Методическая статья

Измерение энергии метаболизма в описаны ткани сетчатки, с помощью анализа внеклеточного Flux

DOI:

10.3791/58626

⸱

7 января 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Metabolism, Endocrinology and Lipid Research, Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in Saint Louis, 3Department of Ophthalmology and Visual Science, Washington University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод описывает записи в реальном времени потребления кислорода и внеклеточной подкисления ставок описаны мыши сетчатки тканей с использованием анализатора внеклеточного потока.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокая острота зрения представляет собой процесс сильно потребления энергии, и сетчатки разработал несколько уникальных адаптации точно выполнять такие требования при сохранении прозрачности зрительной оси. Возмущений в этот деликатный баланс вызывают ослепительный болезней, таких как диабетическая ретинопатия. Таким образом понимание энергии метаболизма изменения в сетчатке во время болезни необходимо для разработки рациональной терапии для различных причин утраты vison. Недавнее появление коммерчески доступных внеклеточного потока анализаторы сделал исследование сетчатки энергии метаболизма более доступными. Этот протокол описывает использование такого анализатора измерить вклад сетчатки энергоснабжение через два принципа оружие - окислительного фосфорилирования и гликолиза - путем количественной оценки изменений в уровнях потребления кислорода (OCR) и внеклеточной показатели подкисления (ECAR) как прокси для этих путей. Этот метод легко выполняется в описаны ткани сетчатки, облегчения оценки ответов на несколько фармакологических агентов в одном эксперименте. Метаболические подписей в сетчатки от животных, не хватает стержень фоторецепторных сигнализации по сравнению с одичал тип элементов управления, с помощью этого метода. Одним из основных ограничений в этой технике является отсутствие способности различать использования света адаптированных и dark-adapted энергии, важным физиологическим в ткани сетчатки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сетчатка является одним самых требовательных энергии тканей в центральной нервной системе1. Как и большинство тканей он генерирует аденозинтрифосфатом (АТФ) через гликолиз в цитозоль или через окислительного фосфорилирования в митохондриях. Энергичный преимущество Оксидативное фосфорилирование гликолиз производить АТФ из одной молекулы глюкозы ясна: 36 молекулы АТФ генерируется из бывших против 2 молекулы АТФ, созданный из последнего. Соответственно нейроны сетчатки главным образом зависят от митохондриальное дыхание для поставок энергии и это отражено в их высокой плотности митохондрий2. Тем не менее сетчатки также полагается на гликолитических машин даже тогда, когда кислород обильные. Этот процесс аэробного гликолиза первоначально был описан в раковых клетках Отто Варбург3, который однажды отметил, что только после митотическая ткани, способную метаболизма4сетчатки. После этих первоначальных наблюдениях участвовать в той или иной степени гликолиза в дополнение к окислительное фосфорилирование к их требованиям СПС были описаны многие пост митотическая тканей.

Phototransduction, визуальные пигмент рециркуляции, биосинтез наружной сегментов фоторецепторных и синаптической активности являются все энергии требовательных процессов в фоторецепторных клеток, преобладающим нейрональных подкласс в сетчатке. Но на сегодняшний день наиболее энергетически длительный процесс в нейроны1является необходимость активно транспорт ионов против их электрические и градиенты концентрации. Фоторецепторы являются своеобразным нейронов в том смысле, что они являются деполяризованный в отсутствие стимуляции (т.е., в темноте), тогда как легкие стимул вызывает закрытие канала и последующих гиперполяризации. Таким образом в темноте, сетчатки потребляет большое количество АТФ для поддержания ее деполяризации или «Темновой ток», как это обычно называют. С точки зрения адаптации одной из основных проблем в обеспечении этих огромное количество АТФ является необходимость организмов поддерживать четкость через оптической оси. Перевернутый сетчатки архитектура, видели в современном существ является доминирующим решение, как он держит плотной капиллярной сети, поставку фоторецепторы от пути света. Но это чудо природных биоинженерии сетчатки на краю пропасти с точки зрения метаболических резерва. Даже небольшие оскорбления к сетчатке потенциально может нарушить хрупкий баланс поставок энергии для спроса, и визуальный дисфункции или откровенный слепота может наступить быстро.

Учитывая уникальный энергичный требования нейронных сетчатки, в сочетании с ее жесткие ограничения кровоснабжения, точное измерение потребления АТП в сетчатке и его изменения во время болезни может иметь серьезные последствия в понимании и лечении ослепительный условия, такие как пигментный ретинит и диабетической ретинопатии. Традиционно эти измерения требуют дорогостоящей, специально оборудования с большинства исследований, выходящих из несколько лабораторий, полностью посвященный измерений метаболической активности2,5,6, 7,8. Методы включают в себя отдельные анализы для конкретных метаболитов, трассирующими исследования с использованием радио меченых прекурсоров, потребление кислорода, запись с помощью электродов Кларк и Метаболомные профилирования9.

С достижениями в технологии высокой пропускной способности и повышение доступности коммерческих устройств методы для записи обмена веществ сетчатки являются более доступными и дешевыми. Метод, описанный здесь меры как окислительного фосфорилирования и гликолиза в сетчатке с помощью описаны ткани и коммерчески доступные внеклеточного потока анализатор9,10,11,12. Этот анализатор отдельно записи скорости потребления кислорода (OCR) и уровень внеклеточного подкисления (ECAR), выступающей в качестве косвенных показателей окислительного фосфорилирования и гликолиз, соответственно13. Эти измерения выполняются зонд submersed в пределах microchamber, поверх ткани интерес. Эта адаптация ранее опубликованных методов использует захвата плита, первоначально разработанный для островков Лангерганса поджелудочной железы для записи метаболической активности в небольших, циркуляр разделы мыши сетчатки. Несколько фармакологического воздействия может быть доставлен ткани в течение одной записи, потому что система содержит 4 инъекции портов для каждого образца хорошо. С помощью этой системы с отдельными протоколами, оптимизированный для записи ECAR и OCR, ответы сетчатки одичал типа можно сравнить с сетчатки не хватает transducin (Gnat1- / -), причиной врожденной стационарных ночной слепоты в люди14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы ассоциации исследований в видении и офтальмологии заявление для использования животных и были одобрены Университет Вашингтона.

1. животных подготовка

  1. Держите животных в стандартный корпус с 12 часов темного света цикл 12 часов. Начало экспериментов на стандартизированных раз чтобы избежать суточного эффекты, обычно утром вскоре после того, как огни включены.

2. решение подготовка

  1. Подготовить базовый СМИ, растворяя 8,4 мг порошка СМИ в дистиллированной двойной H2O (ddH2O) и скорректировать рН 7,4 с HCl или NaOH, окончательный объемом 1 л фильтр стерилизовать это решение с 0,22 мкм фильтром культуры ткани.
    1. Добавьте 1 M глюкозы и пируват натрия 100 мм для средств массовой информации для достижения окончательного концентрации глюкозы 5 мм и 1 мм пируват.
    2. Место 50 мл Алиготе базы СМИ в ванну воды 37 ° C.
  2. Подготовиться количественный ткани в конце анализа потока, лизис решение, добавляя tris база 10 мм, полиэтиленгликоль трет octylphenyl эфира до 0,2% (v/v) и ЭДТА до 1 мм, все в ddH2O. смесь до тех пор, пока все компоненты полностью распущены и настроить pH 8.0.
  3. Для митохондриального стресс протокола Подготовьте 11 мкм запас oligomycin, АТФ-синтазы ингибитор, растворяют в базовых СМИ целевой конечной концентрации 1 мкм в колодец. Подготовка 11 мкм запас карбонильных цианид - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), агент расцеплять, растворенного в базы СМИ целевой конечной концентрации 1 мкм в колодец. Приготовить коктейль ингибиторы цепи переноса электронов, ротенон и antimycin (САР), добавив ротенон 11 мкм и antimycin A до 22 мкм, растворяют в базовых СМИ целевой конечной концентрации 1 мкм ротенон и 2 мкм antimycin A в хорошо.
  4. Для протокола гликолиза Подготовьте 220 мм запас глюкозы растворяют в базовых средств массовой информации, целевой конечной концентрации 20 мм в колодец. Также Подготовьте запас 1.1 M 2-deoxyglucose (2-ГД), конкурентный ингибитор глюкозы и гликолитических антагонист, растворяют в базовых средств массовой информации. Это будет целевой конечной концентрации 100 мм 2-DG в колодец.

3. инструмент калибровки

  1. Для калибровки приборов для assay внеклеточного потока, добавить 1 мл раствора калибровки в каждой скважине датчик картриджа (всего 24 скважин) и инкубировать при 37 ° C, CO2-бесплатная ночевка инкубатора (или по крайней мере 8 h).
  2. Загрузить добавки для митохондриальных стресс протокол или протокол гликолиза в каждый порт инжектор, A-D, на датчик картриджа, регулируя объем изменений в колодец.
    Примечание: Например типичный пробирного будет включать 45 мкл добавка в первый порт инжектор, 49,5 мкл в второй, 54,5 мкл в третьей и 60 мкл в последний, если первоначальный хорошо объем 450 мкл.
  3. В течение первых нескольких экспериментов Загрузите базы СМИ в порт A оценить, сколько ткани движения/артефакт происходит после инъекции порт.
  4. Разрешить пластину загруженного датчик для инкубации при 37 ° C в не CO2 инкубатора для по крайней мере 60 мин.

4. изоляция свежие мыши ткани сетчатки

Примечание: Этот шаг приспособлен от методики доктора Барри Уинклер15.

  1. После управляющей глубокого наркоза с использованием стандартного коктейль, Ксилазина кетамин усыпить мышей от шейки матки дислокации.
  2. Использование пара средних Изогнутый пинцет понять задняя глобус на зрительный нерв и осторожно применять прямого давления на proptose глаз (рис. 1A).
    1. С чистым лезвием создайте разрез в лимба лимба роговицы с помощью единого, преднамеренное перевал лезвия.
    2. С помощью тонкой, угловой Макферсон стиль щипцы, щепотка задняя глобус выразить объектива и передней Гиалоидная мембраны из роговицы разрез. Отказаться от этих тканей.
    3. Повторите щипать маневр с щипцами выразить нейронных сетчатки.
    4. С помощью щипцов как ложки поднять сетчатки, вместо того, чтобы понять ткани, передача сетчатки от разреза роговицы и место непосредственно в теплой СМИ в 3 см блюдо или тарелку кластера 6-ну тканевые культуры.
  3. Используйте две пары щипцов Макферсон стиль штраф, угловая аккуратно вскрыть оставшиеся стекловидного тела от сетчатки. Лучше всего это делается путем цепляния стекловидного тела на периферии сетчатки Кубка и потянув в сторону центра, с окончательной disinsertion стекловидного тела из центра в целом. С помощью щипцов, удалите любые остаточные пигментный эпителий сетчатки от поверхности фоторецептора сетчатки.
    1. Отрежьте кончик накапайте P1000 с лезвием бритвы, чтобы открыть ~ 4 мм для предотвращения чрезмерного травмы для деликатных тканей сетчатки во время передачи учений.
    2. Перенос изолированных ткани сетчатки в свежие носителя с помощью кончика пипетки отрезока P1000.
    3. Вырежьте 1 мм пробойники сетчатки вокруг зрительного нерва с биопсией 1 мм удар, оборудованных с плунжером выбить ткани в случае, если он застревает в отверстие (рис. 1B). Установите сетчатки пуансонов сторону в чистых сред на блоке 37 ° C или грелку.

5. Протокол assay

  1. Передача отдельных ударов Гонав захват 24-ну островок, используя кончик отрезока P1000, аспирационных 450 мкл СМИ наряду с ткани.
  2. Нормально, используйте прямые щипцами осторожно управлять ударов в центр микроплиты. Держите удары, ориентированы в одном направлении (например, стороны ячейки ганглия вверх).
    1. Отдых захвата плиты на грелку или нагрева блока набор до 37 ° C, как эти шаги повторяются для оставшихся образцов.
      Примечание: Для каждого эксперимента отложите пустой 3-4 скважин с 450 мкл базовых средств массовой информации в качестве негативных элементов. В оставшиеся 20-21 скважин, проверить каждый Биопрепарат реплицировать в трех экземплярах. Таким образом каждая пластина 24-ну позволит для записи с 6-7 разных животных или условий лечения.
  3. Избегая пузырьки воздуха, нежно позиции островок захвата сетки вставок в каждый хорошо с помощью щипцов и зафиксируйте вставки с металлический Плунжер, или вырезать наконечник пипетки P1000 (рис. 1 C).
    Примечание: Избегайте излишней ткани движения во время этого шага для поддержания позиции сетчатки удар в центре образца microchamber. Пузырьки воздуха сильно исказить OCR чтений. Хотя microchamber не имеет адекватной глубины для размещения обычно мышь сетчатки (рис. 1 c), иногда обработки дефекты в сетку вставками может вызвать ткани становятся слишком сжаты во время вставки экрана. Если это произойдет, просто запишите измельченные ткани и исключить этот образец из окончательного анализа.
  4. Инкубировать ткани пластины в 37 ° C CO2-бесплатные инкубатор для по крайней мере 60 мин.
  5. Программа анализатор внеклеточного потока с использованием смеси, подождите, мера и повторять команды. Например, типичный эксперимент с ткани сетчатки могут включать в себя следующее: смешать 2 минуты, подождите 2 минуты, и измерить 5 минут. Повторить эксперимент с этих трех шагов между 5 - 8 раз (циклов) для базовой записи и после инъекции каждого комплекса проходит проверку во время выполнения.
  6. Нажмите кнопку Пуск программы на анализаторе внеклеточного потока и следуйте инструкциям на экране, чтобы вставить картридж датчик для калибровки.
  7. В конце калибровки следуйте инструкциям на экране, чтобы заменить пластину calibrant пластину, содержащие образцы сетчатки.
  8. Разрешите запуск программы, как запланировано. По завершении выполнения следуйте инструкциям на экране, чтобы извлечь пластину ткани. Просмотрите результаты выполнения и хранить файл данных.
  9. Изогнутой иглой 20 калибра и щипцы удалите все сетки вставки из скважин, оставив позади сетчатки удар.
  10. Тщательно аспирационная СМИ из ткани и стирать ткани дважды с 0,5 мл холодного фосфат амортизированное saline (PBS). Аспирационная PBS после стирки.
  11. Добавьте 100 мкл буфера lysis каждой скважины и пипетки вверх и вниз для гомогенизации ткани.
  12. Quantitate входные уровни, основанные на общей двуцепочечной ДНК (dsDNA) или содержание общего белка.
    Примечание: Следующие основан на коммерчески доступных dsDNA assay.
  13. Разбавить лизированных образцы 1:1, добавив 100 мкл буфера Tris-ЭДТА (TE) и передачи 100 мкл разбавленного образца 96 пластины хорошо.
    1. Добавьте 100 мкл буфера обнаружения в каждой скважине. После перемешивания в течение 2-5 минут, quantitate флуоресценции после возбуждения на 480 Нм и выбросов на 520 Нм, сравнивая с калибровочной кривой.
    2. Нормализовать сырье внеклеточного потока трассировки для содержания ДНК в колодец.
      Примечание: В результаты, представленные здесь образцы, нормализуется до 50 нг dsDNA - типичный сумма в 1 мм сетчатки удар. Поэтому абсолютные значения, представленные здесь можно сравнить с исследований, представления данных «за сетчатки удар». Нормализовать Прориси внутреннего стандарта, как базовый при концентрации глюкозы 5 мм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью описанных методов (кратко на рис. 1), сетчатки эксплантов от 8 недели старый дикого типа (WT) мышах были по сравнению с соответствием возраста и фон transducin null мышей (Gnat1- / -). Потому что Gnat1- / - животные не хватает техники закрыть циклических нуклеотидов закрытого ионных каналов в ответ на раздражители, света, их род фоторецепторов остаются деполяризованный даже в свет14<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OCR и ECAR легко измеряются в описаны ткани сетчатки, с помощью bioanalyzer, с помощью описанных методов. Этот метод отличается от других групп в нескольких важных шагов. Сетчатки тканей изолированы через большой разрез роговицы без enucleating всему миру, как первоначально описанных Карлом Уинклер15. Этот метод сетчатки изоляции позволяет для быстрой передачи от жизни глаз в пластину захвата ткани (часто в течение 5 минут). Тканей хранятся при 37 ° C на протяжении всего процесса, который сохраняе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-р Александр Колесников и д-р Владимир Kefalov за предоставление Gnat1- / -мышей, за полезные отзывы и советы и для чтения рукопись.

Эта работа была поддержана, низ EY025269 (ОР), исследовательский центр университета Вашингтона - низ DK020579 диабет (JRM и RR), премии развития карьеры от исследований по предотвращению слепоты (ОР), Фонд Horncrest (ОР), премии развития карьеры с JDRF ( JRM), низ DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) и DK114233 (JRM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Seahorse XF24 Внеклеточный анализатор потоковAgilent, Санта-Клара, Калифорния
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (в комплекте: микропластина для захвата островков, сенсорный картридж и решение калибра)Agilent, Санта-Клара, Калифорния101174-100Включает микропластину для захвата островков, картридж датчика и калибр RPMI
1640 Носитель (порошкообразная среда)Millipore-SigmaR1383RPMI 1640 Среда с L-Глутамином и без глюкозы или бикарбоната натрия
D-ГлюкозаMillipore-SigmaG82701M D-Глюкоза фильтрованная, для приготовления среды
Пируват натрияCorning25000CI100 мМ пируват натрия
Antimycin-AMillipore-SigmaA8674Компонент протокола митохондриального стресса
FCCPMillipore-SigmaC2920Компонент протокола митохондриального стресса
RotenoneMillipore-SigmaR8875Компонент протокола митохондриального стресса
2-дезоксиглюкозаMillipore-SigmaD6134Компонент протокола гликолиза
1 мм пункции биопсии кожи с помощью поршняIntegra-Miltex33-31AA-P/25Инструмент для эксплантации ткани сетчатки
Dumont Mini-Щипцы StraightFine Science Tools11200-10Инструмент для эксплантации ткани сетчатки
Dumont Medical #5/45 Щипцы - под углом 45 градусовFine Science Tools11253-25Инструмент для эксплантации ткани сетчатки
Dumont #7 Щипцы - изогнутыеFine Science Tools11271-30Инструмент для эксплантации ткани сетчатки
Quant-iT Picogreen dsDNA SanalysisKit Fisher ScientificP7589Анализ
нормализации нагрузкиОснование Тризма (основание Трис)Millipore-SigmaT6066Компонент буфера для лизиса
Triton X-100 (полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир)Millipore-SigmaX100Компонент буфера для лизиса
0,5M EDTA pH 8,0AmbionAM9262Компонент буфера для лизиса
C57BL/6J мышей Лаборатории Джексона  Штамм 000664животных
Gnat1-/- и соответствующий фону Gnat1+/+ Владимир Кефалов, к.м.н.; Школа медициныживотных
Вашингтонского университета

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
  2. Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
  3. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  4. Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863(2017).
  5. Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
  6. Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622(2017).
  7. Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
  8. Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
  9. Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
  10. Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
  11. Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
  12. Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113(2017).
  13. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
  14. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  15. Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
  16. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  17. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
  18. Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи