Высоким разрешением узорной биопленки осаждения с pDawn-Ag43

Краткое содержание

Мы демонстрируем метод для депонирования бактериальных биопленок Escherichia coli в произвольные пространственные закономерности с высоким разрешением с помощью оптических стимуляции генетически закодированный адгезию поверхности конструкции.

Аннотация

Пространственная структура и кучность играют важную роль в бактериальные биопленки. Здесь мы показываем, доступный метод для культивирования кишечной биопленки в произвольных пространственных моделей с высоким пространственным разрешением. Техника использует конструкцию генетически закодированный optogenetic — pDawn-Ag43 — это пары биопленки в E. coli оптических стимуляции, синий свет. Мы подробно процесс преобразования кишечной палочки с pDawn-Ag43, подготовка необходимых оптических set-up и протокол для культивирования узорной биоплёнки с помощью pDawn-Ag43 бактерий. Используя этот протокол, можно узорной биоплёнки с пространственным разрешением ниже 25 мкм на различных поверхностях и сред, включая замкнутые камеры, не требуя микротехнологий, чистота-услуги или подготовка поверхности. Метод является удобным и подходящим для использования в приложениях, которые исследовать эффект биопленки структуры, обеспечивая настраиваемый контроль над биопленки кучность. Более широком смысле он также имеет потенциальные применения биоматериалов, образования и био Арт.

Введение

Биоплёнки являются придает поверхности сообществ микробов и хорошо известны за их сильные структуры функция сцепления. Пространственной геометрии и кучность биоплёнки играют важную роль в общей функции сообщества (и наоборот)¹. Малая длина шкалы участвует в структуре биопленки — порядка десятков мкм²— сделать настраиваемый и удобный контроль над биопленки, кучность является сложной проблемой. Здесь мы показываем, протокол, который позволяет для биоплёнки быть точно рисунком в произвольной геометрии, основанный на оптические освещения.

Представленные здесь протокол использует pDawn-Ag43³, optogenetic конструкцию, что пары биопленки бактерий E. coli оптическое освещение, ведя выражение Ag43 (принимает ген, ответственный за поверхности сцепления и биопленки формирование) под контролем pDawn⁴ (транскрипционный анализ регулятор, контролируемых оптическое освещение). Этот метод удобно использовать и может биоплёнки шаблон на различные поверхности средах, в том числе закрытых (прозрачный) культуры камер. По сравнению с существующими методами осаждения ячейки, например осаждения на основе капли⁵ или поверхности prepatterning/лечения⁶, pDawn-Ag43 не требует микротехнологий или чистый номер Услуги и не требуют материалов, помимо тех, которые доступно для типичного микробиологической лаборатории. Она способна узор с пространственным разрешением ниже 25 мкм, приближается к пространственные размеры microcolonies естественно существующих биоплёнки². В целом этот метод обеспечивает возможность манипулировать биопленки структура, которая затем открывает много возможностей для изучения микробиоценоза в бактериальных сообществ⁷. Кроме того узорные биоплёнки может предоставить удобную платформу для инженер полезные биоматериалов^8,9. В этой статье мы обсуждаем основной протокол, необходимые для структурирования биоплёнки с помощью pDawn-Ag43 и устранения потенциальных изменений и устранения неполадок, связанных с методом.

Протокол

1. Подготовка pDawn-Ag43 штаммов бактерий

1. PDawn-Ag43 Превратите штамм E. coli интерес (рис. 1).
   1. Расти штамм клонирования, хостинг плазмида pDawn-Ag43 (доступный из репозитория плазмида) путем прививки штамм в LB отвара дополнена 50 мкг/мл спектиномицин (LB + спецификации) в трубу культуры (ночевка в тряску инкубатор на ~ 250 об/мин, 37 ° C). Затем используйте набор алкалический урожай плазмида очищенный pDawn-Ag43¹⁰.
   2. Выберите штамм E. coli интерес к быть сделанный по образцу. До сих пор было проверено pDawn-Ag43 для работы в MG1655³ и BW25113.
   3. Использовать протокол для создания компетентных (например, химически компетентным¹¹ или¹²electrocompetent) запасов выбранного штамм E. coli (например, MG1655).
   4. Трансформировать плазмида pDawn-Ag43 в компетентные бактерий^11,12, следуют восстановления 1 h и пластины на LB + плиты спектра агара. Разрешить колоний расти на ночь при 37 ° C.
2. Магазин pDawn-Ag43 преобразован штаммов.
   1. Прививок одной колонии pDawn-Ag43 от фунтов + спец плита агара в LB + спец бульон в трубке культуры и расти в тряску инкубатора (на ~ 250 об/мин, 37 ° C) для экспоненциальной фазе (OD600 ~0.4 - 0,8).
   2. Подготовьте складе для хранения штамм pDawn-Ag43 превращается в-80 ° C долгосрочный, смешивая 1 мл культуры с 1 мл 50% стерильный глицерина в крио трубка для получения 25% глицерина морозильник складе. Храните это в морозильной камере-80 ° С.
   3. Если дополнительные плазмид (например, флуоресцентный репортер плазмид) должны быть преобразованы, создание компетентных клеток^11,12 от pDawn-Ag43 превращается деформации и повторите процесс трансформации^{11 , 12} для дополнительных плазмид, по мере необходимости.
      Примечание: Если с помощью электропорации⁸, возможна cotransform несколько плазмидов (включая pDawn-Ag43) одновременно; Однако одновременное преобразование не рекомендуется использование методов химического преобразования, как большой размер (> 10 КБ) pDawn-Ag43 означает, что уменьшается эффективность преобразования.

2. Подготовка Set-up оптический проектор для освещения бактерий

1. Получения бактериальной инкубатор с непрозрачными стенами и отверстие для передачи кабели, портативный проектор, способных установки и функционирования внутри бактериальной инкубатора, и ноутбук оснащен программным обеспечением для презентации проекции (см. таблицы Материалы). При выборе проектора и инкубатор, убедитесь, что это меньше, чем внутренняя высота инкубатора расстояние минимальный фокусировки проектора.
2. Расположить проектор внутри инкубатора внизу, с апертурой указывая прямо вверх, на потолок, где находится камера культуры биопленки прилагается (рис. 2).
3. Исправление, проектор в месте, создав set-up с оптическим макет базового подключен к вертикальной пост, в свою очередь подключены к горизонтальной пост какие винты в проектор (рис. 2). Обратите внимание, что эта настройка может быть изменен в зависимости от проектор/доступных частей. В конечном счете ключевым требованием является, что проектор прочно фиксируется в нижней части инкубатора, с диафрагмой, указывая вверх.
4. Подключите ноутбук через кабель дисплея (например, HDMI) к проектору внутри инкубатора.
5. Если поверхности — особенно потолок — внутренних дел инкубатора являются Светоотражающий (например, полированной поверхности металла), накрыть их темные матовые поверхности, чтобы свести к минимуму размышления.
6. Используйте ленту для присоединения пустой «Макетные» культуры блюдо к потолку инкубатора. Обратите внимание, что, как с проектором, есть несколько приемлемых способов приложить культуры блюдо; Убедитесь, что поверхность прозрачной нижней палаты культуры, где происходит освещение, не покрыта.
7. Отрегулируйте фокус на проекторе, поворачивая ручки фокусировки, так что плоскости фокусировки совпадает с нижней поверхностью биопленки культуры блюдо (например, хорошо пластины) прикреплены к потолку инкубатора (рис. 2). Проектор должен осветить резкий, не размытые изображения на нижней части культуры блюдо. Удалите «Макетные» культуры блюдо после того, как проекция была оптимизирована.
8. С помощью программного обеспечения ноутбук, прямые проектор для освещения полное поле зрения с максимальной синей подсветкой (например, RGB = [0, 0, 255]), представляя полный синий слайд.
9. Измерьте интенсивность подсветки проектор, используя Измеритель оптической мощности, поместив головку фотоприемника в инкубатор потолок и чтения интенсивности на соответствующей мощности метр калиброван легкие волны 460 Нм. Следуйте инструкциям по подключению и калибровке Фотоэлемент для конкретных ваттметр используется.
   1. Уменьшения освещенности (например, выключить свет номер, или разместить инкубатор вдали от источников света) насколько это возможно, до принятия измерения интенсивности освещения.
10. Регулировать интенсивность освещения, с помощью регулируемой нейтральной плотности фильтра размещены на проектор диафрагмы. Поверните фильтр для регулировки освещенности измеряется измеритель мощности, до тех пор, пока интенсивность освещения в центре региона прогнозируемых синий свет читает 50 мкВт/см².
    Примечание: Хотя это можно регулировать интенсивность освещения с помощью нижней голубой RGB-значений на конце программного обеспечения, используя фильтр, в то время как максимальное значение синий RGB имеет преимущество максимального оптического контраст системы между освещенной vs. темные области.
11. Рисовать произвольные шаблоны, используя программное обеспечение презентации/проектор на ноутбуке и отображать эти шаблоны на потолке инкубатора, с использованием проектора.
    Примечание: Биопленки формирование регионов следует использовать с максимальной синей подсветкой (например, RGB = [0, 0, 255]), не образуя биопленки регионов с без подсветки (например, RGB = [0, 0, 0]).

3. культивирование узорной биопленки

1. До освещения Подготовьте pDawn-Ag43 бактерий, начиная от глицерина морозильник акций, таким образом, чтобы они надежно индуцированной в конце фазы экспоненциального роста для освещения (рис. 3A).
   1. Полоска из глицерина запасов на LB + плиты спектра агара штамм pDawn-Ag43. Разрешить колоний расти на ночь (37 ° C).
      Примечание: Здесь до освещения культуры шаг, убедитесь, клетки остаться в темноте как можно больше — короткие периоды на окружающего освещения (например, для subdilution) являются приемлемыми.
   2. Прививок колонии pDawn-Ag43 бактерий из агар пластины в LB + спец бульон и расти культура на ночь для стационарной фазы (в тряску инкубатор ~ 250 об/мин 37 ° C, ~ 16 ч).
   3. Subdilute культура в соотношении 1:1,000 с LB + спец бульон (например, добавить 1 мкл ночь культуры в 1 мл свежего LB + спецификации).
   4. Разрешить subdiluted культуры расти до конца экспоненциального/начале стационарной фазы (ОД ~ 1.0, ~ 6 h в тряску инкубатор на ~ 250 об/мин, 37 ° C).
   5. Время ожидания для культуры расти, подготовить M63 СМИ с 1 x M63 соли, 1 мм MgSO₄, 0,2% раствор глюкозы, 0,1% casamino кислот и спектиномицину 50 мкг/мл в воде (обеспечение составные части стерильны).
   6. Subdilute конце экспоненциальной фазе культуры в соотношении 1: 100 с M63 СМИ дополнена 50 мкг/мл спектиномицину. Затем ввести разрежения в биопленки культуры блюдо (например, Пипетка разреженных образца в хорошо плиту).
      Примечание: Объемы, необходимые для этого масштаба 1: 100 subdilution зависит от культуры блюдо используется (например, при использовании полистирола 6-Ну хорошо плиты [не ткани Культура лечение], один образец потребует добавления 20 мкл культуры 2 мл M63 + спецификации, как Стандартный хорошо объем 6-ну плиты составляет ~ 2 мл).
2. Поскольку образцы теперь готовы для освещения, лента культуры блюдо к потолку инкубатора, обеспечивая что поверхность в нижней части блюдо является прозрачным для освещения снизу проектора.
   Примечание: Это важно для обеспечения того, чтобы потолок инкубатора не отражающей способностью, чтобы свести к минимуму бродячих освещения. Бродячих освещения можно также уменьшить, используя черный стенками пластин как культура блюда, хотя это не является строго необходимым — если с помощью таких плит, обеспечить нижней поверхности является прозрачным.
3. Разрешить биоплёнки к культуре в инкубаторе на ночь (16 h с не встряхивания, при 37 ° C). Обратите внимание, что некоторые Проекторы становятся менее надежными при более высоких температурах. Если это так, культуры при более низких температурах (например, 30 ° C), имея в виду, что время инкубации может потребоваться увеличить, в зависимости от штамма кишечной палочки .

4. изображений узорной биопленки

1. После ночи роста образцов биопленки удалите культуры блюдо из инкубатора. Блюдо будет иметь биопленки бактерий, прилагается к его нижней поверхности, где он осветил, а также планктонных бактерий, диспергированных в жидких средах выше.
2. Выбросите планктонных клетки путем удаления жидких сред из культуры блюдо (например, от нежно аспирационных с пипеткой).
3. Промойте образца 2 x с раствором фосфат амортизированное saline (PBS), чтобы удалить оставшиеся планктонных клеток (рис. 3B), осторожно дозирование в PBS, следуют аспирации.
4. Если клетки дневно меткой, непосредственно изображения образцов с помощью флуоресцентной микроскопии¹³ (например, поля¹³, 3-D конфокальный¹⁴, и т.д.).
   Примечание: Флуоресцентные биоплёнки могут также сохраняться с помощью ЖСС монтажа средних. Нанесите одну каплю монтажа СМИ образец биопленки, накрыть стеклянной coverslip, стараясь не захватить любые пузыри под и позволить ему затвердеть на ночь перед изображений.
5. Если используются бактериальные клетки не помечены дневно, примените Фиолетовый Кристалл пятно техника¹⁵ (рис. 3B) для повышения контраста биопленки до изображений.

5. Протокол изменений/альтернативы

1. Растут pDawn-Ag43 бактерий на различных поверхностях.
   1. Стекла или поли диметил силоксановые (PDMS) купоны (например, coverslips или тонкой полоски PDMS) в хорошо пластины перед добавлением бактериальной образца/освещение и следить за тот же протокол как раньше для модели pDawn-ag43 биопленки на стекле и PDMS.
2. Растут pDawn-Ag43 бактерий внутри культуры транспарентного, замкнутые камеры.
   1. Создания плесени палаты культуры для PDMS.
      1. Основные культуры камеры генерировать формы Подключив жесткий, Прямоугольные призмы к плоской поверхности (призму станет полости в PDMS, который служит в качестве палаты культуры после литые формы). Обратите внимание, что более сложные формы палаты культуры могут быть изготовлены с помощью мягкой литографии¹⁶.
   2. Литой PDMS полости, наливая PDMS в плесень и позволяя его вылечить (протокол подробный мягкой литографии, см. в JoVE на науки образования базы данных¹⁶).
   3. После отверждения, обрезать любой избыток PDMS, punch впускных/выпускных каналов в камеру полости/культура и облигаций полости на плоской поверхности (например, стекло/Полистирол) с усилием нажать PDMS на плоскую поверхность, оставляя полости между поверхностью и PDMS потолок в зале культуры биопленки.
      Примечание: Можно также использовать более постоянного связывания на основе плазменной обработки¹⁶ , но затем фишки не будет повторно.
   4. Следуйте протоколу культуры, как прежде, используя шприц с тупым кончик иглы (вместо пипетки) ввести бактериальных образца в культуре камеры/полоскания с PBS буфера (рис. 3 c).
      1. Если временно кабального полости, используйте только отрицательное давление тянуть жидкости в сутки камеры, обеспечить что полости не стали несвязанных от подстилающей поверхности стекла/полистирол.
3. Растут pDawn-Ag43 бактерий с помощью фильм фотошаблонов для структурированного освещения.
   1. Дизайн-шаблон биопленки, с использованием САПР совместимы со службой печати принтер photomask фильм. Photomask фильм дизайн должны быть ясными в регионах, где биопленки предназначен для печати и черный/непрозрачный других. Когда заполните, отправьте файл photomask обслуживание принтера/печати и ждать возвращения физического photomask.
   2. Поручить проектор для освещения полное поле зрения с максимальной синей подсветкой (например, RGB = [0, 0, 255]) с помощью программного обеспечения ноутбук.
   3. Вырежьте из региона интерес со стороны крупных photomask фильм и ленты, он прямо к нижней части биопленки культуры блюдо перед представляя бактериальных образца для ночного освещения (рис. 3D). Культура биоплёнки как раньше и удалить photomask после культивирования, до изображений.

Результаты

Как показано на рисунке 4A, pDawn-Ag43 бактерии были использованы для создания биоплёнки узорной в хорошо плит с проектор освещения (проектор был установлен для освещения шаблон горошек), образы через brightfield микроскопии с кристаллом фиолетовые пятна контрастного вещества, и микроскопии флуоресцирования, с использованием красного флуоресцентный белка выражая бактерий. Флуоресцентный биопленки образцы можно также образы с помощью конфокальной микроскопии¹⁴ для получения изображения биопленки в 3-D (рис. 4В). В рисунке 4 cмы иллюстрируем разрешением патронирования можно с помощью фильм фотошаблонов для узорной освещения в образце биопленки. Наконец, в рисунке 4 d и 4E, мы показываем примеры кучность на стекла и PDMS поверхностей, а также закрытых камерах PDMS культуры — они иллюстрируют различные типы сред, где может применяться кучность pDawn-Ag43.

Рисунок 1: подготовка pDawn-Ag43 бактерий (протокол раздел 1). Подготовка pDawn-Ag43 бактерий, способных света регулируемых биопленки включает очистки pDawn-Ag43 плазмиду с хоста клонирование штамм, превращая его в штамм E. coli интереса и создание фондовой бактериальных морозильник для долгосрочного хранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: подготовка оптический настройки для освещения образца биопленки (протокол раздел 2). Оптических set-up расположен внутри бактериальной инкубатора и состоит из компьютер подключен проектор, освещающая образец биопленки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Культура протокол для структурирования биоплёнки (протокол раздел 3). (A) до их освещения, pDawn-Ag43 бактерии готовят до кучность таким образом, что они надежно наведены на этапе надлежащего роста. (B) после того, как ночь освещается рост, узорные биофильмов будет присутствовать в нижней части культуры блюдо, наряду с планктонных клетки в жидких средах, и после некоторых дальнейшей обработки, биопленки готова к визуализации. (C) как альтернатива хорошо пластины, биопленки можно культивировали в закрытых культуры камер как литьевые полости PDMS. В этом случае шприцы, прилагается к тупым кончик иглы может использоваться для внедрения образца и промойте жидкости из камеры. (D) как альтернатива шаблонов на основе проектор освещения, шаблоны могут создаваться лентой фильм фотошаблонов непосредственно к нижней палаты культуры биопленки. В этом случае следует настроить проектора загорается синий свет через полное поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: представитель результаты биоплёнки узором, с помощью pDawn-Ag43. Все результаты были получены с помощью штамм E. coli MG1655 узла. (A) pDawn-Ag43 бактерии были использованы для создания биоплёнки узорной в хорошо плит с проектор освещения (проектор был установлен для освещения шаблон горошек), образы через brightfield микроскопии с Фиолетовый Кристалл пятно как контрастное вещество и микроскопии флуоресцирования, с использованием красного флуоресцентный белка выражая бактерий. (B) флуоресцентных биопленки образцы отражаются с помощью конфокальной микроскопии для получения объемного изображения биопленки. (C) с высоким разрешением биопленки можно узорной с фильма фотошаблонов для узорной освещения в образце биопленки. (D) биопленки можно узором на поверхности PDMS и стекла. Биоплёнки (E) можно узором в закрытых культуры камер. Эта цифра была адаптирована из предыдущей работы³. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Проблема	Возможные причины/решения
Tranforming pDawn-Ag43 в хост-штамм - нет колонии	Низкая концентрация плазмида - проверить плазмида концентрация на спектрометре. Типичный алкалический pDawn-Ag43 должна принести по крайней мере 100 нг/мкл; Используйте до 10-100 нг для преобразования
Проверка/римейк сведущие клетки: сведущие клетки должны иметь эффективность преобразования по крайней мере 10 ^ 6 кое/мкг, проверяются с помощью стандартного плазмида например pUC19 - если нет, римейк сведущие клетки
Неправильно (уровень) антибиотик на табличке агар LB - не забудьте использовать 50 мкг/мл спектиномицин для выбора
Проектор освещения превращает off / несовместимыми на ночь	Отключение проблемных программного обеспечения таких как: автоматическое обновление программного обеспечения/OS в ночь, ночь время синий свет фильтр
Проектор может перегрев - набор инкубатор для низкой температуры, а проектор включен (например 30 ° C вместо 37 ° C) - Примечание проектор как источник тепла может перегреться инкубатор после застывания
Удалите ненужные источники влажности из инкубатора, как они могут повлиять на проектор-Электроника
No/низкий уровень биопленки формируется после ночного освещения, рост не планктонных клетки либо (т.е. жидкость ясно)	Антибиотик неправильно (уровень) - не забудьте использовать 50 мкг/мл спектиномицин
Проверьте, что все должным образом добавляется M63 рецепт
No/низкий уровень биопленки формируется после ночного освещения, только планктонные клетки (т.е. жидкость мутная)	Проверьте свет уровень, проектор должен осветительные синий свет на 50 мкВт/см ^ 2 в 460 Нм длины волны
Попробуйте позволить бактерии растут на короткий/длительный срок после 1: 1000 фунтов subdilution шаг перед добавлением M63
Restreak бактерий на табличке LB, начать с свежие колонии для создания культуры ночи стационарной фазы
Обеспечить проектор работает последовательно на ночь - см. выше пункт
Нечетких биопленки шаблоны, высокий уровень фонового шума	Уменьшить рассеянный свет от системы оптического освещения, отражающей поверхности на интерьер инкубатора
Рассмотрите возможность использования на основе фотошаблонов (в отличие от проектора основе) структурированного освещения
Убедитесь, что проектор должным образом ориентирован на поверхности нижней палаты культуры биопленки

Таблица 1: Общие, устранение неполадок.

Обсуждение

С учетом необходимости исследовательских инструментов, которые позволяют биопленки структуры управления мы представили это easy-to-use протокол для структурирования бактериальных биопленок, с помощью конструкции optogenetic pDawn-Ag43. С этой техникой кишечной биопленки можно оптически узором на различные поверхности среды, включая замкнутые камеры, с пространственным разрешением ниже 25 мкм.

В целом, этот протокол может быть разбита на четыре основных раздела: (1 Подготовка бактерий, pDawn-Ag43, (2 Подготовка оптического и аппаратные настройки культуры, (3 шаги предварительной освещения рост бактерий и (4 после освещения полоскания и изображений.

Важной частью раздела 1 является успешное превращение плазмида pDawn-Ag43 в штамм E. coli интерес. Этому способствует изоляции высокого качества очищенные плазмид и создания компетентных клеток высокого качества для преобразования (Таблица 1, устранение неполадок).

Важной частью раздела 2 является оптимизация проектора set-up так что освещенности корректируется до 50 мкВт/см² на длине волны 460 Нм, и проектор правильно ориентирован на высоте образца биопленки. Обратите внимание, что в настоящем Протоколе, мы описываем set-up Перевернутый освещения, где проектора излучает свет снизу, вверх к биопленки образца. Преимущество этой настройки является, что свет только нужно пройти через нижнюю часть культуры блюдо до достижения поверхности образования биопленки. Подсветка сверху означает, что свет будет путешествовать через жидких сред над поверхностью биопленки, который, в ходе роста, получает облачно с планктонных клеток. Помимо этих проблем, это также важно для сведения к минимуму рассеянного света в оптической системы как можно больше, например, путем покрытия до отражающих поверхностей на интерьер инкубатора — это помогает получить резким рисунком биопленки. На соответствующую записку острее биопленки шаблоны можно также получить с помощью фотошаблонов для управления освещением патронирования (3D рисунок, Рисунок 4 c). Общие вопросы, требующие устранения неполадок включают вопросы надежности проектора при более высоких температурах (например, 37 ° C), которые могут быть уменьшиты инкубации биопленки роста при более низких температурах (например, 30 ° C), а также компьютерного программного обеспечения, Причины обновления операционной системы или синий свет, фильтрации во время ночи роста (Таблица 1). Важно также отметить, что, в зависимости от модели проектора и инкубатор используется, это также возможно, что тепла от проектора приведет к более высокой температуры внутренних чем инкубатора установить температуру, которая может потребоваться исправить.

Важной частью раздела 3 является получение надежные и повторяемые бактериальные образцы, прежде чем они индуцированных освещения. По этой причине мы рекомендуем вам получить клоновых колоний бактерий, pDawn-Ag43, мелирование их вне на плите агар и затем с помощью жидкого культуры шаги для обеспечения того, чтобы бактерии освещенные индуцированной в конце фазы экспоненциального роста в повторяемые образом.

Наконец важнейшей частью раздела 4 является тщательно, но также осторожно, смыть планктонных клеток, оставшихся после биопленки, кучность протокола; Таким образом рекомендуется выполнить несколько шагов нежно полоскания с PBS.

По сравнению с существующими методами для клеток патронирования^5,6, оптические биопленки, кучность на основе pDawn-Ag43 имеет достаточно низкий барьер входа для использования, в том, что она не требует микротехнологий, чистота помещений, комплекс Химия, или подготовка поверхности, пока еще в состоянии картины с высоким разрешением (25 мкм), обычно связанные с микротехнологий методов. Этот метод расширяет предыдущие работы на бактериальных фотолитографии для контроля ген выражение¹⁷. В настоящее время pDawn-Ag43 плазмиды ограничивается E. coli, как он использует на основе МПУЕ происхождения репликации, но pDawn и Ag43 являются совместимыми в других (грамотрицательные) бактериальных видов. Генетические методы доступны для потенциально представляя свет регулируемых биопленки различных видов бактерий и представляет возможные направления будущих исследований. Другим потенциальным ограничением методики является, что она работает путем увеличения биопленки в штаммов с слабой родной биопленки (например, MG1655 E. coli). Однако штаммы с сильным родной биопленки имеют форму биоплёнки независимо от условий освещения, исключающие узорной биопленки, с помощью pDawn-Ag43 как описано здесь; еще optogenetic методы по-прежнему может оказаться применимым в регулировании биопленки. Мы отмечаем, что в других контекстах, альтернативные методы структурирования биопленки могут быть доступны, например через оптические c ди GMP модуляции¹⁸.

В целом, pDawn-Ag43 на основе структурирования будет подходящим для использования в приложениях, которые исследовать эффект биопленки структуры на функция¹ и, таким образом, могли бы воспользоваться перестраиваемый контроль над биопленки патронирования — особенно актуально Пример для выделения является изучение микробной экологии в биопленке². Будущие направления деятельности включают в себя рисунком биоматериалов^8,9 и/или структурированные бактериальных сообществ. Альтернативные приложения этот доступ протокола также включают в себя био искусства¹⁹, учитывая ясно эстетический потенциал, а также науки о жизни формального и неформального образования^20,21,22. С образовательной точки зрения, протокол, описанные здесь сочетает в себе многие соответствующие методы (бактериальной культуры, преобразование, оптика/Оптогенетика) и также модульно удлиняемым (например, включать микрофлюидика).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DH5alpha/pDawn-Ag43	Addgene	107742	DH5alpha клонирование штамма, содержащего плазмиду pDawn-Ag43 - плазмиду необходимо переместить в интересующий штамм E. coli перед использованием
MG1655 E. coli Coli	Genetic Stock Center - Yale University	CGSC #6300	MG1655 был использован в качестве представляющего интерес штамма E. coli в репрезентативных результатах этой статьи
экспрессия RFP плазмиды	iGEM biobricks	J04450-pSB4K5bb	Существует множество вариантов получения флуоресцентных бактерий - при использовании плазмиды убедитесь, что позвоночник не конфликтует с colE1 ori pDawn-Ag43
Plasmid miniprep kit	Qiagen	27104
LB бульонный порошок	Affymetrix	75852	Добавьте 20 г/л в воду, автоклав, добавьте 50 мкм; г/мл спектиномицина для получения стерильного LB+spec
LB порошок агара	Affymetrix	75851	Добавить 35 г/л в воду, автоклав, добавить 50 мкм; г/мл спектиномицина, налить в чашки Петри, чтобы получить стерильные пластины LB+spec Чашки
Петри	Fisherbrand	431760
Спектиномицина гидрохлорид пентагидрат	abcam	ab141968	Сделать 1000x бульон 50 мг/мл в воде, фильтр стерилизовать и развести в среду по мере необходимости
Глицерин	Sigma-Aldrich	G5516	Смешать в соотношении 1:1 с водой, стерилизовать автоклавом или фильтром до получения 50% глицерина
Медиа соли M63 5X раствор	Bio-world	705729	Добавьте аминокислоты Cas, глюкозу и MgSO4, доведите концентрацию солей до 1X путем добавления стерильной воды
Casamino acids	Amresco	J851	Сделайте 20% запаса в воде, отфильтруйте стерилизуйте и добавьте в M63 в качестве добавки (конечная концентрация 0,1%)
D-глюкоза	Sigma-Aldrich	G8270	Заварить 20% бульона в воде, отфильтровать простерилизовать и добавить в M63 в качестве добавки (конечная концентрация 0,2%)
Сульфат магния	Sigma-Aldrich	M7506	Заварить 1 М бульон в воде, автоклаве и добавить в M63 в качестве добавки (конечная концентрация 1 мМ)
Кристаллическая фиалка	Acros organics	212120250	Разбавить до 0,1% в воде перед использованием
Самозатвердевающий монтажный материал (Shandon immumount)	Thermo Scientific	9990402	Использовать для длительного хранения образцов для флуоресцентной визуализации
Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)	Gibco	10010023	Также можно использовать PBS, приготовленный из порошка / таблеток
6 лунок	планшет Fisherbrand	351146	Используется в качестве чашки для биопленочной культуры для репрезентативных результатов
PDMS kit Dow		SYLGARD 184	Может использоваться для создания закрытых микрокамерных полостей с использованием мягкой литографии
1 мл шприц	BD	309659	Для использования при работе с жидкостями с закрытыми микрокамерами
Игла с тупым концом	CML Supply	901-23-050	Прикрепляется к шприцу объемом 1 мл
Лабораторная лента	Fisherbrand	15-901	Используется для крепления камеры культуры к потолку инкубатора
Бактериальный инкубатор	Sheldon Manufacturing	SMI6	Убедитесь, что внутренняя высота инкубатора достаточна для фокусировки проектора на потолке
Портативный проектор		Ivation IV-PJ-PRO-4-1	Существует множество моделей портативных проекторов, pDawn-Ag43 был протестирован с несколькими моделями, включая светодиодные/лазерные, с каналом синего света в диапазоне от 450-460 нм центральной длины волны
Оптическая макетная плата	ThorLabs	MSB6	База для оптической установки для удержания проектора - многие другие возможные конфигурации, просто нужно крепко удерживать проектор в нижней части инкубатора, направленной вверх
Оптическая стойка	ThorLabs	TR8	Необходимо 2 стойки - одна устанавливается вертикально из основания макетной платы, другая горизонтально крепится с помощью прямоугольного зажима
Оптический столб прямоугольный зажим	ThorLabs	RA90	Соединяет вертикальные и горизонтальные стойки
Монтажное основание	ThorLabs	BA1S	Соединяет оптическое основание макетной платы и вертикальный столб
1/4"-20 винт	ThorLabs	SH25S050	Крепит вертикальный столб к монтажному основанию, монтажное основание к основанию макетной платы
1/4"-20 установочный винт	ThorLabs	SS25E63D	Соединяет горизонтальный столб с проектором через отверстие для винта штатива
Измеритель оптической мощности	Newport	840	Использование с детектором измерителя мощности для измерения интенсивности освещения проектора - существует множество моделей измерителя мощности, использование одного с выдвижным детектором облегчит измерение
Детектор измерителя оптической мощности	Newport	818-UV	Подключается к измерителю мощности (вверху) - УФ-детектор строго не нужен, так как синий свет находится в пределах видимого диапазона
Регулируемый нейтральный фильтр	K& F Концепция	SKU0689	Регулируемый (вращением) фильтр нейтральной плотности - размещение над апертурой проектора
Презентационно-проекторное программное обеспечение	Microsoft	Powerpoint	Достаточно любого программного обеспечения, позволяющего рисовать/презентацию,
САПР	Autodesk	AutoCAD	Используется для разработки фотошаблонов, многие сервисы печати масок совместимы с файлами AutoCAD
Пленочный фотошаблон	Fineline Imaging	n/a	Существует множество сервисов принтера фотошаблонов для печати фотошаблонов на пленке с высоким разрешением (>30000DPI)