Методическая статья

Измерение энергии метаболизма в описаны ткани сетчатки, с помощью анализа внеклеточного Flux

DOI:

10.3791/58626

⸱

7 января 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Metabolism, Endocrinology and Lipid Research, Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in Saint Louis, 3Department of Ophthalmology and Visual Science, Washington University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод описывает записи в реальном времени потребления кислорода и внеклеточной подкисления ставок описаны мыши сетчатки тканей с использованием анализатора внеклеточного потока.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокая острота зрения представляет собой процесс сильно потребления энергии, и сетчатки разработал несколько уникальных адаптации точно выполнять такие требования при сохранении прозрачности зрительной оси. Возмущений в этот деликатный баланс вызывают ослепительный болезней, таких как диабетическая ретинопатия. Таким образом понимание энергии метаболизма изменения в сетчатке во время болезни необходимо для разработки рациональной терапии для различных причин утраты vison. Недавнее появление коммерчески доступных внеклеточного потока анализаторы сделал исследование сетчатки энергии метаболизма более доступными. Этот протокол описывает использование такого анализатора измерить вклад сетчатки энергоснабжение через два принципа оружие - окислительного фосфорилирования и гликолиза - путем количественной оценки изменений в уровнях потребления кислорода (OCR) и внеклеточной показатели подкисления (ECAR) как прокси для этих путей. Этот метод легко выполняется в описаны ткани сетчатки, облегчения оценки ответов на несколько фармакологических агентов в одном эксперименте. Метаболические подписей в сетчатки от животных, не хватает стержень фоторецепторных сигнализации по сравнению с одичал тип элементов управления, с помощью этого метода. Одним из основных ограничений в этой технике является отсутствие способности различать использования света адаптированных и dark-adapted энергии, важным физиологическим в ткани сетчатки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сетчатка является одним самых требовательных энергии тканей в центральной нервной системе1. Как и большинство тканей он генерирует аденозинтрифосфатом (АТФ) через гликолиз в цитозоль или через окислительного фосфорилирования в митохондриях. Энергичный преимущество Оксидативное фосфорилирование гликолиз производить АТФ из одной молекулы глюкозы ясна: 36 молекулы АТФ генерируется из бывших против 2 молекулы АТФ, созданный из последнего. Соответственно нейроны сетчатки главным образом зависят от митохондриальное дыхание для поставок энергии и это отражено в их высокой плотности митохондрий2. Тем н....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы ассоциации исследований в видении и офтальмологии заявление для использования животных и были одобрены Университет Вашингтона.

1. животных подготовка

  1. Держите животных в стандартный корпус с 12 часов темного света цикл 12 часов. Начало экспериментов на стандартизированных раз чтобы избежать суточного эффекты, обычно утром вскоре после того, как огни включены.

2. решение подготовка

  1. Подготовить базовый СМИ, растворяя 8,4 мг порошка СМИ в дистиллированной двойной H2O (ddH2O) и скорректировать рН 7,4 с HCl или NaOH, окончательный объемом 1 л фильтр стерилизоват....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью описанных методов (кратко на рис. 1), сетчатки эксплантов от 8 недели старый дикого типа (WT) мышах были по сравнению с соответствием возраста и фон transducin null мышей (Gnat1- / -). Потому что Gnat1- / - животные не хватает техники закрыть циклических нуклеотидов закрытого ионных каналов в ответ на раздражители, света, их род фоторецепторов остаются деполяризованный даже в свет14<.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OCR и ECAR легко измеряются в описаны ткани сетчатки, с помощью bioanalyzer, с помощью описанных методов. Этот метод отличается от других групп в нескольких важных шагов. Сетчатки тканей изолированы через большой разрез роговицы без enucleating всему миру, как первоначально описанных Карлом Уинклер15. Этот метод сетчатки изоляции позволяет для быстрой передачи от жизни глаз в пластину захвата ткани (часто в течение 5 минут). Тканей хранятся при 37 ° C на протяжении всего процесса, который сохраняе.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-р Александр Колесников и д-р Владимир Kefalov за предоставление Gnat1- / -мышей, за полезные отзывы и советы и для чтения рукопись.

Эта работа была поддержана, низ EY025269 (ОР), исследовательский центр университета Вашингтона - низ DK020579 диабет (JRM и RR), премии развития карьеры от исследований по предотвращению слепоты (ОР), Фонд Horncrest (ОР), премии развития карьеры с JDRF ( JRM), низ DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) и DK114233 (JRM).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Seahorse XF24 Внеклеточный анализатор потоковAgilent, Санта-Клара, Калифорния
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (в комплекте: микропластина для захвата островков, сенсорный картридж и решение калибра)Agilent, Санта-Клара, Калифорния101174-100Включает микропластину для захвата островков, картридж датчика и калибр RPMI
1640 Носитель (порошкообразная среда)Millipore-SigmaR1383RPMI 1640 Среда с L-Глутамином и без глюкозы или бикарбоната натрия
D-ГлюкозаMillipore-SigmaG82701M D-Глюкоза фильтрованная, для приготовления среды
Пируват натрияCorning25000CI100 мМ пируват натрия
Antimycin-AMillipore-SigmaA8674Компонент протокола митохондриального стресса
FCCPMillipore-SigmaC2920Компонент протокола митохондриального стресса
RotenoneMillipore-SigmaR8875Компонент протокола митохондриального стресса
2-дезоксиглюкозаMillipore-SigmaD6134Компонент протокола гликолиза
1 мм пункции биопсии кожи с помощью поршняIntegra-Miltex33-31AA-P/25Инструмент для эксплантации ткани сетчатки
Dumont Mini-Щипцы StraightFine Science Tools11200-10Инструмент для эксплантации ткани сетчатки
Dumont Medical #5/45 Щипцы - под углом 45 градусовFine Science Tools11253-25Инструмент для эксплантации ткани сетчатки
Dumont #7 Щипцы - изогнутыеFine Science Tools11271-30Инструмент для эксплантации ткани сетчатки
Quant-iT Picogreen dsDNA SanalysisKit Fisher ScientificP7589Анализ
нормализации нагрузкиОснование Тризма (основание Трис)Millipore-SigmaT6066Компонент буфера для лизиса
Triton X-100 (полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир)Millipore-SigmaX100Компонент буфера для лизиса
0,5M EDTA pH 8,0AmbionAM9262Компонент буфера для лизиса
C57BL/6J мышей Лаборатории Джексона  Штамм 000664животных
Gnat1-/- и соответствующий фону Gnat1+/+ Владимир Кефалов, к.м.н.; Школа медициныживотных
Вашингтонского университета

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
  2. Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи