Методическая статья

Используя высокое содержание Imaging для количественного определения целевых участия в адэрентных клеток

DOI:

10.3791/58670

⸱

29 ноября 2018 г.

 ,  , 
1Chemical Biology Consortium Sweden, Science for Life Laboratory, Karolinska Institutet, Solna, 2Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet, Solna, 3Science for Life Laboratory, Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet, Stockholm

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измерения поражения цели наркотиков являются центральным элементом разработки эффективных лекарств и химических зонд проверки. Здесь мы подробно протокол для измерения наркотиков целевых участия, используя высокое содержание изображений в Гонав совместимых адаптация сотовых тепловой сдвиг анализа (CETSA).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quantitating взаимодействие малых молекул с их предполагаемой белка цели имеет решающее значение для разработки лекарств, целевые проверки и проверки химических зонд. Методы, позволяющие оценить это явление без изменения целевого белка или малые молекулы особенно ценный, хотя технически сложным. Assay сотовой тепловой сдвига (CETSA) является одним из способов для отслеживания целевых участия в живых клетках. Здесь мы описываем адаптация оригинальной CETSA протокол, который позволяет для высокой пропускной способностью измерений при сохранении субцеллюлярные локализации на уровне отдельной ячейки. Мы считаем, что этот протокол предлагает важные успехи в приложение CETSA для углубленного характеристику соединения целевого взаимодействия, особенно в гетерогенной популяции клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При разработке новых лекарств или химические датчики, важно пару наблюдаемых Фармакологический эффект или функциональной индикации измерений целевой размещение или участия в живых клеток в1,2,3. Эти данные необходимы для обеспечения что малые молекулы фактически достигает желаемой цели и проверки биологических гипотеза позади белка целевого отбора4,5. Кроме того во время разработки лекарств, модель системы возрастающей сложности используются для выбора и подтвердить свинца соединения до клинических испытаний. Чтобы подтвердить перевод биологии через эти доклинические систем, методы для отслеживания наркотиков целевых участия и сопровождающие биологии на протяжении всего этого процесса развития являются критическими.

Наркотики целевых участия традиционно сложной для мониторинга в живых клеток с unfunctionalized малых молекул и белков, особенно на уровне одной ячейки с пространственным разрешением6,7. Один из последних методов наблюдать взаимодействие между неизмененной наркотиков и белков в живых клеток является пробирного сотовой тепловой сдвиг (CETSA), в котором лиганд индуцированной стабилизации родной белка в ответ на вызов тепла является количественных8, 9,10. Это достигается путем количественной оценки оставшихся растворимого белка после воздействия тепла вызов. В первоначальное раскрытие CETSA Западная помарка была использована для обнаружения. Чтобы включить скрининг кампаний и ударил сортировка больших составных коллекций, усилия увеличить пропускную способность CETSA экспериментов привели к разработке нескольких однородных, основанный на Гонав анализов10,11. Однако одно ограничение с помощью этих методов является, что они в настоящее время лучше всего подходят для соединения лечения в клеточных суспензий и обнаружения требует лизис клеток, приводя к потере пространственной информации. CETSA может быть применена экспериментально, либо как лиганд индуцированного сдвига в тепловой агрегат температуры (общT) на одну концентрацию малые молекулы или лигандом концентрации, необходимой для стабилизации белка в одной температуры. Последняя называется изотермический дозы ответ отпечатки пальцев (ITDRF) для обозначения зависимость этих измерений на конкретных экспериментальных условиях.

Цель настоящего Протокола заключается в измерения поражения цели с помощью CETSA в адэрентных клеток immunofluorescent обнаружения антител (если) с высоким содержанием микроскопии12. Эта процедура расширяет оригинальный CETSA платформа для одноклеточных количественного определения целевых участия с сохранением субцеллюлярные локализации. В частности в отличие от многих предыдущих докладах, в этой процедуре составные лечение проводится в живых адэрентных клеток без поверхности отряд или стирки перед проблемой тепла, таким образом, сохраняя равновесие созданной привязки, мы стремимся, чтобы измерить13. В настоящее время метод проверяется на один целевой белок p38α (MAPK14) в несколько ячеек, строк, и мы надеемся, что путем обмена этой процедуры метод может быть применен широко по всей плавильной протеома. Мы ожидаем, что этот протокол может быть адаптирована в конвейере развития наркотиков от скрининга, хит классифицирование посредством мониторинга целевых участия в естественных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Заполнение ячеек

Примечание: Общий обзор рабочего процесса см. Подробный перечень материалов и реагентов доступны в Таблице материалов.

  1. До заполнения ячеек, сверлить отверстия сверлом стандартной в рамках черного 384-ну изображений пробирного плит чтобы избежать воздушных пузырей, защемления под пластину позже во время шага Отопление. Чтобы избежать пластиковые частицы, попадающие скважин во время этого шага и поддерживать стерильные условия, печать пластины с клей фольги или крышка до бурения в культуре ткани капюшоном. Как правило достаточно 3 отверстия с диаметром 3,5 мм на каждой стороне пластины (короткая сторона).
  2. Подготовьте скамейке ламинарного потока очистки с 70% этиловом спирте. Следующие методы стандартных асептических культуры ткани извлеките из клеток колбу или блюдо. Вымыть клетки с 5-10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS), а затем добавить трипсина 2 мл флакон. Инкубируйте настой при 37 ° C, пока клетки A-431. Подсчет ячеек, либо с помощью haemocytometer или мобильный счетчика. Готовят суспензию клеток 50 000 клеток/мл в культурной среде.
  3. Лунки 40 мкл суспензии клеток (давая окончательный клеток плотность 2000 ячеек на хорошо) в каждой скважине пробирного пластины с помощью реагента Дозатор сыпучих или многоканальные пипетки, в зависимости от масштаба эксперимента. Кратко двигаться пластину из стороны в сторону, чтобы разогнать ячейки равномерно в нижней части пластины.
  4. Чтобы свести к минимуму эффекты краев плиты, позволяют клеткам поселиться в нижней части пластины пробирного 20 минут при комнатной температуре в задней части Ламинарный шкаф. Затем место пластину в пластиковый контейнер с влажной салфетки для обеспечения влажной атмосфере. Перед использованием протрите пластмассовый контейнер с 70% этиловом спирте.
  5. Инкубируйте поле с Пробирной плита на 2-3 дней при 37 ° C и 5% CO2 в обычных увлажненные инкубатора. Монитор confluency клеток до 50-75%, по оценке визуального осмотра с световой микроскоп.

2. составные лечение

  1. В день эксперимента аспирационная среднего от каждой хорошо с помощью пластины шайбу. Поместите пластины на пластину шайбу и выберите программу, аспирации. Если плита шайбу не доступен, затем жидкость можно удалить, инвертирование пластину с закруткой быстрого руку над лотка для отработанных чернил или раковину. Полное удаление жидкости имеет важное значение для хорошей производительности. Затем любой избыток жидкости удаляется путем тыча с бумажными полотенцами.
  2. 30 мкл соединений, разбавленный присвоил концентрации в ячейку культуры среднего с использованием автоматизированного дозирования или многоканальные пипетки в зависимости от масштаба эксперимента. Обеспечить добавление нескольких скважин на каждой табличке пробирного отрицательной (ДМСО) и положительный (известный лигандом) элемента управления. Поскольку это термальный переход пробирного, это необходимо, что составные концентрация превышает Константа диссоциации соблюдать белка стабилизации. Таким образом грубый ориентир для составных концентрации 50 - 100 раз IC50, но более подробно описания составных концентрации находятся в разделе обсуждения.
    Примечание: Переносимость ДМСО клеточных линий должны быть проверены до эксперимента.
  3. Уплотнение соединения лечение пробирного пластины с дышащей пластины уплотнения и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора.

3. тепло вызов

  1. Во-первых Установите ванну водой до нужной температуры. Обратите внимание, что конечная температура, которая достигается внутри скважины пробирного пластины может отличаться от окончательной температуры в водяной бане. Исследовать смещение заранее с Макетные пластины и термопары термометр. Это обычно занимает 30 минут для ванн для стабилизации на требуемую температуру.
  2. Чтобы убедиться, что на этапе Отопление в скважинах пробирного пластины будет достигнута желаемая температура, подготовьте незапечатанных Макетные пластины, содержащие такой же объем среднего как пробирного пластины.
  3. Удаление пробирного пластины из инкубатора. Возьмите дышащей печать и вновь запечатать пробирного пластины, содержащий соединение лечение клетки с жесткой клей фольги обеспечить, что вода не будет течь в скважины во время последующего нагрева в водяной бане. Убедитесь, что отверстия в раме пластины доступны.
  4. Место пробирного и Макетные крышку на водяной бане с нижней части плиты, под углом к поверхности воды, чтобы заставить оставшийся воздух из-под плиты.
  5. Контролировать температуру внутри скважины новой Макетные пластины с помощью термопары термометра.
  6. Тепла пробирного пластины в водяной бане в течение 3 минут. Сразу передача пробирного и Макетные пластины другой водой ванну с водой, комната закаленное, чтобы остыть в течение 5 минут. Пластину пробирного теперь готова для дальнейшей обработки.

4. Фиксация

  1. Отказаться от 16% (w/v) параформальдегида 10 мкл (PFA) непосредственно на пластину пробирного с помощью реагента Дозатор сыпучих или многоканальные пипетки. Инкубируйте 20 минут при комнатной температуре.
    Примечание: Некоторые фиксативов классифицируются как канцерогенные и институциональной безопасности правила должны соблюдаться.
  2. Аспирационная PFA решения и вымыть клетки с 300 мкл PBS с помощью пластины шайбу. Поместите пластины на пластину шайбу и выберите программу, аспирации.
    Примечание: Эта процедура была оптимизирована с помощью протокола переполнения на пластине шайбу в котором жидкость одновременно обойтись и удалены. Если плита шайбу или аналогичная процедура недоступна, Стиральная шаг альтернативно может быть сделано вручную.
  3. Ручной стирки процедуры: Удалите жидкость из скважин, инвертирование пластину с закруткой быстрого руку над лотка для отработанных чернил или раковину. Полное удаление жидкости имеет важное значение для хорошей производительности. 80 мкл PBS с многоканальные пипетки и инвертировать пластину снова, как описано выше, повторите процедуру Стиральная два раза. После последнего мыть пятно пластину против чистого бумажные полотенца для удаления любой избыток жидкости.

5. permeabilization

  1. 20 мкл 0,1% (v/v) NP-40 скважин с многоканальные пипетки и инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут. Вымойте клетки, используя ту же процедуру, как описано выше (шаг 4.2).
  2. Кроме того когда это уместно, примените протокол извлечения антигена, например:
    1. 20 мкл 1% SDS, для скважин с многоканальные пипетки. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут и промыть в том же порядке, описанные выше (шаг 4.2).
    2. Добавьте 80 мкл 10 мм глицин при рН 7,2 и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирационная глицин решения с помощью пластины шайбу, поместив на пластине шайбу и выбор протокола аспирации. Примечания в 2.1 и 4.2 Если плита шайбу не доступен.

6. Блокирование

  1. Мкл 15 1% (w/v), бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS для скважин с помощью реагента Дозатор сыпучих или многоканальные пипетки. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 1 часа, или на ночь при 4 ° C с алюминиевой фольги пластина печатью.

7. первичные антитела

  1. Аспирационная блокирования решения с помощью пластины шайбу, поместив на пластине шайбу и выбор протокола аспирации. Примечания в 2.1 и 4.2 Если плита шайбу не доступен.
  2. 10 мкл основное антитело, разбавленный соответственно в 1% (w/v) BSA в PBS для скважин с помощью многоканальные пипетки. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 1 часа, или на ночь при 4 ° C с алюминиевой фольги пластина печатью.

8. вторичные антитела

  1. Аспирационная основное антитело раствора и промыть скважин в том же порядке, как описано выше (шаг 4.2).
  2. 10 мкл Alexa 488 вторичные антитела, разбавленный соответственно в 1% (w/v) BSA в PBS. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре. Уплотнение пластину с клей Алюминий фольга уплотнением для защиты от света.
    Примечание: Защите плиты от света в течение этого и последующих шагов.

9. Ядерная окрашивание и клеток маска

  1. 10 мкл ядерных краску разбавляют до 0,05 мг/мл в PBS для скважин с помощью многоканальные пипетки. Инкубируйте дополнительные 10 минут при комнатной температуре.
  2. Аспирационная вторичные антитела и Hoechst решения и промыть скважин, используя ту же процедуру, как описано выше (шаг 4.2).
  3. 10 мкл клеток маски, разбавляют до 200 нг/мл в PBS для скважин с помощью многоканальные пипетки. Инкубируйте 30 минут при комнатной температуре.
  4. Аспирационная решение маска клеток и промыть скважин, используя ту же процедуру, как описано выше (шаг 4.2).
  5. Лунки 60 мкл PBS для всех скважин с помощью пластины шайбу, Дозатор сыпучих реагента или многоканальные пипетки и печать пластины с клей фольги.

10. приобретение и анализа изображений

  1. Захват изображения на высокой контента Тепловизор с использованием 3 Флюоресцентная каналов: DAPI (387/447), GFP (472/520) и TexasRed (562/624). Приобрести 4 изображений в колодец, используя 10 X цель. Использование автоматизированных лазерной автофокусом и применять биннинга 2 во время приобретения. Хранить изображения как файлы tiff 16 бит, серая шкала вместе с метаданными.
  2. Анализ изображений с помощью программного обеспечения. Определение границ ячейки с помощью алгоритма, забив ячейки с DAPI (ядра) и TexasRed (цитоплазма).
  3. Экстракт средней интенсивности для всех приобретенных длин волн для дальнейшего анализа данных.
  4. Вычислить коэффициент Z для обеспечения надежности assay.
  5. Рассчитать % стабилизации, с помощью следующей формулы: 100 * (1-(хорошо интенсивности – средняя интенсивность хорошо отрицательный контроль) / (средняя интенсивность позитивного управления средняя интенсивность отрицательный контроль)). Здесь отрицательный контроль ДМСО и положительный контроль является веществом, ссылки. Так как максимальная стабилизации между соединениями может варьироваться и фактически быть больше, чем положительный контроль для ITDRF кривых, максимальной и минимальной стабилизации интенсивности для каждого соединения иногда используются вместо значений интенсивности управления скважин .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, изложенные на рисунке 1 описывает основной рабочий процесс для запуска CETSA анализов на адэрентных клеток с выявления оставшихся растворимого белка с высоким содержание изображений. Этот рабочий процесс может быть легко адаптирована для всех этапов анализа развития, изменяя макет пластины соединений или реагенты14. Мы подробно ожидаемые результаты для нескольких ожидаемых случаев ниже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как обсуждалось в разделе результаты, существует несколько ключевых шагов к процедуре. Во-первых важно определить реагент сродство высокого качества. Мы рекомендуем, скрининг небольшую библиотеку антител для каждой требуемой цели. После того, как был выбран основное антитело, также важно для проверки системы для ряда различных привязки сайтов целевого белка при необходимости. Борьбе с скрининга для соединений, которые мешают пробирного сигнала, как показано на рис. 2 c , исключив вызов тепла...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы имеют не раскрытия информации для доклада.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают, поддержку инфраструктуры от науки для жизни лабораторных и Каролинского института. Авторы также признают ввода и обсуждений с Michaela Vallin, Магдалена Otrocka и Томас Lundbäck.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Medicago09-9400-100
TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12604013для отделения клеток и субкультивирования
16% параформальдегида (PFA)ThermoFisher Scientific28908фиксирующий
козий анти-кроличий IgG (H+L), конъюгированное антитело Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA11008вторичное антитело
HCS CellMask Красное окрашиваниеThermoFisher ScientificH32712Окрашивание цитоплазмы
NP-40Sigma-Aldrich56741для пермеабилизации
окрашивание Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261ядерное окрашивание
Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среда (DMEM) - с высоким содержанием глюкозыSigma-Aldrich6429компонент среды для клеточной культуры
Тепловая инактивированная фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)Sigma-AldrichF9665среды для клеточной культуры
Пенициллин-стрептомицинSigma-AldrichP4333компонент среды для клеточной культуры
Corning, дышащая пластина уплотнениеSigma-AldrichCLS3345для стадии инкубации копаунда
Антитело кролика против p38 [E229]Abcamab170099первичное антитело, LOT:GR305364-16
Falcon, Черные 384-луночные прозрачные донные пластиныVWR736-2044визуализационные пластины
Greiner, 384-луночные малообъемные полипропиленовые пластиныVWR784201
Адгезивная алюминиевая фольгаVWR30127790
Отслаивающееся алюминиевое уплотнениеAgilent24210-001для ингибитора PlateLoc
LY2228820SelleckchemS1494p38α ингибитора
PH797804SelleckchemPH797804ингибитора p38&alpha
BIRB796ингибитора SelleckchemS1574p38&alpha
SB203580ингибитора Tocris1202p38&alpha
AMG 548Tocris3920p38α ингибитор
RWJ 67657Tocris2999p38α ингибитор
L-SkepinonCBCS compound collectionp38α ингибитор
бычьего сывороточного альбумина (BSA)Sigma-AldrichA7030блокатор
SDS (додецилсульфат натрия)BDH44244используемый в извлечении антигенов
ГлицинSigma-AldrichG8898используется в извлечении антигена
А-431 клеткиATCCATC-CRL-1555
Echo 550LabcyteДля приготовления сложных планшетов
Запайщик пластинAgilentPlateLoc
Дозатор реагентовThermo Scientific5840300Multidrop Combi
Автоматизированная жидкость Платформа для работыAgilentBravo; используется для приготовления составных пластин
Мойка пластинTecanHydrospeed
Водяная баняJulaboTW12
ТермопараVWRОтслеживаемый лабораторный термометр
Тепловизор с высоким содержаниемМолекулярные устройстваImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Система анализа
компонент , с жидкостями

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
  2. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165(2015).
  3. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  4. Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
  5. Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
  6. Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).
  7. Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091(2015).
  8. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  9. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  10. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  11. Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040(2016).
  12. Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
  13. Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
  14. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
  15. Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cellular Thermal Shift AssayCompound Target InteractionSubcellular LocalizationIsothermal Dose ResponseThermal Aggregation CurveAntibody RecognitionPlate Washer

Похожие статьи