Строительство многослойных мезенхимальных стволовых клеток листа с системой 3D динамичной культуры

Краткое содержание

Эта статья предоставляет метод эффективно и целесообразно для построения листы многослойного стволовых клеток с свойства благоприятные стволовых клеток.

Аннотация

Терапия стволовой клетки показывает многообещающее будущее в регенерации потерпевшего органов и тканей и клеток листа техника была разработана для улучшения удержания низкой клеток и бедными выживания в целевой зоне. Однако во время процесса строительства в vitro срочно необходима решение для сохранения стволовых клеток биологическую и увеличивая объем ячейки в ячейку листа. Здесь этот протокол представляет метод для построения клеток многослойного листа с благоприятным стволовых клеток биологическую и оптимальной работоспособности. Decellularized свинину перикарда (DPP) подготовлен фосфолипазы decellularization метод₂ (₂пла) как на эшафот ячейки листа, и изолированы и расширена в сеяный клетки костного мозга крысы мезенхимальных стволовых клеток (BMSCs). Временные многослойных клеточной структуры листа строится с помощью RAD16-я пептид гидрогеля. Наконец лист клетки культивировали с системой динамического перфузии стабилизировать структуру трехмерного (3D), и ячейку листа могут быть получены после 48-часовой культуры в пробирке. Этот протокол предоставляет метод эффективно и целесообразно для создания многослойных стволовых клеток лист и ячейку листа могут быть разработаны как продукт терапии благоприятные стволовых клеток в будущем.

Введение

Терапия стволовой клетки было сообщено как эффективным средством лечения многих заболеваний; Однако низкий ячейки хранения и бедными выживания в целевой зоне остаются критические вопросы, после инъекции традиционные стволовых клеток. Для решения этой проблемы, ткани инженерных ученые разработали технику ячейки листа. Однослойное ячейки листа с нетронутыми внеклеточная матрица сначала был подготовлен с помощью температуры ответ культуры блюдо¹, и его последующие исследования сообщили значительные улучшения сохранения стволовых клеток и выживания в infarcted Площадь^2,3. Среди методов создания многослойных ячейки листа было сообщено как эффективную стратегию для улучшения выживание клетки и клетки листа терапевтический эффект^3,4. С тех пор ученые работали на разработке методов строительства различных клеток листа для того, чтобы увеличить количество клеток, свойства стволовых клеток и механические свойства ячеек листов. До настоящего времени определенные типы клеток листа были построены и учился в лечении инфаркта миокарда⁵, хряща травмы⁶, и кожи раны⁷.

Биологическую стволовых клеток до пересадки показал возникающих влияние на регенерацию тканей потерпевшего, и стратегии строительства различных клеток листа имеют различные эффекты на стволовые клетки. С одной стороны вырожденная ячеек листов только состояла из высокой плотности стволовых клеток, и естественных внеклеточной матрицы могут быть приобретены укладки листов однослойное клетки⁸ или с помощью магнитных ткани, инженерной техники⁹. С другой стороны исследователи разработали различные леса для обеспечения адекватного механическую прочность и поддержки клеток роста^10,11,12, что позволило низкий стволовых клеток, заполнение плотности для обеспечения питания питания. Однако несмотря на эти подходы, поставки низкой эффективности питания в структуре многослойных ячейки листа остается серьезной проблемой во время строительства в пробирке . Таким образом эффективно и целесообразно ячейки листа строительство системы срочно требуется.

Этот протокол описывает шаги по подготовке multilayeredmesenchymal стволовых клеток (МСК) ячейку листа. В этой конструкции системы клетки листа механическую прочность обеспечивается DPP. Основываясь на этом леску, 3D клеточной структуры может быть быстро построен с RAD16-я пептид гидрогеля и динамический перфузия системы используется для культуры многослойных ячейки листа, чтобы стабилизировать 3D клеточную структуру листа и обеспечить достаточное питание поставка для клеток. С помощью этой системы, многослойных BMSC лист был успешно подготовлен и выставлены оптимального терапевтического эффекта на инфаркт миокарда крыс модель¹³.

Протокол

Все стволовых клеток и животных эксперимент процедуры были проведены согласно этические принципы национального руководства для ухода и использования лабораторных животных и одобрен Цзинань университета животное уход и использование Комитетом (Гуанчжоу, Китай).

1. Подготовка DPP леску с PLA₂ Decellularization метод¹⁴

Примечание: Смотрите Рисунок 1A схема метода decellularization₂ PLA.

1. Подготовка 100 мл раствора₂ 200 ед/мл PLA. Добавьте 0,5 g Дезоксихолат натрия и 2 мл₂ пла в 198 мл буферного раствора карбоната. Это решение следует использовать в течение 24 часов после его подготовки.
2. Получить свежие свиные перикарда (FPP) от бойни и вернуться в лабораторию в течение 1 ч.
   Примечание: FPP должны храниться при температуре 4 ° C во время транспортировки. 1.2-1.10 шаги должны проводиться с непрерывной тряски в контролируемой термостат водяной бане.
3. Тщательно промойте FPP с 200 мл фосфатного буферного раствора (PBS) содержащие пенициллин стрептомицина 1% в 500 мл стакан на 10 ° КСОР 10 мин повторить этот шаг 2 x.
4. Разделите FPP на два слоя и удаление жировой ткани с щипцами и ножницы.
   Примечание: Держите мокрый, добавляя 50 мл PBS FPP каждые 20 минут во время удаления жировой ткани.
5. Форма FPP в 10 x 10 см² шт с ножницами. Вымойте FPP с 200 мл буферного раствора карбоната (CBS), содержащие пенициллин стрептомицина 1% в 500 мл стакан на 10 ° C, за 10 мин повторить этот шаг 2 x.
6. Передача FPP к чистой воде и замочить на 10° C в течение 12 ч.
7. Замочите 10 x 10 см² образцы в 50 мл CBS, содержащие 200 ед/мл PLA₂ и раствор Дезоксихолат натрия 0,5% (w/v) при 37 ° C в течение 6 ч.
8. Стирать образцы с CBS, содержащих пенициллин стрептомицина 1% при 10 ° C на 10 мин повторить этот шаг 2 x.
9. Замочите каждого образца в 50 мл CBS, содержащие 200 ед/мл PLA₂ и раствор Дезоксихолат натрия 0,5% (w/v) при 37 ° C на 2 ч.
10. Стирать образцы с CBS, содержащих пенициллин стрептомицина 1% при 10 ° C на 2 ч. Повторите этот шаг для 10 x по крайней мере. Поместите образцы на плоских пластин и высушите их до постоянной массы в постоянной температуры печи при температуре 55 ° C.
    Примечание: Образец должен быть полностью высох. Взвесить образец DPP каждые 10 минут и повторить 3 x или до веса больше не изменяется.
11. Форма каждого образца DPP в круг 10,5 мм в диаметре с трепанации. Пакет каждого DPP в стерильных запечатанный пакет.
12. Стерилизация DPP образцы гамма облучение (25 КГР). Хранятся пробы DPP на 4 ° C перед использованием.
    Примечание: Все образцы могут быть сохранены на срок до шести месяцев при 4 ° C.

2. Подготовка к ячейке листа строительство

1. Автоклав все инструменты и компоненты тканей перевозчиком при температуре 121 ° C за 30 мин, в том числе 1,5 мл трубки и центробежных, щипцы, зубчатый щипцы, ножницы, черный баз (тканей перевозчиком компонент) и белый натяжение кольца (тканей перевозчиком компонент).
2. Подготовка 20 мл раствора стерильных 10% сахарозы. Вес 2 г сахарозы и распустить сахарозы в 18 мл ультрачистая вода. 10%-ая сахароза раствор при температуре 121 ° C за 30 мин или фильтр решение с 0,22 мкм фильтром автоклав.
3. Автоклав динамический перфузия системные устройства при температуре 121 ° C за 30 минут, включая газовый обмен оборудования, стеклянная бутылка 500 мл, контейнер культуры перфузии и соединительной трубки.
4. Подготовьте газобетона инструментов и тканей перевозчиком компоненты. Положите черный базовой частью ткани перевозчика в культуры блюдо.
5. Возьмите сушеные DPP леску и положил его в центре черный базы. Положить белый зажимное кольцо на эшафот DPP и исправить ее в держатель ткани.
   Примечание: Обеспечить эшафот полностью исправлена в ткани перевозчика и существует разрыв между базе черный и белый зажимное кольцо. Если нет, отдельные ткани перевозчика и исправить эшафот снова.
6. Добавьте 100 мкл питательной среды на эшафот DPP для регидратации.
   Примечание: Если леска не зафиксировано также в ткани перевозчика, питательной среды проникновения культуры блюдо.
7. Положите леску в инкубатор 37 ° C и позволить ему впитаться в течение 15 мин.

3. Подготовка клетки клетки листа строительства

Примечание: Этот протокол предназначен для культуры клеток с помощью блюдо 100 мм. Смотрите Рисунок 1B схема строительства многослойных клеточной структуры.

1. Изолируйте BMSCs¹³.
   Примечание: Этот метод предназначен для создания многослойных MSC ячейки листа. Крыса BMSCs используются в настоящем Протоколе. BMSCs изолированы с помощью метода сторонником всего костного мозга, и BMSCs расширенной в vitro получить достаточное количество клеток.
   1. Автоклав для документов при температуре 121 ° C 30 мин, в том числе щипцы, зубчатый щипцы, ножницы и. Подготовьте шприц 2 мл инъекций и BMSC культуры среднего (Дульбекко изменение средних [DMEM] орла, плода бычьим сывороточным 10%, 1% глютамина и 1% пенициллин стрептомицином).
   2. Усыпить три недельных самцов крыс Sprague-Dawley (SD), вывих шейного позвонка. Замочите животного в 100 мл 75% спиртового раствора в стакан за 5 мин.
   3. Принять животное из стакан и поместите его подверженных на операционном столе. Надрезать кожу на спине животного с ножницами и пинцет. Изолируйте кожи и мышечной тканях подвергать бедра бедра.
   4. Изолировать бедра бедра и положил его в 30 мл в пластиковых пробирок 50 мл ФСБ. Место два бедра бедра в одну трубу. Вихрь пластиковых пробирок тщательно мыть ткани. Повторите этот шаг 2 x.
   5. Вырезать обоих концах бедра с ножницами и разоблачить полости костного мозга.
   6. Аспирационная 2 мл BMSC питательной среды инъекции шприцом. Вставить иглу в полости костного мозга и промыть костного мозга с питательной среды. Промойте каждые два бедра бедра в одной культуры блюдо 100 мм.
   7. Для каждого 100 мм культуры блюдо добавьте 2 мл питательной среды в культуре блюдо. Положите культуры блюдо в инкубатора 37 ° C и статические культуры за 72 ч.
   8. Примите вне культуры блюдо из инкубатора. Замените супернатант 6 мл свежей питательной среды.
   9. Наблюдать за первичной BMSCs под микроскопом. После этого проход BMSCs каждые 5-7 d.
2. Возьмите клетки из инкубатора. Соблюдать клетки под микроскопом и выбрать подходящие клетки для строительства ячейки листа. Когда BMSCs достигают 80% - 90% слияния, клетки могут быть выбраны в сеяный клетки.
3. Удалите средство культуры из культуры блюдо. Осторожно промойте клетки с 2 мл теплой PBS. Удалите все PBS из культуры блюдо и сделать конечно не жидкие остатки. Добавить 2 мл 0,25% трипсина (или другой разъединять раствора) в блюдо и инкубировать при 37 ° C на 3 мин.
4. Остановить действие трипсина, добавив 2 мл питательной среды и осторожно промыть клетки от блюдо. Перенесите суспензию клеток в новых пластиковых пробирок 15мл. Центрифугировать клетки на 225 x g за 5 мин.
5. Удалите супернатант. Ресуспензируйте клетки с 3 мл раствора сахарозы 10% (w/v).
   Примечание: 10% (w/v) раствор сахарозы используется для стирки клетки для получения единой клетки гидрогеля смесь в следующих шагах.
6. Аспирационная 10 мкл суспензии клеток и подсчитать ячейки с Горяева. Вычислите объем, необходимые для следующего шага. Для одной ячейки листа используются три миллиона BMSCs.
7. Извлеките три миллиона клеток и перенести их в новых пластиковых пробирок 15мл. Центрифуга клетки на 225 x g за 5 мин.
8. Удалите супернатант. Ресуспензируйте клетки с 1 мл раствора сахарозы 10% (w/v). Передача в пластиковых пробирок 1.5 мл суспензии клеток.
   Примечание: С помощью центробежных трубки 1,5 мл выгодно для приготовления смеси клетки гидрогеля.
9. Центрифуга клетки на 260 xg 5 мин полностью удалить супернатант и получить клетки отложений.

4. Подготовка BMSCs и RAD16-я пептид гидрогеля смесь

Примечание: Смотрите Рисунок 1B схема строительства многослойных клеточной структуры.

1. Добавьте 20 мкл раствора сахарозы 10% (w/v) центробежные 1,5 мл. Нежно ресуспензируйте BMSCs и получить равномерное подвеска.
   Примечание: Не создавать любое пузырей во время ресуспендирования.
2. 20 мкл RAD16-я пептид Гидрогель в верхней части подвески. Аккуратно перемешать RAD16-я пептида и клеток подвеска с кончиком пипетки. Когда смешиваются суспензию клеток и гидрогелевые, нежно Пипетка смесь пару раз.
3. Взять DPP леску от перевозчика ткани и мягко аспирационная питательной среды с кончиком пипетки.
   Примечание: Убедитесь, что DPP эшафот полностью Регидратированные перед добавлением смесь клеток гидрогеля.
4. Аспирационная смеси и равномерно добавить его в DPP эшафот.
   Примечание: Общий объем смеси будет около 40-50 мкл. Рекомендуется добавить смесь 10 мкл в то время из центра за пределами леса.
5. Добавьте 1 мл питательной среды в нижней части ткани перевозчика. Положите лист ячеек в инкубаторе 37 ° C за 5 мин.
6. Примите вне ячейки листа из инкубатора. Аккуратно добавить 4 мл питательной среды в культуре блюдо и погружать ячейки листа. Положите лист ячеек в инкубаторе 37 ° C на 2 ч статической культуры.

5. в Vitro культуры 3D многослойных ячейки листа с помощью системы динамичной культуры

Примечание: Смотрите Рисунок 1 c схема 3D динамической системы.

1. Подготовка динамического перфузии системы, включая Перистальтический насос, газовое оборудование обмена, стеклянная бутылка 500 мл, контейнер культуры перфузии и соединительной трубки. Соберите систему динамический перфузия, как показано на рисунке 2.
2. Добавьте 200 мл питательной среды в стерильной стеклянной бутылке. Вставьте ячейки листа в зале культуры контейнера.
   Примечание: Обратите внимание на направлении верхней поверхности ячейки листа.
3. Добавить 3 мл питательной среды в контейнере ткани и закрыть контейнер. Системы динамического перфузии в инкубаторе и запуска насоса. Задайте скорость потока перистальтического насоса на 8 мл/мин культуры клеток листа в системе динамический перфузия за 48 ч.

6. получение многослойных MSC ячейки листа

1. Автоклав инструменты и компоненты тканей перевозчика при 121 ° C за 30 минут, включая центробежные 1.5 мл пробирок, щипцы и зубчатый щипцами.
2. Вытащите входной канал от стеклянной бутылки прекратить поставки питательной среды для контейнера.
   Примечание: Остановка Перистальтический насос, когда культура контейнер пуст.
3. Взять из ячейки листа из контейнера культуры и положил его в культуры блюдо.
4. Используйте один щипцы для иммобилизации перевозчик ткани и использовать другой зубчатый щипцы для разделения белый зажимное кольцо из черного базы. Наконец получения многослойных BMSCs ячейку листа.
5. Для коротких сохранения каждая ячейка листа могут быть переданы 1,5 мл центробежные с щипцами. DPP эшафот должен прилагаться к внутренней стенке центробежные трубки, и ячейку листа должны распространяться как можно в пластиковых пробирок.
6. Аккуратно добавьте 1 мл питательной среды в центробежных трубки погрузиться ячейки листа. Закройте крышку центробежные трубки и хранить клетки листа при 4 ° C.
   Примечание: Ячейки листа следует пересадить или проанализированы как можно скорее. Рекомендуется использовать ячейки листа в течение 4 ч.

Результаты

Схема строительства лист многослойных стволовых клеток показана на рисунке 1. Первым шагом является подготовка на эшафот ячейки листа методом decellularization₂ пла. Основываясь на эшафот, временного 3D клеточной структуры строится путем смешивания стволовых клеток с RAD16-1 пептида гидрогеля. С целью получения многослойных ячейки листа с благоприятным стволовых клеток биологическую и оптимальная механическая прочность, ячейку листа культивировали ...

Обсуждение

Настоящий Протокол сообщает эффективный метод для построения многослойных листов MSC. Эта ячейка листа экспонатов оптимальная механическая прочность, плотность посева высокой клеток и отпорности благоприятные стволовых клеток. Использование BMSCs в качестве примера, 3D клеточной структуры быстро построен с RAD16-я пептид гидрогеля. После быть культивировали в системе динамический перфузия, многослойных BMSC листа успешно получены и BMSCs поддерживать высокое выражение маркеры стволовых клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фосфолипазы A2	Sigma-Aldrich	P6534
Дезоксихолат натрия	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Фосфатный буфер	Gibco BRL	89033
Пенициллин стрептомицин / амфотерицин	Gibco BRL	15640055
Буферный бикарбонат	Sigma-Aldrich	C3041
Настольный концентратор	Changzhou Aohua Instrument Co.
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-014-CVR
Южноамериканская фетальная бычья сыворотка	Gibco BRL	10270-106/P30-3302
L-глутамин	Corning Cellgro	25-005-CI
0,25% трипсин/2,21 мМ ЭДТА	Corning Cellgro	25-053-CI
Шкаф биобезопасности	Esco,Сингапур	AC2-2S1
Инкубатор постоянной температуры	Эско, Сингапур	CLS-170B-8
Центрифужная трубка	Corning	430790
EP Трубка	Axygen	31617934
Центробежная машина	TOMOS	1-16R
Сахароза	Sigma-Aldrich	S9378-500G
Pura Matrix	BD	354250
Система динамического перфузионного культивирования	Minucells и Minutissue	D-93077
Перистальтический насос	Ismatec	IPC N8
Насосная трубка	Ismatec	Nr.1306
MINUSHEET 1300	Регенсбурга
Динамическая перфузионная система	MINUSHEET	Regensburg
MINUSHEET 0006	Регенсбургское		газообменное оборудование
MINUSHEET 0002	Regensburg		500 мл стеклянная бутылка
MINUSHEET 1301			контейнер для перфузионной культуры