Здесь мы представляем методологий для оценки целостности мембраны spermatozoan, сотовой функция, связанный с спермы оплодотворение компетенции. Мы опишем три методики для оценки Флуориметрическое мембран сперматозоидов: одновременное окрашивание с конкретными флуоресцентных зондов, флуоресцентной микроскопии и передовые спермы посвященный проточной цитометрии. Также представлены примеры объединения методологии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Флуориметрическое методы для оценки мембран сперматозоидов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Стандартный спермиограммы, описывающих качество спермы главным образом основаны на физиологические и визуальных параметров, таких как объем эякулята и концентрации, подвижности и прямолинейное и морфология спермы и жизнеспособность. Однако ни один из этих оценок является достаточно хорошим предсказать качество спермы. Учитывая, что поддержание жизнеспособности сперматозоидов и оплодотворение потенциал зависит от целостности мембраны и внутриклеточных функциональность, оценки этих параметров может позволить лучше прогноза спермы оплодотворение компетенции. Здесь мы опишем три возможные методы для оценки качества спермы с помощью конкретных флуоресцентных зондов, в сочетании с флуоресцентной микроскопии или потока цитометрии анализы. Анализ начисленных плазматической мембраны целостности с помощью 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и пропидий йодидом (PI), методу мембраны целостности с помощью флуоресцеин конъюгированных Изотиоцианаты Pisum sativum агглютининов (FITC-PSA) и Митохондриальные мембраны целостность с помощью 5, 5', 6, 6'-тетра хлоро-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl карбоцианиновыми йодид (JC-1). Также представлены комбинации этих методов. Например использование annexin V в сочетании с PI флуорохромов позволяет оценки апоптоза и расчета доли apoptotic спермы (apoptotic индекс). Мы считаем, что эти методологии, основанные на изучении мембран сперматозоидов, очень полезны для оценки качества спермы.
Введение
Целостности и функциональности мембран сперматозоидов являются некоторые из факторов, свидетельствующих о спермы жизнеспособность и потенциал оплодотворение. Плазматической мембраны действует как барьер между внутриклеточные и внеклеточной отсеков, тем самым сохраняя сотовой осмотического равновесия1. Любой стресс, который вызывает повреждение целостности плазматической мембраны может ухудшить гомеостаза, уменьшить жизнеспособность и оплодотворение потенциала и повышения клеточной смерти. Например криоконсервация уменьшает жизнеспособность спермы из-за повреждения его плазматической мембраны, в результате изменений температуры и осмотического с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты проводились в соответствии с 1994 года израильские руководящие принципы защиты животных. Говядину спермы было поставлено коммерческих израильской компании для искусственного осеменения и разведения. Эякуляции 11 быков были оценены в этом исследовании.
1. спермы пробоподготовки
Примечание: Процедура основана на лабораторных рот протокол1,3.
- Получите примерно 1 – 6 мл спермы быков в 15 мл при комнатной температуре.
- Для каждого 1 мл спермы добавить 6 мл подогретую (при 37 ° C) NKM буфера (110 мм NaCl, 5 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 показывает оценки одновременного Флуориметрическое мембран сперматозоидов (плазма, методу и митохондриальных) с использованием PI, DAPI, FITC-PSA и JC-1. Оценка мембран сперматозоидов с помощью одновременных окрашивание с четырьмя флуоресцентных зондов позволяет, например, оценки доли спермы в каждой категории — жить против мертвых; высокий и низкий ΔΨm; нетронутыми против. повреждены Акросома — одновременно для каждого сп.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Спермы оплодотворение потенциал зависит от нескольких факторов, отражающих его качество. Высокая концентрация сперматозоидов и высокая доля весьма подвижных сперматозоидов может считаться высокого качества спермы. Тем не менее, такая оценка не принимать во внимание другие сотовые и функциональных параметров. Использование «стендовые» микрокапиллярной проточный цитометр может быть легко адаптирована для оценки различных структур спермы с использованием флуоресцентных зондов, как показано ранее другими17<.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что не существует никакого конфликта интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить израильская компания «СЬОН» для искусственного осеменения и селекции (Хефец Хаим, Израиль) за их помощь и сотрудничество и г-жа Li Na (IMV технологий, L'Aigle, Франция) для помощи с инструмент установки и обучения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-морфилино пропансульфоновая кислота] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO Sigma | D2438 | ||
| Абсолютный этанол | Sigma | 64-17-5 | |
| Гемацитометр | Гемоцитометр DAPI от Neubauer Germany | ||
| (4',6-диамидино-2-фенилиндол) | Флуоресцентный зонд | Sigma | D9542 |
| PI (йодид пропидия ) | Флуоресцентный зонд | Sigma P4170 | |
| FITC-PSA (флуоресцеин изотиоцианат-конъюгированный агглютинин Pisum sativum ) | Флуоресцентный зонд | Sigma | L0770 |
| JC-1 (5,5',6,6'-тетрахлор-1,1',3,3'-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианина йодид) | ENZOBiochem, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США | ENZ52304 | флуоресцентный зонд |
| Аннексин V конъюгированный с FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | флуоресцентный зонд |
| Аннексин V связывающий буфер 20x стоковый раствор | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | буфер |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Токио, Япония | инвертированный флуоресцентный микроскоп | |
| Nis Elements | Nikon, Токио, Япония | программное обеспечение | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Токио, Япония | цифровой фотоаппарат | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, Франция | микрокапиллярный проточный цитометр сперматозоидов | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Хейворд, Калифорния, США; распространяется программным обеспечением IMV Technologies | ||
| Буферный раствор для цитометрии | IMV Technologies, L'Aigle, Франция | 023862 | набор для |
| жизнеспособности и концентрации | IMV Technologies, L'Aigle, Франция | 024708 | набор для оценки жизнеспособности |
| Набор для митохондриальной активности | IMV Technologies, L'Aigle, Франция | 024864 | набор для митохондриальной активности Набор для оценки |
| жизнеспособности и целостности акросом | IMV Technologies, L'Aigle, Франция | 025293 | набор для оценки целостности акросом |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, США | программное обеспечение | |
| Сперма крупного рогатого скота | "SION", Израильская компания по искусственному осеменению и дридингу, Хафец-Хаим, Израиль |
Ссылки
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viabi....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
