеток вместе с плазменной концентрации некоторых цитокинов коррелируются с тяжести заболевания в RSV-инфицированных детей5.

Морская свинка приобрела известность как модель лаборатория для исследований и разработок в различных областях медицины, такие как чувствительность кожи, питанием исследования, исследования слуховой системы и, что наиболее актуальными для этой работы, инфекционные заболевания. Это имеет решающее значение для открытия вакцин против туберкулез и дифтерия. Совсем недавно морской свинки используется в качестве модели для гриппа6 и7Эбола. Кроме того обладая физиологического сходства для кожи человека8, морская свинка предлагает модель доступной малых животных для методов доставки дермального наркотиков. В отличие от его важность как модель лаборатории наличие конкретных анализов морских свинок и зонды характеризовать иммунных реакций остается ограниченным9. Основные сотовой анализов, например энзим соединенный immunospot ИФН γ (ELISpot проба), обычно используется в доклинических и клинических исследований для перечисления Т-клеток ответы не были доступны.

Первый immunospot энзим соединенный твердофазный анализов были использованы для определения числа конкретных антитела секретирующих клеток в клетки B населения10,11. Формат расширенный обнаружить клетки секретирующие цитокинов, включая IL-1, IL-2, IL-4, Ил-5, IL-6, Ил-10, ГМ-КСФ, ФНО альфа, TNF-бета, Гранзим B и ИФН γ. ELISpot assay обладает высокой чувствительностью; потенциально могут быть обнаружены каждой ячейки производство цитокинов. Сообщается, что предел обнаружения для ELISpot анализов будут ниже, чем 10 спотов в 100000 получения12. Недавно пару специфическое антитело ИФН γ-свинки был сделан доступны13, и это открыло возможность для решения этого дефицита в области.

ИФН γ считается важным эффекторные молекулы в адаптивного иммунного ответа; Это могут быть произведены и выделяется клетками CD4 и CD8 T после активации. ИФН γ имеет широкий спектр биологических функций в контексте иммунного ответа к вирусной инфекции, такие как активация макрофагов и вверх регулирование комплекс гистосовместимости (MHC) я и MHCII выражения. Он также способствует B-клеточной дифференцировки, подавляет рост клеток T-помощник-2 и активирует естественных клеток-киллеров. ИФН γ блокирует репликацию вируса в зараженных соматические клетки и upregulates экспрессии молекул MHC. Таким образом производство ИФН γ является очень важным показателем качества Т-клеток реакции на вакцину или патогена.

Важным аспектом здесь представлена ELISpot ИФН γ является использование репликацию, вместо того, чтобы splenocytes13. Репликацию можно получить путем обработки-терминал сбора крови, тогда как сбор splenocytes требует животных euthanization до сбора урожая в селезенке. Использование получения позволяет ИФН γ T-клеток ответов на наблюдение за определенный период времени и оценки воздействия на Т-клеток ответов, таких как премьер boost схемы14.

Для исследователей, которые в настоящее время используют морскую свинку в животной модели метод ELISpot ИФН γ расширит спектр научных данных, которые они могут получить. Его доступность теперь может уменьшить необходимость проведения исследований с менее соответствующих животных моделей для целевого болезни, которые ранее были выбраны из-за наличия реагента для изучения клеточных реакций. Использование репликацию вместо селезенки и лимфатических узлов позволяет для экспериментов-терминал и непрерывный мониторинг отдельных животных.

Ниже мы предоставляем подробное описание этапов обнаружения ИФН γ клеточного ответа в морских свинок pDNA вакцины. Мы изложить наши процедуры доставки и описать общие ELISpot assay, охватывающих проб крови, анализ крови, КСДОР урожай, процедура анализа и анализа данных. Схема ELISpot assay изображен на рисунке 1.

Схема схемы изоляции PBMC; забор крови, нанесение покрытий на клетки, стимуляция антигенов, результаты анализов.
Рисунок 1 : Схематичный обзор свинки протокол ELISpot. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование Комитета (ACUC) Acculab.

Примечание: Протокол требует использования потенциальных опасных материалов. Пожалуйста, обратитесь к MSDS производителя и носить надлежащего личного оборудования (СИЗ) на протяжении всей процедуры.

1. Подготовка сайта иммунизации-свинка, внутрикожные инъекции Манту и CELLECTRA-3P-EP-процедура

  1. Подготовка сайта лечения на морской свинки.
    1. Морская свинка в камеру всасывание и обезболивают в 5% изофлюрановая пара.
    2. Удаление животных из камеры и место носовой конус в положении, обеспечивая 2% изофлюрановая паров для поддержания анестезии во всей процедуре.
    3. Бритье области приблизительно 4 см2 на брюшной фланге.
    4. Продезинфицируйте бритая области этанола-тампоном.
  2. Инъекции pDNA разработка и электропорации процедуры.
    1. Используйте инсулин шприц для вставки 100 мкл формулировка в дерму методом Манту. Игла вводится наклонной вверх на угол 10 градусов с телом животного.
    2. Извлеките иглу и сразу вставить в массив электрод CELLECTRA® - 3 P через инъекции пшеничная и применять электрического поля.
    3. Удаление животных из наркоза и контролировать его восстановления.

2. Non терминал кровоточить

  1. Сбор крови от яремной анестезированные морской свинки.
    1. Морская свинка в камеру всасывание и обезболивают животных, как описано в 1.1.1
    2. С помощью 3 мл шприца с иглой 27 g 1/2 дюйма, перемежать яремной анестезированные животного и собирать 3 мл крови.
    3. Сразу передача крови в K2EDTA пробирка, инвертировать трубки несколько раз перемешать крови с анти коагулянта и место на льду.
      Примечание: Предотвращения свертывания крови имеет решающее значение для успешной обработке образца крови.
    4. Мониторинг животных восстановления.

3. обработка образцов крови

  1. Разделение получения из цельной крови центрифугированием градиент плотности
    1. Разбавления крови 1:1 с Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS).
      Примечание: Чтобы избежать загрязнения, все работы здесь на должны выполняться в кабинете биобезопасности, применяя асептической техники.
    2. Слой разбавленной крови постепенно более 4,5 мл Ficoll-Paque плюс в 15 мл Конические трубки. Во избежание нарушения интерфейса. Примечание: Для обеспечения надлежащего разделения, Ficoll-Paque должна быть при комнатной температуре.
    3. Центрифуга трубы на 800 РРС для 30 мин с тормозом выкл.
      Примечание: как альтернатива, SepMate™ трубы (ПРОВОДЯЩЕМ технологии) могут быть использованы для КСДОР разделения. HBSS разбавленной крови добавляется 15 мл SepMate, заполнены с 3,5 мл Ficoll-Paque Plus и затем центрифугировали в 1200 РРС для 10 мин (тормоз). Этот метод градиентного центрифугирования экономии времени приводит к равных жизнеспособности, клетки доходность и спот формирование.
    4. Урожай Баффи-слой и разбавленных в R10 среднего (10% (v/v) тепло деактивирована FBS и 1% (v/v) перо/воспаление в RPMI1640 среде) к общим объемом 15 мл.
    5. Пелле клетки центрифугированием в 450 РРС за 5 мин.
    6. Вымойте клетки дважды с R10 среднего.
    7. Вновь приостановить клеток в 1 мл R10 и передайте суспензию клеток через 70 мкм клеток-сетчатый фильтр в новой трубки.
    8. Подсчитать ячейки и определить количество живых клеток путем пятнать Трипановый синий.
    9. Разбавить клетки с R10 среднего до концентрации 1 x 10 ^ 6 живых клеток / мл.

4. Подготовка ELISpot пластины и ячейки стимуляции

  1. Пальто и блок скважин 96-луночных ELISpot PVDF мембраной пластины перед посевом репликацию.
    1. Плиты должны быть предварительно обработанных за 60 секунд. Этанол до лечения приведет к менее неспецифических спот формирование и пятна с улучшение определения.
      Примечание: Принять дополнительные меры для обеспечения полного мембраны соприкасается с 15 мкл 35% этанола.
    2. После 60 секунд добавить 150 мкл ПБС в колодец, а затем очистить из скважин, инвертирование пластины.
      Примечание: Предварительная обработка этанола очень срочным. Не инкубировать дольше, чем 60 секунд мембраны не должна высыхать на следующих этапах процедуры хорошо мембраны.
    3. Мыть тарелки три раза с 250 мкл ПБС за хорошо.
    4. Пальто с 100 мкл/хорошо 5 мкг/мл захвата против свинки антитела V-E4 ИФН γ в PBS.
    5. Инкубировать пластины для по крайней мере 12 часов на 4° C.
    6. Мыть тарелки, добавив 250 мкл/хорошо PBS три раза.
    7. Добавить 200 мкл/хорошо блокирующий буфер (10% (w/v) сахарозы и 2% (w/v) BSA в PBS) и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
    8. Мыть тарелки с 250 мкл/хорошо PBS три раза.
  2. Пластина репликацию с пептидами антиген специфические, положительной и отрицательной контроля.
    1. Разбавьте белка пептид бассейн в R10 до желаемого окончательный пептид концентрации.
    2. Пробирного получения образцов в triplicates.
      Примечание: Сначала добавьте носитель с стимуляторы ELISpot пластины и добавить КСДОР подвеска второй.
    3. 50 мкл пептид R10 среды указанных скважинах.
    4. Для отрицательного контроля добавьте 50 мкл пустой пептид формулировка в R10 в указанных скважинах.
    5. Для позитивного управления добавьте 5 мкг/мл конканавалина А (Кона) в среде R10 в указанных скважины.
    6. 100 мкл суспензии клеток КСДОР для всех скважин
    7. Инкубировать пластин в увлажненные 5% СО2 атмосфере при 37° по Цельсию на 18 часов.
      Примечание: Место ELISpot плиты на даже поверхность/стойку в инкубаторе и избежать каких-либо нарушений плит во время инкубации.

5. Обнаружение интерферона гамма позитивные пятна

  1. Инкубация с обнаружения антител и пластины развития.
    Примечание: Для всех шагов в этом разделе не асептической техники не требуется.
    1. Осторожно извлеките пластины из инкубатора и безопасно очистить скважин. Мыть тарелки, добавив 250 мкл/хорошо PBS в три раза.
    2. Добавьте 100 мкл/хорошо 2 мкг/мл биотинилированным обнаружения анти свинки ИФН γ антитела которые разбавлять N-G3 в блокирующем буфере.
      Примечание: Раствор антител (22 мкм) фильтр для уменьшения фона.
    3. Проинкубируйте с обнаружения антител для 2 часов при комнатной температуре.
    4. Выбросите супернатанта и мыть тарелки, добавив 250 мкл/хорошо PBS три раза.
    5. Добавить 100 мкл/хорошо щелочной фосфатазы (ALP)-конъюгированных стрептавидина, разбавленных в блокирующем буфере.
      Примечание: Фильтр (22 мкм) решение для уменьшения фона.
    6. Инкубируйте с ALP-стрептавидина конъюгата 1 час при комнатной температуре.
    7. Отменить решения стрептавидина ALP и мыть тарелки, добавив 250 мкл/хорошо PBS в два раза и удалите избыток PBS, инвертирование пластину и промокательной его с чистым бумажным полотенцем.
    8. Мыть тарелки, добавив 250 мкл/хорошо сверхчистого DI воды один раз и удалите избыток воды, инвертирование пластину и промокательной его с чистым бумажным полотенцем.
    9. 100 мкл раствора субстрата ПКВП/НБТ (осторожно), в каждой скважине. Предупреждение: ПКВП/НБТ высоко горючих и токсичных если проглотил, при контакте с кожей, или вдыхают. Перед использованием обратитесь к MSDS.
    10. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре в защищенном от света.
    11. Промойте пластину 4 раза с дейонизированной водой. Инвертировать пластины и нажмите, чтобы удалить лишнюю воду.
    12. Удалите пластиковые дренажные из нижней части ELISpot пластины и позволяют пластины для просушки.
    13. Количественно пятна, вручную или с помощью автоматизированных ELISpot читатель, например S6 CTL-Immunospot пластина читателя.

Результаты

Результаты, представленные здесь служить отправной точкой для ожидаемых результатов после использования этого протокола, подчеркивая важность кардинальные шаги и подтверждает преимущества описанных оптимизации.

После центрифугирования градиент плотности как описано в шаге 3.1 протокола, красный вязкой жидкости в нижней части трубки будет содержать большую часть красных кровяных клеток. Как показано на рисунке 2A, выше красные кровяные клетки — это слой, плотность-среды. Между слоем ясно или желтый плазмы на вершине и плотность градиента среда является белый или светло коричневый Баффи слой, который содержит большую часть белых кровяных клеток и тромбоцитов. Неполного разделения будет проявляться как наличие красных кровяных клеток на вершине градиент плотности среды. Красная окраска плазмы в рисунке 2A является наиболее вероятно вследствие гемолиза, как этот образец крови хранится в коллекции трубки 1,5 h перед обработкой. Рисунок 2 B показывает градиента до (слева) и после (справа) центрифугирования в устройстве КСДОР изоляции. Образец крови в рисунке 2B был обработан с минимальной задержкой после забора крови и плазмы окраска желтая.

Влияние предварительного замачивания оболочек с этанолом (см. шаг 4.1 протокола) на месте развитие показано на рисунке 3. Пятна в предварительно обработанных скважин отображения улучшение определения, и есть сокращение числа мест в средних/ДМСО отрицательный контроль скважины (рисA). Типичный жизнеспособность обработанной морской свинки получения колеблется около 90% и аналогичные регулярные 15 мл пробирок и КСДОР изоляции устройства (рис. 3B). Доходность жизнеспособных клеток из 3 мл крови обычно колеблется от 3 х 106 и 5 x 10-6.

Животные были иммунизированы с плазмидной ДНК кодирования Нуклеопротеиды (NP) штамма гриппа H1N1 A/PuertoRico8. На рисунке 4 показано перечисление Т-клеток ИФН γ ответов, представленных как спот формирование единиц (ЮФУ), получаемых через продолжительность режима вакцинации. ELISpot проба с получения заготавливаемым от-иммунизированных животных приводит к незначительным пятно графов (не tx). Четырнадцать дней после первого иммунизации (премьер), в среднем 970 ИФН γ пятна на миллион получения были подсчитаны после иммуногенность стимуляции. Через семь дней после второй иммунизации (boost), Т-клеточных реакций против всех трех бассейнах были расширены, достигнув в среднем SFU/106 получения 5020 ИФН γ. сорок шесть дней после второй иммунизации (память), среднее количество 6310 ИФН γ SFU/10 6 получения были подсчитаны в периферической крови.

РИСУНОК ЛЕГЕНДЫ:

Результаты процесса центрифугирования; отделение крови в плазму, охристый покров; Схема пробирок центрифуги.
Рисунок 2 : Представитель изображения слоев после центрифугирования градиент плотности. Образец крови (A) до (слева) и после (справа) центрифугирования в регулярных трубы. (B) крови образца до (слева) и после (справа) центрифугирования в устройствах КСДОР изоляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Результаты анализа жизнеспособности клеток; эффекты пептидной стимуляции; Микроскопические изображения и сравнение графиков.
Рисунок 3 : Оптимизация протокола. (A) типичный вид ИФН γ позитивные пятен в пластине Пробирная ELISpot хорошо разработана в соответствии с протоколом. Пример тройные колодцев показываются после предварительной обработки с этанолом (справа) или без предварительной обработки (слева). Клетки инкубировали ночь либо с ДМСО (вверху) как без стимул управления, антиген согласованной пептидов (средний) или Митоген ConA (внизу). Получения от же отдельных животных. Колодцы были образы с помощью автоматизированных пластины сканер. (B) сравнение различных градиент плотности труб на обработанные клетки. 3 мл образцов крови от 3 отдельных морских свинок были собраны. 1,5 мл каждого образца были обработаны с помощью регулярных трубы (градиент средней плотности) или КСДОР изоляции устройства. Жизнеспособность (левый, % ± SEM) и количество живых клеток (справа, x 106 ± SEM) были определены с использованием автоматической клеток, считая системы и пробирного Трипановый синий исключения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Гистограмма; Результаты PBMC ELISPOT; СФЕ против лечения; бассейны NP с цветовой кодировкой; Анализ иммунного ответа.
Рисунок 4 : Обнаружение надежные сотовых иммунных реакций в течение режим вакцинации. 1 и 15 дни 30 мкг pDNA кодирования гриппа A Нуклеопротеиды (NP) был доставлен внутри внутрикожно брюшной фланг Хартли морских свинок, сразу же после кожи электропорация. ИФН γ ELISpot ответ была измерена 14 дней после первого иммунизации (премьер) и 7 дней (boost) и 46 (память) после второй иммунизации. Средняя SFU + SEM были нанесены 5 очищенных морских свинок и 2 необработанных морских свинок (не tx). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Морской свинки является ценным животных модель развития доклинических вакцин и внутрикожное введение стратегий. Вышеупомянутый Протокол описывает методологию для оценки реакции антиген специфические Т-клеток в этой весьма актуальны модели. Assay обеспечивает четкое перечисление периферийных устройств T-клетки, вырабатывающие интерферона-гамма при стимуляции с пептидами антиген специфические. Кинетика иммунного ответа может контролироваться забора крови-терминал.

Мы оптимизированный протокол и определили важнейшие аспекты для получения оптимальных результатов, используя этот assay. Например образование тромбов в коллекции трубки приведет к неоптимальной КСДОР восстановления и жизнеспособности. Морская свинка тромбов очень быстро18. Важно быстро выполнить розыгрыш крови. Au-камень et al. обеспечивают полное руководство для кровотечение методов в модели свинка16. Поскольку сбор крови требует общей анестезии, рекомендуется рассмотреть применимые стандартные оперативные процедуры этого аспекта процедуры19. Недостаточно анестезированные морских свинок будет реагировать, перемещая их ноги или вокализация после краткого щепотка ткани между пальцами с ваши ногти или дрогнув свои уши и поступательного продвижения их усы после щипать их уха. Немедленную передачу крови в трубку с антикоагулянтами и перемешать тщательно путем прокатки или инвертирование трубке несколько раз является важным шагом в этом протоколе. Здесь описывается протокол ЭДТА трубы были использованы, и без других антикоагулянты были протестированы. Пожалуйста, обратите внимание, что ЭДТА гипертонический, трубы должны идеально быть заполнены более чем наполовину и поэтому соответствующие трубы размер объем образца должны быть использованы.

Когда выполнена правильно, плотность градиентного центрифугирования неизменно приводит к чистой КСДОР подготовки. Средний градиент плотности должны быть при комнатной температуре, когда слои градиента перед центрифугированием, а тормоза не должны использоваться для остановки центрифуги при использовании регулярных трубы. Значительное улучшение с точки зрения практичности КСДОР-обработки было сочетание градиентного центрифугирования плотности с устройствами КСДОР изоляции. Это позволяет сократить время центрифугирования. Плотность градиентного центрифугирования в устройствах КСДОР изоляции и результаты регулярных трубы в аналогичных жизнеспособности, живой клетки подсчитывает обработанных репликацию, и пятно формирования. Независимо от типа труб, используемых для разделения, урожай Баффи пальто должны следовать сразу. Течение длительного периода времени контакта с средний градиент плотности цитотоксических для получения.

Точный подсчет жизнеспособных получения имеет важное значение для семян последовательно равное количество клеток в Пробирной тарелка скважин. Некоторые метод жить/мертвые дискриминации должны применяться. В нашей лаборатории мы используем Трипановый синий исключения пробирного и автоматизированных-счетчик соматических клеток.

Пятно качества, определяется как острые и высокой противопоставляется пятна, приведет к повышается точность и последовательное пятно подсчета голосов, особенно при использовании автоматизированной системы подсчета голосов. В соответствии с рекомендациями изготовителя мы наблюдали этанола до лечения ELISpot плит, чтобы стать решающим шагом уменьшить количество пятен фоновый и улучшить определение пятна. Настоятельно рекомендуется использовать пластину читателя образ ELISpot assay пластин в конце протокола. Оригинальные образы каждой скважины может быть легко и эффективно получены и хранятся. Использование изображений программное обеспечение для анализа цифровых изображений также позволяют для объективного анализа и пятно подсчета голосов по сравнению с ручной подсчет отдельными операторами.

Абсолютная необходимость для развития assay, описанные здесь был поколения подходящие анти свинки интерферона гамма антитела пара. Моноклональные антитела мыши V-E4 и N-G3 были разработаны путем гибридомной техника с клонами B-клетки от мышей, которые были сделаны прививки с рекомбинантным свинки интерферона гамма20. Сообщается, что V-Е4, которая изотипа IgG1, и N-G3, который IgG2a, связать оба антигена рекомбинантных и родной. Присвоение V-E4 как захват антитела и биотинилированным N-G3 как обнаружение антител привели к высокой чувствительности для рекомбинантных и родной белка при сохранении низких фонового сигнала в формате сэндвич ELISA. Обе антитела доступны для научного сообщества через производственные соглашения, во главе с лабораторией доктор Хьюберт Шефер, который является соавтором данного издания. Запросы будут получены лабораторией доктор Шефер и затем производимых коммерческим партнером.

Сообщается, что интерферон гамма быть неустойчивым в обычных буферов или СМИ21. Шефер 20 et al. сообщили лишь умеренное снижение темпов восстановления, при использовании деградировавших ИФН y, которая потеряла биологических функций, в формате ELISA, с использованием антител V-E4 и N-G3. Однако увеличивая время инкубации пептид стимулирования получения более 18 h должны тщательно проверяться.

Преимущества использования получения был обсужден. Однако здесь описано assay отражает только отзывы антиген специфические циркулирующих Т-клеток в периферии. Проникают в ткани Т-клетки или клетки изолированы от лимфатических органов, например, селезенке и лимфатических узлах, могут демонстрировать различные свойства22,23,24. Никаких существенных различий в клеточных реакций были замечены на сравнение интерферона гамма пятна от получения и splenocytes от морских свинок, которые были сделаны прививки с же pNP гриппа вакцины14.

В этом протоколе мы описали процедуру внутрикожные вакцинации. Главным обоснованием ID иммунизации является ориентация высокой плотности дендритных клеток в коже25. Мы и другие показали, что эти клетки могут быть конкретно адаптации метод доставки26, формулировка27или28наркотиков дизайн. Активированные профессиональный антиген представляющих клеток может перейти на Дренажный лимфатический узел и активировать адаптивной иммунной системы29,30,,3132. Дендритные клетки являются клетки тип представления основных антигена для грунтования продуктивной сотовых иммунных реакций.

Для этого исследования, которые были сделаны прививки животных с плазмидной ДНК кодирования Нуклеопротеиды гриппа H1N1 штамма A/PuertoRico/8. Кожи доставки этой вакцины pDNA (pNP) в сочетании с электропорации было показано, чтобы выявить антиген специфические гуморальные ответы в морских свинок33, хорьки и нечеловеческих приматов (Евросоюзе)1,34. Кроме того эта вакцина вызвала надежные ответы Т-клеток мышей после доставки в эпидермис35, которая может объясняться CD4 и CD8 Т-клеток, стимулируя с пептидами, представляющих конкретные epitopes для популяции этих клеток. Иммуногенность после слизистой доставки, как продемонстрировано поколения гуморальные ответы в кроликов и морских свинок, а также клеточного и гуморального ответы в мышей36pNP вакцины. Совсем недавно наша группа смогла продемонстрировать поколения ИФН γT-клеток ответов в кролика после межмышечная доставки (неопубликованные данные).

В настоящее время наблюдаемых пятен интерферона гамма в морской свинки ELISpot не могут выделяться подмножества CD4 + и CD8 + Т-клеток. Специально для проектирования и разработки иммунной терапии, ориентация на кожу было бы очень полезно определить ли наблюдаемые интерферона гамма пятно частоты вызваны расширением одного конкретного подмножества или сбалансированный ответ как для того чтобы Оцените эффективность вакцинации вызвать кросс презентация. Это ограничение можно преодолеть отрицательное сортировки клеток CD4 и CD8 до заполнения ячеек на плите или идентификации MHC класса II (CD4 ответы) или MHC класса I (для ответов CD8) ограничено epitopes.

Здесь описаны интерферона гамма ELISpot assay с использованием морской свинки получения устраняет необходимость оценки курс клеточных реакций в модели Лаборатория морской свинки. Это будет совершенствовать разработку вакцин и кожи протоколы доставки. Мы считаем, что она позволяет для трудоустройства этой соответствующих животных модели изучения заболеваний с важными компонентами Т-клеток как ТБ37, Эбола38,39HSV и другие. Это позволит сократить использование менее соответствующих животных моделей.

Раскрытие информации

Авторы Кэтрин Шультхайз, Холли м. Пью, Брайан S. Yung, Джанет Oh, Холли м. Pugh, Нгуен Jacklyn, Лоран Humeau, Кейт E. Бродерик и Тревор Smithare р.ф. сотрудники Inovio фармацевтических препаратов и таким образом получают зарплату и пособия, включая владение акций и опционов, от компании.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить членов Inovio фармацевтической R & D Департамента по оказанию технической помощи и сотрудников Acculab для обслуживания животноводства передового опыта. В частности мы хотели бы поблагодарить Алиша Vu и Джо Агнес для корректуры рукопись. Эта работа финансировалась не каких-либо конкретных грант от финансирующих учреждений в государственных, коммерческих, или не для некоммерческих секторах.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Устройство Cellectra-3PInovio PharmaceuticalsID-Electroporatio / некоммерческое, R& Пробирка
забора крови K2EDTA BD367844
Hank' s Сбалансированный солевой растворGibco 14175-079
Ficoll-Paque PlusGE Healthacre 17144003градиент плотности среды
SepMate tubeSTEMCELL Technologies85415PBMC-изолирующее устройство
RPMI Thermo Fisher11875-135
с термодеактивированным FBS VWR97068-085
Ручка/стрепстр Gibco 15140-122
  β-МеркаптоэтанолGibco 21985-023
96-луночный ЭЛИС ПВДФ-мембрана МиллипорMSIPS4W10ELISpot пробирная пластина
Ethanol Sigma459844-1L
UPDIInvitrogen10977-015Ультрачистая вода DI
 SigmaS7903
Бычья сыворотка альбуминSigmaA7906
10x PBSHyCloneSH30378.03
Конканавалин А (КонА) SigmaC5275-5MG
щелочная фосфатаза (ЩФ)-конъюгированная стрептавидин НИР D Systems Inc. SEL002
BCIP/NBT НИР D Systems Inc. SEL002
capture anti-sea sea IFN-& gamma антитело V-E4GenScriptOrder #:U5472CE080-3LOT # A217071153
биотинилированное обнаружение противоморское свинка IFN-γ антитело N-G3 GenScriptЗаказ #:U5472CE080-1LOT # A21700598
CTL S6 Micro AnalyzerImmunoSpot#S6MIC12автоматизированный планшетный считыватель ELISpot
Vi-CELL XRBeckman-Coulter731050автоматизированный счетчик клеток
ImmunoSpot 5.1ImmunoSpotпрограммное обеспечение для анализа анализа
ESCO Class II Type A2ESCOШкаф биобезопасности
Сетчатый фильтр для соколиных клетокCorning, Inc.VWR cat# 21008-952
Exel Comfort Point инсулиновый шприцMedLab Supply 26028
Rotanta 460RЦентрифугаHettich
Vi-CELL XR Quad Pak Набор реагентовBeckman Coulter383722
Incu SafePanasonic-Healthcareинкубатор
22 & микро; m ФильтрThermoScientific Закон VWR # 597-452022 & микро; m Фильтр
KimWipesKimberly-Clark Professional VWR кат# 21903-005 бумажные полотенца
для

Ссылки

  1. Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517(2008).
  2. Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
  3. Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
  4. Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
  5. Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
  6. Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
  7. St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B. Animal Models of Ebolavirus Infection. Comparative Medicine. 67 (3), 253-262 (2017).
  8. Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33(2017).
  9. Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
  10. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
  11. Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
  12. Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
  13. Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
  14. Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
  15. Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013).
  16. Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982(2014).
  17. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
  18. Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
  19. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).
  20. Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
  21. Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
  22. Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
  23. Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210(2015).
  24. Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33(2017).
  25. Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123(2013).
  26. Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
  27. Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
  28. Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
  29. Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
  30. Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
  31. Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054(2014).
  32. Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
  33. Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
  34. Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
  35. Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
  36. Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
  37. Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
  38. Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
  39. Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257(2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BCIP NBT

Похожие статьи