Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обогащать и расширять редких антиген специфические Т-клеток с магнитных наночастиц

10.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58640

⸱

17 ноября 2018 г.

 , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

Антиген специфические Т-клеток трудно характеризовать или использовать в терапии из-за их крайне низкой частоты. Здесь, мы предоставляем протокол к разработке магнитных частиц, который можно привязать к антиген специфические клетки T обогатить эти клетки и затем, чтобы расширить их несколько стократное характеристика и терапии.

Аннотация

Мы разработали инструмент как обогатить и расширять антиген специфические Т-клеток. Это может быть полезно в тех случаях, таких, как A) обнаружить существование антиген специфические Т-клеток, B) зонд динамику антиген специфические реакции, C) понять как антиген специфические реакции влияют на болезненное состояние таких аутоиммунных заболеваний, D) демистификации гетерогенных Ответы на антиген специфические Т-клеток, или E) используют антиген специфические клетки для терапии. Инструмент основан на магнитных частиц, что мы конъюгат антиген специфические и Т-клеток co-stimulatory сигналов, и что мы термин как искусственные антиген представляющих клеток (aAPCs). Следовательно поскольку технология просто производить, он может легко быть принят другими лабораториями; Таким образом наша цель здесь заключается в том, подробно описать изготовления и последующего использования aAPCs. Мы объясняем, как прикрепить сигналы антиген специфические и co-stimulatory к aAPCs, как использовать их для обогащения для антиген специфические Т-клеток и как расширить антиген специфические Т-клеток. Кроме того мы будем освещать проектирование соображения на основе экспериментальных и биологической информации нашего опыта с характеризующие антиген специфические Т-клеток.

Введение

С ростом многих immunotherapies необходимо уметь характеризовать и контроль иммунного ответа. В частности адаптивного иммунного ответа представляет интерес ввиду специфики и долговечность клеток. Недавно были утверждены химерных антиген рецепторов Т-клеточной терапии для лечения рака; Однако антиген рецепторы основаны покинуть общей ячейки поверхностного антигена CD19, вместо антигены, специфичные для рака1. За пределами специфичность immunotherapies могут также страдать от отсутствия контроля и ограниченное понимание динамических иммунный ответ в течение рака или аутоиммунных заболеваний.

Одна из задач изучения реакции антиген специфические является их крайне низкой частоты, например., антиген специфические Т-клетки являются 1 каждые 104 106 T клетки2,3. Таким образом расследовать какие T клетки присутствуют или отвечая, клетки необходимо либо обогащенный и расширена, или их сигнал должны быть усилены. Это дорого и сложно поддерживать с помощью текущих методов, направленных на расширение антиген специфические клетки клетки фидера. Существующие методы, которые сосредоточены на усиления сигнала антиген специфические T-клеток, как assay энзим соединенный immunospot (ELISPOT), ограничивать повторное использование этих клеток T4. Наконец из-за низкой чувствительностью, часто эти две техники нужно быть объединены для перечисления антиген специфические.

Для решения этих вопросов, мы разработали магнитных наночастиц на основе искусственного антиген представляющие клеток (aAPC)5,6,7,8. AAPC можно функционализированных с комплекс антиген специфические сигнал пептид загружен гистосовместимости (реализует) - и co-stimulatory молекул -например., антитела анти CD28-как обогатить антиген специфические Т-клеток и затем впоследствии стимулировать их расширение (рис. 1). Таким образом, частицы может быть экономически готовый продукт, который может быть как настроены для удовлетворения антиген специфические стимуляцию еще стандартизирована в эксперименты и пациентов. Выполнение на обогащение и расширение процесса результаты в сотни и тысячи раз расширение антиген специфические CD8 + Т-клеток и может привести к частоты до 60 процентов после всего за одну неделю, позволяя характеристика или терапевтического использования больших количество ячеек. Здесь мы опишем как сделать наночастиц aAPCs, некоторые критические дизайн соображения при выборе свойства наночастиц и продемонстрировать некоторые типичные результаты от использования этих частиц в изоляции и расширении редких антиген специфические CD8 + Т-клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все мыши были сохранены за руководящими принципами, утвержденными институциональных Наблюдательный Совет университета Джонса Хопкинса.

1. загрузить протеин сплавливания иммуноглобулина димерной майор комплекс гистосовместимости (MHC-Ig) с желаемой антигена пептид последовательности.

Примечание: При использовании H - 2 КБ: Ig, а затем следовать протоколу подробно шаг 1.1; При использовании H-2Db:Ig, а затем следовать протоколу, подробно описанные в шаге 1.2.

  1. Активные загрузки пептидной последовательности в H - 2 КБ: иг.
    1. Готовить необходимые буферы. Подготовьте денатурации буфера, делая решение 150 мм NaCl и 15 мм Na2CO3 в деионизированной воде и затем настраивая рН 11,5. Подготовьте буфере выемка, сделав решение 250 мм трис-HCl в дейонизированной воде и корректировка pH 6.8.
      Примечание: Как правило, это потребует около 5 мл денатурации и выемка буферов для 1 мг H - 2 КБ: иг.
    2. Денатурируйте H - 2 КБ: Ig разрешить расширение пептид привязки. Принесите H - 2 КБ: концентрация Ig между 0,5-2 мг/мл с фосфат амортизированное saline (PBS). Затем разбавить H - 2 КБ: Ig до конечной концентрации 100-200 мкг/мл с 5-10 объем эквиваленты денатурации буфера и позволить для инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
    3. Добавьте 50 Молярная избыток пептида последовательности (обычно запасов пептид хранится в 1 мм при температуре-80 ° C) до H - 2 КБ: раствор Ig.
      Примечание: Обычно пептидные антигены нужно будет расформирован в течение по крайней мере 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и затем добавляется медленно PBS оставаться растворимые. В зависимости от аминокислотной последовательности количество ДМСО может потребоваться увеличить.
    4. RENATURE H - 2 КБ: иг с пептида. Сразу же после добавления пептида, принести решение рН 7,4, добавив выемка буфера. Разрешить нейтрализованы решение инкубировать в течение 48 часов при 4 ° C.
    5. Концентрат и мыть загрузки пептидной H - 2 КБ: Ig. Использование центробежных концентратор с 50 kDa свертывании молекулярной массой (MWCO), следуйте инструкциям производителя, чтобы мыть загрузки пептидной H - 2 КБ: раствор Ig 3 раза с PBS, концентрат для по крайней мере 1 мг/мл и количественно определить концентрацию на спектрофотометре.
  2. Активные загрузки пептидной последовательности в H-2Db:Ig.
    1. Готовить необходимые буферы. Подготовьте денатурации буфера, делая раствором лимонной кислоты 131 мм, 150 мм NaCl и 124 мм Na2HPO4 в деионизированной воде и затем настраивая рН 6,5. Подготовьте буфере выемка, сделав решение 120 мм трис-HCl в деионизированной воде и корректировка pH 8.8.
      Примечание: Как правило, это потребует около 5 мл буфера, денатурации и 1 мл буфера выемка для 1 мг H-2Db:Ig.
    2. Денатурируйте H-2Db:Ig, чтобы разрешить расширение пептид привязки. Принесите H-2Db:Ig концентрации до конечной концентрации 0,5-2 мг/мл с PBS. Затем разбавить H-2Db:Ig до конечной концентрации 100-200 мкг/мл 5-10 объем эквиваленты денатурации буфера.
    3. Добавьте 50 Молярная избыток пептида последовательности (обычно запасов пептид хранится в 1 мм при температуре-80 ° C) до H-2Db:Ig решения и позволяют инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
    4. Добавить β2-МИКРОГЛОБУЛИНА и renature H-2Db:Ig с пептида. Добавьте 2 раза Молярная избыток β2-микроглобулин. Затем принести решение рН 7,4, добавив выемка буфера. Разрешить нейтрализованы решение инкубировать в течение 24 ч при 4 ° C.
    5. Концентрат и мыть загрузки пептидной H-2Db:Ig. использованием центробежных концентратор с 50 kDa MWCO, следуйте инструкциям производителя, чтобы мыть загрузки пептидной H - 2 КБ: раствор Ig 3 раза с PBS, сосредоточиться на по крайней мере 1 мг/мл и количественно концентрация на спектрофотометре.

2. сопряженные MHC-пептидных комплексов и Co-Stimulatory молекул на поверхности магнитных наночастиц для формирования наночастиц искусственного антиген представляющих клеток. Используйте один из трех различных методов в зависимости от размера частиц и приложений.

Примечание: Ряд различных методов может использоваться для конъюгата белков на поверхности частиц. Здесь описаны 3 отдельные подходы: Амин покрытием частиц (шаг 2.1), N-оксисукцинимидного (NHS)-покрытием частиц (шаг 2.2) и покрытием biotin частиц (шаг 2.3). Эти процессы также были подробно описаны в разделе методы двух документов опубликованных6,7. Выполните все шаги в биобезопасности Зонта с стерильных растворов для поддержания стерильности запасов aAPC частиц.

  1. Герб антиген специфические и стимулирующее сигналов на магнитные частицы, Амин покрытием (рис. 2). Этот процесс описан для 100 Нм, Амин покрытием суперпарамагнетическим наночастиц.
    Примечание: Подробные протоколы для крепления антитела к поверхности с покрытием частицы Амин можно найти на https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, где Technote 201 описывает, как для thiolate антител и сопряженное с maleimide functionalize частицы и 202 описывают процесс, необходимо functionalize Амин покрытием частиц с maleimide функциональных групп. Здесь MHC-Ig и co-stimulatory сигналов, придает эти частицы выделяются лишь незначительные изменения.
    1. Thiolate антитела с Траут реагент (Technote 201).
      1. Подготовка 10 x PBS-Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) буфера (0,1 М PBS и 100 мм ЭДТА). Добавить 10 x буфер PBS-ЭДТА антител 1:10 соотношение для предотвращения окисления бесплатно тиолами, добавлены к антителам.
      2. Добавить 20 Молярная избыток Траут реагента (2-iminothiolane) антитела и проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре с смешивания. Отмерьте Траут реагента (сухой порошок) в рамках химического Зонта чтобы избежать дыхания, как он преобразует аминов группы тиоловых групп.
      3. Тщательно промойте 1 x PBS-ЭДТА буфер 3 раза с помощью центробежных концентратор с 50 kDa MWCO и следовать инструкциям производителя, концентрации до тех пор, пока конечный объем 500 мкл. измерения концентрации антител решения с использованием Спектрофотометр.
    2. Преобразовать Амин функциональных групп на магнитных наночастиц maleimide групп с использованием sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) циклогексан-1-карбоксилатных (сульфогруппу-ККАП, Technote 202).
      1. Добавить 10 x буфер PBS-ЭДТА антител 1:10 соотношение частиц.
      2. Растворите сульфогруппу-ККАП в деионизированной воде и вихревые для Ресуспензируйте в концентрации 1 мг/мл. Отмерьте сульфогруппу-ККАП (сухой порошок) в рамках химического Зонта чтобы избежать дыхания, как он преобразует аминов группы maleimide групп.
      3. Добавление 0,016 нмоль сульфогруппу-ККАП решения для каждый квадратный миллиметр площадь поверхности частиц. Для 1 мг 100 Нм частиц используйте 0,3 мг сульфогруппу-ККАП. Позволяет реагировать на 1,5 ч при комнатной температуре.
      4. Вымойте частиц с 1 x PBS-ЭДТА буфер 3 раза с помощью магнитное поле с магнитной колонкой и Ресуспензируйте в 500 мкл 1 x PBS-ЭДТА буфера.
        Примечание: Если использование частиц меньше, чем 200 Нм, такие как 100 Нм частицами описанные здесь, скорее всего постоянные магниты не будет достаточно мощными, чтобы тянуть частиц для стирки или концентрации целей. Таким образом мыть мелкие частицы, используйте магнитные столбец, состоящий из ферромагнитных сфер для того чтобы усилить магнитного поля.
    3. РЕАКТ maleimide функционализированных частицы с thiolated антител (Technote 201).
      1. Добавить частицы стекла флакона сцинтилляционные, добавить мини магнитные перемешать бар, место просто дюйма выше Плиты магнитные перемешать и побудить магнитные Смешивание раствора частиц.
      2. Для перемешивания раствора добавьте thiolated антител (0,5 мг антитела для каждого 1 мг частиц) каплям. Позволяет реагировать на ночь при комнатной температуре.
      3. Вымойте с буфером PBS 1 x 3 раза с помощью магнитного поля и Ресуспензируйте в 500 мкл ПБС. Этикетки и хранить при 4 ° C на срок до 6 месяцев.
        Примечание: Максимальная эффективность спряжение происходит, когда maleimide функционализированных частицы немедленно смешиваются с thiolated белками.
  2. Герб антиген специфические и стимулирующее сигналы для ГСЗ покрытием магнитных частиц (рис. 3). Этот процесс описан для 200 Нм, NHS-покрытием суперпарамагнетическим наночастиц.
    1. Подготовьте ресуспендирования буфер, Закалочные буфер и буфер хранения. Ресуспендирования буфера составляет 25 мм 2-(N-Морфолино) ethanesulfonic кислота (MES) с 0,01% 20 анимации скорректирована до pH 6.0. Закалочные буфер — 100 мм растворе трис-HCl при рН 7,4. Буфер для хранения представляет собой решение 10 мм PBS и 0,01% анимации на рН 7,4.
    2. Ресуспензируйте лиофилизированные частиц в 1 мл буфера ресуспендирования. Вихрь энергично для по крайней мере 15 минут до тех пор, пока не агрегатов видны.
    3. Место магнитные частицы на магнитного стенд, чтобы удалить супернатант Ресуспензируйте с 0,5 мл ресуспендирования буфера и передачи флакон сцинтилляционные стекла. Вихрь, до тех пор, пока не агрегатов видны.
    4. Добавьте 0,1 мг общего белка на 1 мг ресуспензированы частиц. Вихрь смешать и реагировать при комнатной температуре в течение 2,5 ч во время смешивания.
    5. Добавить 0,1 мл тушения буфера и реагировать при комнатной температуре в течение 30 мин, помешивая.
    6. Место сцинтилляционные флакона на магнитную подставку и мыть частицы. Подождите, пока ясно, чтобы удалить супернатант. Удаление частиц из магнитного стенд, добавьте 1 mL ресуспендирования буфера и вихревой до тех пор, пока не агрегатов видны. Повторите этот процесс в три раза и Ресуспензируйте частицы в 1 мл буфера ресуспендирования. Храните частиц на 4 ° C на срок до 6 месяцев.
  3. Герб антиген специфические и стимулирующее сигналов на магнитные частицы, biotin-покрытием (рис. 4). Этот процесс описан на 50-100 Нм, анти биотина суперпарамагнетическим наночастиц.
    1. Biotinylate MHC-Ig или co-stimulatory молекул.
      1. Регулировка протеина концентрации 0,5-2 мг/мл в буфере PBS. Ресуспензируйте сульфогруппу ГСЗ биотина в концентрации 10 мг/мл в деионизированной воде и добавить кратной Молярная избыточные для стимулирующей антитела. Инкубации при комнатной температуре 45 мин.
      2. Тщательно промойте PBS 3 раза с помощью центробежных концентратор с 50 kDa MWCO, следуйте инструкциям производителя, концентрации до тех пор, пока конечный объем 500 мкл. измерения концентрации антител решения с помощью спектрофотометра.
    2. Сопряженное биотинилированным MHC-Ig и/или co-stimulatory сигналы анти биотина наночастиц. Для 500 мкл акций против биотина частиц добавить 0,5 нмоль стимулирующее антитела и Инкубируйте на 4 ° C на ночь.
    3. Вымойте конъюгированных aAPC наночастиц. Потому что эти частицы меньше чем 200 Нм, мокрой магнитной столбец и положить на магнитную подставку.
    4. Добавьте в столбец подвеска частиц/белков. Разрешить все белка/частицы полностью войти в столбце.
    5. Вымыть путем добавления столбца 0,5 мл PBS три раза.
    6. Элюировать, удаление столбца из магнитного стенд, добавив 0,5 мл PBS в столбце и с использованием плунжера, исключать aAPCs частиц во флакон сцинтилляционные стекла. Хранить частиц при температуре 4 ° C на срок до 6 месяцев.
      Примечание: Частицы являются стабильными при 4 ° C (не должны быть заморожены) на срок до 6 месяцев. Более высокие температуры снизить функциональность частиц и определенное агрегирование частиц наблюдались (данные не показаны). Не держать при комнатной температуре для длительных периодов времени, поскольку это значительно сокращает срок годности частиц.

3. охарактеризовать содержание белка на искусственных антиген представляющих клеток наночастиц с помощью флуоресцентных антител обнаружения.

Примечание: Это полезным контроля качества производства искусственного антиген представляющих клеток. Кроме того, количество стимулирующее сигнала используется для производства aAPC эквивалентных доз различных пакетов и различные типы aAPC (например., разных размеров).

  1. Измерение концентрации частиц с покрытием aAPCs.
    1. Используйте неконъюгированной частиц от Стоковый раствор и сделать титрования дозы 1:2 в растворе PBS через 96-луночных плоскодонной культуры ткани табличка с 100 мкл в колодец.
    2. Читайте частиц на пластине чтение спектрофотометром в 405 нм для создания стандартной кривой от концентрации известных частиц.
    3. Взять образец конъюгированных aAPCs, разбавленных в PBS в суммарный объем 100 мкл и читать на спектрофотометре.
  2. Удалить образец изготовлены aAPCs и пятна с флуоресцентных антител.
    1. Чтобы рассчитать сколько образец, чтобы удалить, оцените количество антител на поверхности частицы.
      Примечание: Для этих методов, предположим плотность около 1000 антитела/мкм2 площади поверхности частиц. Чтобы иметь возможность обнаружить флюоресценция, она требует около 1011 MHC-Ig или CD28 молекулы всего на флуоресцентные тест.
    2. Довести общий объем aAPCs до 100 мкл в PBS, добавить окрашивание антител в разведении 1: 100 и инкубировать 1 час при 4 ° C.
      Примечание: Пример антитела, которые успешно используются FITC конъюгированных крыса анти мыши Ig λ1, λ2, λ3 легкие цепи, клонировать R26 46 обнаружить что MHC-Ig, FITC конъюгированных мышь анти-Армянский/сирийский хомяк IgG и клонировать G192-1, для обнаружения анти мыши CD28.
  3. Вымойте частицы и читать флуоресцирования на флуоресцентные пластины читателя.
    1. Магнитно мыть (как описано в шаге 2) окрашенных aAPC дроби три раза с 0,5 мл ФСБ.
    2. Элюировать промывают aAPCs с 0,5 мл ФСБ.
    3. 100 мкл eluted aAPCs, 96-луночных плоскодонной пластины для чтения с помощью поглощения как шаг 3.1 концентрации.
    4. Возьмите оставшиеся 400 мкл, разделить на аликвоты два 200 мкл и добавить две скважины в черный, полистирола 96-луночных, плоскодонной плиты. Титруйте в соотношении 1:2 вниз плита, принимая 100 мкл раствора и смешивания с следующей хорошо, что есть 100 мкл PBS в каждом хорошо по крайней мере четыре раза.
      Примечание: Средняя несколько реплицирует измерения, чтобы уменьшить шум в измерении.
    5. На пластину же черный 96-луночных сделайте стандартной кривой флуоресцентные антитела используются для окраски, путем добавления его в 1: 200 в колодец с 200 мкл PBS и титрования вниз в соотношении 1:2 для по крайней мере 12 скважин.
    6. После aAPC и флуоресцентных антител на табличке, прочитайте пластину с читателем флуоресцентные пластины.
  4. Рассчитайте количество белка на частицы. Определить концентрацию антител, сравнивая значения калибровочной кривой, где концентрация антител, как известно, предполагая в соотношении 1:1 Пятнать антитела для обнаружения антител. Затем разделить этот концентрации обнаружены антитела с концентрации частиц, определяется поглощения пробирного даст количество антител на частицы.

4. обогатить антиген специфические CD8 + Т-клеток с готовым наночастиц искусственного антиген представляющих клеток.

  1. Изолируйте CD8 + Т-клеток.
    1. Усыпить животных под воздействием изофлюрановая следуют шейки матки дислокации.
    2. Удаление селезенки и лимфатических узлов от мышей C57BL/6j wildtype и место в растворе PBS. Размачиваем органов и элюировать клетки через стерильную 70 мкм клеток сито с частыми моет PBS.
    3. Для устранения не - CD8 + Т-клеток, использовать комплект изоляции клеток CD8 + T без-touch и следуйте инструкциям производителя.
      Примечание: Каждый антиген условие требует по крайней мере 3 х 106 CD8 + Т-клеток.
  2. Добавьте наночастиц aAPCs для привязки к CD8 + Т-клеток.
    1. После изоляции сосредоточиться на том 100 мкл в PBS с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 2 мм ЭДТА.
    2. Определить число из aAPCs для добавления путем вычисления, основанные на соотношении 1011 aAPC привязкой, пептид загружен MHC-Ig на каждые 106 CD8 + Т-клеток.
    3. Инкубировать aAPC частиц и CD8 + Т-клеток для 1 ч при 4 ° C с непрерывного смешивания в 5 мл стерильной полистирол круглая труба внизу.
  3. Подготовьте дополненный СМИ и фактор роста Т-клеток (TCGF) элюировать и культуры CD8 + Т-клеток.
    1. Дополнено СМИ дополняют полный RPMI 1640 СМИ (с глютамином) 1 x несущественные аминокислот, пируват натрия 1 мм, 0,4 x раствор витамина, 92 2-меркаптоэтанол мкм, 10 мкм ципрофлоксацин и 10% плода бычьим сывороточным (ФБС).
    2. Чтобы сделать TCGF, следуйте протоколы уже созданы и ссылки здесь9.
      Примечание: TCGF является внутренний коктейль человеческой иммунной цитокинов, которая необходима для предоставления Т-клеток с дополнительной стимуляции сигналы, необходимые для роста. TCGF могут быть обменены на известных Т-клеток стимулирующее цитокинов например IL-2, IL-7, или ил-15; Однако каждый может поляризации клеток T ответ соответственно. Протокол, описанные здесь, не был оптимизирован с эти коктейли; Таким образом другие методы должны быть консультации для концентрации и комбинации, если TCGF не используется с примерами перечислены10,11.
  4. Вымойте и обогащают aAPC и CD8 + T ячейку смесь.
    1. Мыть aAPCs магнитных частиц, как описано в шаге 2. Однако, вымыть сначала с помощью буфера PBS с 0,5% BSA и 2 мм ЭДТА, второй использованием дополнить средства массовой информации и с помощью третьего дополнения СМИ с 1% TCGF.
    2. Элюировать aAPCs и обогащенного CD8 + Т-клеток в 500 мкл дополнениями СМИ с 1% TCGF.
    3. Подсчитать ячейки, используя Горяева и пластины в 96 пластине U-дном в 160 мкл на хорошо дополнен СМИ с 1% TCGF в концентрации 2,5 x 105 CD8 + T клеток/мл.
    4. Если изолировать с помощью aAPCs с пептида загружены только MHC-Ig на поверхности (не co-stimulatory сигналы), затем полный шаг 4.5. Если изолировать с помощью aAPCs с обоих загрузки пептидной MHC-Ig на поверхности и co-stimulatory сигналов, затем перейдите к шагу 5.
  5. Магнитные частицы, покрытые co-stimulatory сигналов на поверхности обогащенного фракции и добавить магнитное поле совместно кластера стимулирующее сигналов на поверхности Т-клеток.
    1. Для высокообогащенного фракции, добавьте эквимолярных (или больше в зависимости от приложения смотрите раздел о aAPC свойств для элемента управления) стимулирующее антитела на количество загрузки пептидной MHC-Ig на частицы.
    2. Разрешить co-stimulatory магнитные частицы для привязки к обогащенного CD8 + Т-клеток, за 1 ч при 4 ° C.
    3. Добавьте магнитное поле, поместив пластину культуры между двумя неодимовые магниты диска N52 1,9 см (0,75 дюйма) в длину.
      Примечание: N52 диск магниты имеют чрезвычайно сильное поле. Следует позаботиться как хранить их с прокладками между магнитами, как это трудно удалить друг от друга и когда положить их на культуры пластин. Чтобы свести к минимуму магниты от прилипания к металлических компонентов инкубатора, поместите их в 50 мл Конические трубки пенополистирола контейнеров на нижней и верхней.

5. расширять и обнаруживать антиген специфические CD8 + Т-клеток с готовым наночастиц искусственного антиген представляющих клеток.

  1. Добавьте 96 U-дном хорошо пластину с aAPCs и CD8 + Т-клеток в увлажненные 5% CO2, инкубатора 37 ° C в течение 3 дней. На третий день подача клетки с 80 мкл на хорошо дополнен СМИ с 2% TCGF и место обратно в инкубаторе до 7 день.
  2. На 7 день урожай стимулируется клетки в 5 мл круглая труба внизу для подсчета.
  3. Однажды все решения собирают, спин вниз заготовленных клеток Ресуспензируйте в 0,5 мл PBS с азидом натрия 0.05% и 2% FBS. Количество жизнеспособных клеток окрашивание с Трипановый синий и подсчета на Горяева.
  4. Удаление 50 000-500 000 подсчет клеток в два новых 5 мл вокруг нижней трубы для окрашивания антиген специфические. Одна трубка будет использоваться для родственных пептид MHC пятно, и другой трубки будет использоваться для не Когнаты пятно для определения фона пятнать.
  5. Добавить 1 мкг биотинилированным MHC-Ig (с использованием методики, описанной в шаге 2) в соответствующих узнаваемыми и не Когнаты трубы в 100 мкл PBS с азидом натрия 0.05% и 2% FBS с аллофикоцианин (APC)-конъюгированных крысы мыши и анти CD8a, клонировать 53-6.7 (коэффициент разрежения в 1: 100) за 1 ч при 4 ° C.
  6. Добавление вторичного стрептавидина и жить мертвых пятен. Промойте избыток биотинилированным MHC-Ig с PBS путем центрифугирования. Затем пятно все образцы с соотношением 1: 350 фикоэритрин (PE)-помечены стрептавидина и 1: 1000 в соотношении жить/мертвые поправимо зеленый мертвые клетки пятно для 15 мин при 4 ° C.
  7. Читайте все образцы на проточный цитометр определить специфику и количество антиген специфические клетки.
    1. Промыть превышение средней и жить/мертвые пятна центрифугированием и Ресуспензируйте с 150 мкл буфера PBS с азидом натрия 0.05% и 2% FBS читать на проточный цитометр.
  8. Определите количество и процент антиген специфические клетки с программного обеспечения для анализа данных.
    1. Чтобы определить процент антиген специфические клетки, используйте следующие ворота в соответствующих порядке живой +, + лимфоцитов (вперед разброс по стороне точечная), CD8 + и димеров +. Определите димер + ворота, сравнивая номера Когнаты родственных пятно.
    2. Определите процент антиген специфические клеток в образце путем вычитания процент димер + родственных MHC-Ig пятно от пятно не Когнаты MHC-Ig.
    3. Используя этот процент антиген специфические клетки, умножьте его на количество клеток подсчитано, уступая количество антиген специфические клетки полученный от обогащения и расширения.
      Примечание: Компенсации должны быть созданы на проточный цитометр, поскольку есть спектральных совпадения с флуорофоров, используемые в этой панели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для завершения успешного обогащение и расширение антиген специфические Т-клеток, загрузки пептидной MHC-Ig и co-stimulatory молекулы должны быть успешно подключился к aAPC частиц. Основываясь на 3 методы частиц насадки, мы предоставляем некоторые репрезентативные данные для успешного сопряжения процедура завершения (Рисунок 5a). Действительно, если плотность лигандом является слишком низким, то не будет эффективным стимуляции антиген специфические CD8 + Т-кле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы создали технологии изоляции Роман антиген специфические Т-клеток, на основе наночастиц искусственного антиген представляющих клеток (aAPCs). Наночастицы aAPCs пептид загружены MHC на поверхности, что позволяет привязке антиген специфические Т-клеток и активации вместе с co-stimulatory активации. aAPCs также парамагнитно и таким образом могут использоваться для обогащения редких антиген специфические Т-клеток с помощью магнитного поля. Мы имеем оптимизированы и изучены ключевые наночастиц свойства Размер, плотность лиг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют следующие конкурирующих финансовых interest(s): под лицензионного соглашения между NexImmune и Университетом Джона Хопкинса, Джонатан шнек имеет право на долю роялти, полученные в университете на продажах продуктов, описанных в этом статья. Он также был основателем NexImmune и владеет акций в компании. Он является членом научно-консультативного совета директоров и NexImmune в. С условиями этих соглашений были рассмотрены и одобрены университета Джонса Хопкинса в соответствии со своей политикой конфликта интересов.

Благодарности

J.W.H. Спасибо NIH рака нанотехнологический центр обучения в институте Джонса Хопкинса нанобиотехнологии, национальной науки фонд исследовательских стипендий (DGE-1232825) и Дуг фонд поддержки стипендий. Эта работа финансировалась поддержке национальных институтов здравоохранения (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), ТЕДКО/Мэриленд инновационной инициативы и Фонд Коултер (ОСЗ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DimerX I: Рекомбинантный растворимый димер человека HLA-A2:Ig Fusion proteinBD Biosciences551263
DimerX I: Рекомбинантный растворимый димер мыши H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I: Рекомбинантный растворимый димерный белок мыши H-2K[b]:Ig Fusion proteinBD Biosciences550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000GE Life Sciences28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000GE Life Sciences28932257
очищенный человеческий бета 2 микроглобулинBio-RadPHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 нм наночастицыМикромод 79-01-102
Super Mag NHS активированные шарики, 0,2 &; mОкеан НанотекSN0200 
Антибиотиновые микрошарики UltraPureMiltenyi130-105-637
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217
Sulfo-SMCC Crosslinker ProteoChemc1109-100mg
2-иминотиолана гидрохлоридSigma-AldrichI6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, черный полистиролCorning3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ 1, λ 2, & &лямбда; 3 Световая цепь  Клонирование   R26-46   BD Biosciences553434
FITC Мышиный антиармянский и сирийский хомяк IgG  Клонирование   G192-1BD Biosciences554026
B6. Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (трансгенный PMEL) мышиJackson Laboratory005023
C57BL/6J (B6 wildtype) мышиJackson Laboratory000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, мышьMiltenyi130-104-075
MS ColumnsMiltenyi130-042-201
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
Стрептавидин-Фикоэритрин, SAv-PEBiolegend405203
магниты N52 размером 0,75 дюйма K& J MagneticsDX8C-N52
APC антимышиное антитело CD8a, клон 53-6.7Biolegend100711
LIVE/DEAD Фиксируемый набор для окрашивания зеленых мертвых клеток, для возбуждения 488 нм ТермофишерL-34969

Ссылки

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11(2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149(2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572(2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Искусственные антигенпрезентирующие клеткиМетод обогащения и экспансииАнализ методом проточной цитометрииИзоляция CD8+ T-клетокMHC-Igнагруженный пептидомФактор роста T-клетокБиотинилированный MHC-IgАнтителоконъюгированное со стрептавидином
Обогащать и расширять редких антиген специфические Т-клеток с магнитных наночастиц
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.