Методическая статья

На базе РНК перепрограммирование первичной фибробластов в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/58687

⸱

26 ноября 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Dermatology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 2Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 3Stem Cell Biobank and Disease Modeling Core, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем клинически значимых, высокая эффективность, фидер свободный метод перепрограммировать первичной фибробластов в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием модифицированных mRNAs кодирования перепрограммирования факторы и имитирует Зрелые микроРНК-367/302. Также предоставляются методы для оценки эффективности перепрограммирования, разверните клоновых iPSC колоний и подтвердить выражения плюрипотентности маркера TRA-1-60.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) оказалась ценным инструментом для изучения человеческого развития и болезней. Дальнейшее продвижение iPSCs как рекуперативного терапевтических требует безопасной, надежной и целесообразно перепрограммирования протокол. Здесь мы представляем клинически значимых, шаг за шагом протокол для перепрограммирования чрезвычайно высокой эффективности фибробластов дермы в iPSCs с использованием не интеграции подход. Суть протокола состоит из выражения плюрипотентности факторов (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, фьюжн OCT4-мёд) от в vitro транскрибируется посланник РНК синтезируется с изменение нуклеотидов (изменение мРНК). Перепрограммирования модифицированных мРНК transfected в первичной фибробластов каждые 48 ч вместе со зрелыми эмбриональных стволовых клеток конкретных микроРНК-367/302 имитирует за две недели. В результате iPSC колонии можно затем изолированы и непосредственно расширена в фидер свободных условиях. Чтобы максимизировать эффективность и последовательность нашей перепрограммирования протокола через образцы фибробластов, мы оптимизировали различные параметры, включая режим трансфекции РНК, сроки transfections, культуры условий и плотности посева. Важно отметить, что наш метод генерирует высококачественные iPSCs из большинства источников фибробластов, включая образцы больных, престарелых и/или стареющей трудной прошить.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перепрограммирование соматических клеток в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) требует расширенного выражение основного набора транскрипционных факторов, которые имеют важное значение для поддержания плюрипотентности1,2. При производстве iPSCs для клинического применения, важно, что мутационного бремя в ячейки ввода сводится к минимуму во время обработки и эффективность iPSC поколения поддерживается на относительно высоком уровне через пациентов образцов. Однако большинство перепрограммирования методов, в том числе свободной интеграции протоколы, страдает от очень низких перепрограммирования эффективности, которой лимит клинической полезности этих подходов3. Низкая эффективность перепрограммирования могут также содействовать селективного перепрограммирования клетки, переноски существовавшие ранее мутации, увеличивая мутационного бремя в результате iPSCs. Кроме того все на основе ДНК перепрограммирования методы, такие как Лентивирусы и episomal-на основе подходов, страдают от безопасности опасения, что ДНК может случайно интегрироваться в геноме и создать возможность для вредных инсерционному мутагенезу и нежелательные ( потенциально онкогенных) выражение плюрипотентности генов в нижнем течении ткани производные4.

Перспективный подход к достижению эффективного индукция плюрипотентности в соматических клетках и мутационного бремени в результате iPSCs заключается в использовании синтетических ограничен messenger РНК содержащие изменение nucleobases (изменение мРНК) для перепрограммирования5. Эффективность модифицированных перепрограммирования подходов, основанных на мРНК можно повысить путем добавления эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)-конкретных микроРНК (интерферирующим)-367/302s3, которые показали перепрограммировать соматические клетки с повышение эффективности6 ,7. Однако даже с добавлением интерферирующим-367/302s, модифицированных перепрограммирования подход, основанный на мРНК часто происходит сбой во время применения свежевыделенных клеток пациента3. Для устранения несоответствий это изменение подхода, основанного на мРНК мы недавно сообщили оптимизированный, интеграции, свободной стратегию, которая побуждает плюрипотентности в первичной фибробластов с высокий уровень успеха и использует оба измененных mRNAs кодирования Перепрограммирование факторы и зрелые Мирна-367/302 имитирует8. В нашем методе перепрограммирования модифицированных мРНК коктейль включает модифицированную версию OCT4 сливается с мёд transactivation домен (называемый М3O)9 и пять других перепрограммирования факторов (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A и NANOG). Сочетая модифицированных мРНК, кодирование плюрипотентности факторов с Мирна имитирует, как представляется, синергетический эффект на перепрограммирование эффективность в этом протоколе. Дополнительная оптимизация режима трансфекции РНК, мобильный посева, и культивирования условий необходимы также для увеличения перепрограммирования эффективности подхода к ультра-высокого уровня8.

В отличие от многих других протоколов наш перепрограммирования подход обычно требует лишь несколько тысяч входных фибробластов. Кроме того многие общие-интеграция стратегии с использованием episomal плазмид, Сэндай вирус, или самовоспроизводящихся РНК включают обширные пассированый разбавлять перепрограммирования вектор в созданном iPSCs. И наоборот изменение мРНК и зрелые Мирна имитирует имеют короткий период полураспада и быстро устраняются от клеток. Взятые вместе, количество накопительное клетки культуры времени между сбор пациентов образцов и поколения полезная iPSCs минимальна в этот подход, эффективно ограничивающие накопления мутаций в результате iPSCs и повышения эффективности затрат.

Здесь мы представляем подробные пошаговые протокол для достижения высокой эффективности перепрограммирование взрослых фибробластов в iPSCs, с помощью наших комбинаторные модифицированный подход, основанный на мРНК/Мирна8. Эта РНК-протокол на основе перепрограммирования обеспечивает простой, экономически эффективные и надежные метод для создания свободной интеграции iPSCs для исследования и потенциал клинических приложений. Кроме того это применимо к перепрограммированию разнообразные линии фибробластов, включая сложные к перепрограммировать, связанные с болезнью, возрасте и стареющей фибробластов. На рисунке 1показана схема протокола для перепрограммирования фибробластов. Протокол конкретно описывает метод для перепрограммирования три скважины взрослых первичной фибробластов в формате 6-ну пластине. Две скважины обычно дают достаточное количество колоний iPSC высокого качества. Во многих случаях только один также необходима, и третий также может использоваться для анализа эффективности перепрограммирования. При необходимости, количество скважин может быть расширена.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работать в условиях РНКазы бесплатно и использовать асептических методов, когда это возможно. Выполните все манипуляции связанные культуры клеток в кабинет с использованием асептических методов биологической безопасности. Следуйте стандартам институциональных биобезопасности для работы с клетками человека.

1. реагенты и оборудование для приготовления перепрограммирования посвящения

  1. Приготовьте коктейль кодирования перепрограммирования факторы изменения мРНК.
    1. Следуйте ранее опубликованные протокол10 для выполнения в vitro транскрипция, укупорка и dephosphorylation процедуры для каждого измененного мРНК, кодирование отдельных перепрограммирования фактор. После окончательной очистки шага элюировать модифицированных мРНК с нуклеиназы свободной воды, дополнить очищенный модифицированное решение мРНК с 1 битор РНКазы U/мкл, quantitate модифицированных мРНК, используя спектрофотометр и хранить при температуре-80 ° C до 6 месяцев. Подготовьте несколько аликвоты каждого измененного мРНК, чтобы свести к минимуму количество циклов замораживания оттаивания.
      Примечание: Аналогичные протоколы для модифицированных мРНК, производства были сообщила других5,8,11. Шаблоны для в vitro транскрипция может быть порождена амплификации PCR из соответствующих шаблонов плазмида с праймерами, перечисленные в Таблице материалов согласно ранее опубликованные протокол10. Плазмиды шаблоны для каждого перепрограммирования фактор (М3O9SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) и mWasabi (контроль для transfection) доступны из Addgene, некоммерческой плазмида репозитория.
    2. Смешайте все измененные mRNAs в молярное соотношение 3:1:1:1:1:1 (М3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) и включают в себя 10% как элемент управления для обеспечения эффективности transfection mWasabi изменение мРНК. Отрегулируйте концентрацию полное изменение мРНК, перепрограммирование перемешивают до конечной концентрации 100 нг/мкл, добавив воды, свободной от нуклеиназы дополнена 1 битор РНКазы U/мкл. Подготовьте семь 33 мкл аликвоты полное изменение мРНК коктейль. Хранить смешанный перепрограммирования аликвоты-80 ° c.
      Примечание: для каждого трансфекции 1000 нг модифицированных коктейль мРНК добавляется за хорошо (то есть, в общей сложности 3000 нг для 3 скважины). Каждый 33 мкл аликвота размером до transfect 3 скважины 6-ну формат плиты и включает в себя 3 мкл избыточного объема для учета дозирования ошибок. Подготовка 7 33 мкл аликвоты достаточно для завершения полного фибробластов перепрограммирования 3 скважин в формате 6-ну пластине.
  2. Приготовьте коктейль перепрограммирования имитирует Мирна.
    1. Растворите лиофилизированный имитирует микроРНК (Syn имеет мир 302a - 3p, Syn имеет мир 302b - 3p, Syn имеет мир - 302c - 3p, Syn имеет мир-302d-3 p, Syn имеет мир-367-3 p) до конечной концентрации 5 пмоль/мкл (5 мкм) в свободной от нуклеиназы воды с 1 U/мкл битор РНКазы. Подготовить несколько аликвоты каждого Мирна мимические и хранить при температуре-80 ° C для длительного хранения.
    2. Смешайте все Мирна имитирует в 1:1:1:1:1 молярное соотношение до конечной концентрации 5 пмоль/мкл (5 мкм). Подготовьте семь 14 мкл аликвоты Мирна имитирует микс. Хранить смешанный аликвоты-80 ° c.
      Примечание: Для каждого трансфекции, 20 пмоль Мирна имитирует смесь добавляется за хорошо (то есть, в общей сложности 60 пмоль для 3 скважины). Каждый 14 мкл аликвота размером до transfect 3 скважины 6-ну формат плиты и включает в себя 2 мкл избыточного объема для учета дозирования ошибок. Подготовка 7 14 мкл аликвоты достаточно для завершения полного фибробластов перепрограммирования 3 скважин в формате 6-ну пластине.
  3. Подготовьте трансфекции буфера.
    1. Предварительно теплой бутылка 500 мл и 1 флакон 100 мл свежей среды сокращение сыворотке до комнатной температуры (RT) для приблизительно 2Н. Не использовать на водяной бане.
    2. РН-метер передать биобезопасности кабинета. Помойте стеклянные электроды с нуклеиназы свободной воды. Калибровка pH метр согласно инструкциям изготовителя. Вымойте электрод снова с нуклеиназы свободной воды.
    3. Перевести обе бутылки сокращение сыворотке среды в кабинет биобезопасности. Используйте бутылка 500 мл RT для регулировки рН.
    4. Измерьте Базовый pH среды сокращение сыворотке, вставив Стеклянный электрод pH метр в буфер. Перед чтением pH на метр, подождите до 1 мин.
    5. Добавить 3-4 мл 1 M NaOH в 500 мл среды сокращение сыворотке, закройте бутылку и хорошо перемешать. Ждать до 5 мин, прежде чем открывать бутылку для измерения рН. Вставьте буфер рН электроды и подождите, пока чтение на pH метр стабилизируется.
    6. Продолжайте добавлять небольшие объемы 1 M NaOH до тех пор, пока pH среды сокращение сыворотке достигает 8.15 – 8.17. Калибровка pH метр несколько раз во время процесса. Если в любой момент pH становится выше, чем 8.18, уменьшить его, добавляя свежий сокращение сыворотке среднего из подогретым 100 мл бутылки (шаг 1.3.1).
      Примечание: pH буфера снижена сыворотка на основе среднего трансфекции имеет решающее значение. Перепрограммирование будет успешным, если pH буфера трансфекции около 8.2 ± 0,05 но может завершиться ошибкой, если рН выше чем 8,25. Поэтому рекомендуется прекратить добавление NaOH, когда буфер рН достигает 8.15 – 8.17. Это будет гарантировать, что окончательный рН трансфекции буфера является примерно 8.2 – 8.22 после стерилизации.
    7. Фильтр стерилизовать трансфекции буфера, используя систему вакуумной фильтрации 0,22 мкм. Алиготе стерилизованные буфера в 5 или 15 мл пробирки с минимальным воздушным пространством.
    8. Хранить аликвоты трансфекции буфера на срок до 3 месяцев при 4 ° C. Измерение pH аликвоты периодически. Если pH выше чем 8.25, отказаться от аликвоты. Ограничить аликвота использование 2 transfections только так, как воздействие буфера трансфекции атмосферного воздуха увеличивает pH буфера.
  4. Приготовить средство расширения фибробластов (FEM): минимум основных средних дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1 x несущественные аминокислот, 1 x глютамин добавки, 55 мкм 2-меркаптоэтанол, 1 х перо/воспаление/fungizone. Магазин FEM на 4 ° C.
  5. Подготовить перепрограммирования средний: DMEM/F12 (не HEPES) дополнены нокаут 20% сыворотки замена (KOSR), 0.5 x несущественные аминокислот, 0.5 x глютамин добавки, 55 мкм 2-меркаптоэтанол, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 1 х перо/воспаление/fungizone, bFGF 100 нг/мл и 200 нг/мл B18R. Подготовка среды в момент начала перепрограммирования без bFGF и B18R и хранить при 4 ° C. Не использовать его после 1 месяца после подготовки. Добавьте bFGF и B18R непосредственно перед каждым использованием Алиготе, размера для использования в тот день.
  6. Подготовка среднего покрытие, добавив 5% тепло инактивированных (HI) FBS в перепрограммирования носитель, содержащий 20% KOSR без bFGF и B18R на шаге 1.5. Подготовка среднего свежие в день предполагаемого использования. Добавление bFGF и B18R непосредственно перед использованием в день 0 перепрограммирования.
  7. Калибровка инкубаторы культуры ткани перед инициализацией перепрограммирования согласно инструкции производителя, используя портативный цифровой анализатор CO2 . Используйте низкий O2 инкубатора для перепрограммирования шаги для обеспечения успешного iPSC поколения.

2. культивирование фибробластов для перепрограммирования

  1. Подготовьте фибробластов до начала перепрограммирования (день -2).
    1. Герб новой культуры ткани плита 10 см с 5 мл 0,1% желатина. Коснитесь или закружить пластина обеспечить что вся поверхность покрыта. Инкубируйте 15 мин при температуре 37 ° C. Аспирационная желатина и добавляют 10 мл к ФЕМ набора сторону. Не позволяют покрытием поверхности пластины для просушки перед добавлением к ФЕМ.
    2. Тщательно аспирационная отработанного среднего из фибробластов. Промойте клетки один раз с 5 мл DPBS для удаления остаточных сыворотки. Добавьте 3 мл трипсина-ЭДТА. Осторожно покачайте пластина обеспечить полный охват над клетки.
    3. Аспирационная лишнюю жидкость, оставляя ~ 500 мкл трипсина. Не чрезмерно аспирационная, поскольку это может высушить и убить фибробластов. Инкубировать фибробластов с трипсина ЭДТА на 3 мин при температуре 37 ° C.
    4. Снять пластину из инкубатора и твердо, но осторожно коснитесь стороне пластины выбить клетки. Проверьте клетки под микроскопом. Если клетки отдельностоящий и плавающий, продолжить. Если клетки по-прежнему прилагаются, Инкубируйте еще 3 мин.
    5. Быстро промыть/собирать отдельные ячейки, используя 5 мл ФЭМ для нейтрализации трипсина ЭДТА. Переместите подвеска фибробластов в 15 мл Конические трубки. Убедитесь, что клетки перемешанных.
    6. Аккуратно перемешайте суспензию клеток разорвать большие скопления клеток, а затем подсчитать их на Горяева. Передачи 2,5 x 105 клеток в желатин покрытием 10 см блюдо, приготовленное в шаге 2.1.1. Инкубируйте клетки на ночь в 37 ° C, 5% CO2 увлажненные регулярные культуры ткани инкубатора.
      Примечание: Плотность клеток имеет решающее значение для достижения высокой эффективности перепрограммирования, как важно, что фибробласты здоровым и быстро делящиеся. Обшивка 2,5 x 105 клеток дает 40-60% confluency 2 дня позже для большинства образцов фибробластов. Скорректировать сумму за больными или стареющей клетки для достижения желаемого 40-60% confluency 48 h позже.
    7. Замените носитель 10 мл свежего ФЭМ следующий день (-1).
  2. Пластина фибробластов инициировать перепрограммирования (день 0).
    1. Убедитесь, что фибробласты чтобы перепрограммировать на 40 – 60% confluency (рис. 2, день 0). Если клетки над - или недостаточного притока, проход фибробласты, как описано в шаге 2.1 и соответствующим образом корректировать плотность покрытия. Культура для еще 2 дней.
    2. Передача 4 мл DPBS в 15 мл Конические трубки. 100 мкл рекомбинантных человека (rh) Ламинин-521. Пипетка вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать.
    3. Добавьте 1 мл на хорошо разбавленных rhLaminin-521 в 3 скважины 6-ну плиты. Инкубируйте пластину с покрытием при 37 ° C на 2 ч.
    4. Теплый 6 мл FEM и 4 мл покрытие средне-37 ° C. Дополнить покрытия среды с bFGF до конечной концентрации 100 нг/мл и B18R до конечной концентрации 200 нг/мл.
    5. Тщательно аспирационная отработанного среднего из фибробластов (шаг 2.2.1). Промойте клетки с 5 мл DPBS и добавить 3 мл трипсина-ЭДТА. Осторожно покачайте плиты для покрытия клетки с трипсина ЭДТА.
    6. Аспирационная лишнюю жидкость, оставляя ~ 500 мкл трипсина, как это сделано в шаге 2.1.3. Инкубировать фибробластов с трипсина ЭДТА на 3 мин при температуре 37 ° C. Снять пластину из инкубатора и твердо, но осторожно коснитесь стороне пластины выбить клетки. Проверьте клетки под микроскопом. Если клетки отдельностоящий и плавающий, продолжить. Если клетки по-прежнему прилагаются, Инкубируйте еще 3 мин.
    7. Промыть/собирать отдельные ячейки, используя 5 мл ФЭМ для нейтрализации трипсина ЭДТА. Переместите подвеска фибробластов в 15 мл Конические трубки. Убедитесь, что клетки перемешанных и считать их на Горяева. Пипетка 12000 клетки в 4 мл среды подогретую обшивка из шага 2.2.4.
      Примечание: Не центрифуга клетки в любой точке. Количество покрытием клеток может корректироваться вверх или вниз как необходимые для медленно или быстро растущих линий, соответственно.
    8. Снять пластину с покрытием из инкубатора и аспирационная разбавленных rhLaminin-521 с покрытием скважин. Не позволяют поверхности лунки для просушки. Нежно ресуспензируйте клеток в среде обшивки. Пипетка 1 мл суспензии клеток в каждой покрытием хорошо (т.е., 3000 клетки за хорошо).
    9. Поместите покрытием клетки в tri Газовый инкубатор культуры ткани с O2 равным 5% (низкий O2). Как только пластину, мягко, но тщательно разогнать клетки, чередуя движение вверх/вниз, затем влево/вправо. Повторите движения 2 раза. Инкубируйте клетки на ночь. Не вихрем пластину для смешивания.
    10. Пипетка 4 мл перепрограммирования средне-15 мл Конические трубки и поместите его в низкой O2 инкубатора ослабил крышкой, чтобы сбалансировать на ночь. Не добавляйте bFGF и B18R до следующего дня.

3. начало перепрограммирование (1 день)

Примечание: После перепрограммирования инициируется, ежедневное обслуживание не требуется для примерно 1 месяц. Убедитесь в том планировать соответственно. Все последующие ячейки инкубаций должны выполняться в условиях низкой O2 в 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 увлажненные tri Газовый инкубатор культуры ткани.

  1. Замените покрытие среднего по крайней мере 1 h до transfection.
    1. Удалите средство уравновешенной перепрограммирования из низкой O2 инкубатора. Добавьте bFGF в конечной концентрации 100 нг/мл и B18R до конечной концентрации 200 нг/мл. Хорошо перемешайте.
    2. Исходя с 1 хорошо в то время, используйте 1 мл пипетки для удаления отработанного среднего и заменить его 1 мл перепрограммирования среды, дополненная bFGF и B18R. Повторите это действие для каждой скважины. Не следует использовать вакуум-аспирации, который чрезмерно высушивает клетки, вызывает стресс и снижает эффективность перепрограммирования. Переместите пластину с клетками обратно в низкой O2 инкубатора.
  2. Transfect фибробластов с 5 мкл Реагента transfection RNAiMax за 1 мкг модифицированных мРНК, и 1 мкл Реагента трансфекции за 6 пмоль Мирна имитирует за transfection.
    Примечание: Оптимальные результаты получаются при transfections перейти на 16 – 20 ч. Трансфекция реагент является разбавленной 10 x; 100 нг/мкл, является изменение мРНК коктейль разбавляют 5 x; и 5 имитирует пмоль/мкл Мирна, что смесь разбавляют 8,33 x с трансфекции буфера до комплексообразования. Резюме трансфекции установки см. в таблице 1 .
    1. При подготовке трансфекции смеси, свести к минимуму потенциального воздействия реагентов РНКазы, следуя стандартным лабораторной практики.
    2. Сбалансировать Алиготе трансфекции буфера (шаг 1.3) для примерно 1 час на RT. Не использовать ванну воды 37 ° C или инкубатор для разогрева трансфекции буфера.
    3. Удаление одного Алиготе модифицированных mRNAs (33 мкл) и Мирна имитирует (14 мкл) от-80 ° C и согреть их для RT для примерно 3-5 мин, до тех пор, пока растаяло. Не размораживать аликвоты при 37 ° C. Спина их вниз кратко в отцентрифугировать.
    4. Теплый трансфекции реагент для RT для примерно 3-5 мин. Не использовать ванну воды 37 ° C или инкубатора. Инвертировать закрытой трубе 2 – 3 раза перемешать Реагент. Спина его вниз кратко в отцентрифугировать.
    5. Перевести 279 мкл буфера трансфекции RT в пробки microcentrifuge РНКазы бесплатно. 31 мкл Реагента трансфекции для достижения окончательный объем 310 мкл. смесь тщательно, закупорить. Сделать не вихря. Инкубируйте трубки в РТ за 1 мин.
      Примечание: Этот объем разреженных трансфекции реагента достаточно для сложных модифицированных мРНК и Мирна имитирует аликвоты из шага 3.2.3.
    6. 132 мкл буфера трансфекции RT, в 33 мкл Алиготе модифицированных мРНК. Пипетка осторожно смешать: окончательный объем составляет 165 мкл.
    7. Мкл 102.6 RT трансфекции буфера для 14 мкл Алиготе имитирует Мирна. Пипетка осторожно смешать: окончательный объем является 116.6 мкл.
    8. Добавьте что 165 мкл Реагента разреженных трансфекции из шага 3.2.5 для разреженных изменение мРНК из шага 3.2.6. Пипетка для смешивания: окончательный объем составляет 330 мкл.
    9. Добавьте 116.6 мкл Реагента разреженных трансфекции из шага 3.2.5 разреженных Мирна имитирует смесь из шага 3.2.7. Хорошо перемешайте (конечный объем является 233.2 мкл). Инкубируйте 15 мин на RT, чтобы позволить трансфекции буфера комплекс с модифицированных мРНК и имитирует Мирна.
    10. Снимите крышку с ячейками от низкой O2 инкубатора. Добавьте 100 мкл (1 мкг) complexed изменение мРНК трансфекции смеси для каждой скважины, каплям через скважины. Разогнать трансфекции комплексы, мягко, но тщательно агитацию пластину с движением вверх/вниз, затем влево/вправо. Не вихрем пластину для смешивания.
    11. Мкл 66,7 (20 пмоль) complexed Мирна имитирует трансфекции смеси для каждой скважины, каплям через скважины. Разогнать трансфекции комплексы, мягко, но тщательно агитацию пластину с движением вверх/вниз, затем влево/вправо. Не вихрем пластину для смешивания.
    12. Поместите transfected клеток в tri Газовый инкубатор с O2 равным 5% (низкий O2). Как только пластину, разогнать трансфекции комплексы снова мягко но тщательно агитацию пластину с движением вверх/вниз, затем влево/вправо.
    13. Пипетка 4 мл перепрограммирования среднего в 15 мл Конические трубки и поместите его в низкой O2 инкубатора с ослабил шапку, чтобы сбалансировать на ночь. Не добавляйте bFGF и B18R до следующего дня.
Труба 1 - RNAiMax разрежения (1 mix)
РеагентКонцентрацияОбъем
Трансфекция буфер279 МКЛ
RNAiMax (Добавление 2)10 x31 МКЛ
Итого: 310 мкл
(1 мин при комнатной температуре инкубации)
Труба 2 - изменение мРНК смесь (2-микс)
РеагентКонцентрацияОбъем
изменение мРНК микс100 нг/мкл (5 x)33 МКЛ
Трансфекция буфер132 МКЛ
Итого: 165 мкл
(добавьте одинаковый объем разреженных RNAiMax с трубки 1)
Труба 3 - miRNA имитирует смешивать (3-микс)
РеагентКонцентрацияОбъем
Мирна имитирует микс5 пмоль/мкл (8.33 x)14 МКЛ
Трансфекция буфер102.6 МКЛ
Итого: 116.6 мкл
(добавьте одинаковый объем разреженных RNAiMax с трубки 1)

Таблица 1: Подготовка трансфекции смеси.

4. Замена перепрограммирование среднего между Transfections (2, 4, 6, 8, 10 и 12 дней)

  1. Замените после трансфекции средних 16 – 20 h, как описано в 3.1.1–3.1.2. Добавьте bFGF в конечной концентрации 100 нг/мл и B18R до конечной концентрации 200 нг/мл в перепрограммирования средних аликвоты.
  2. Мониторинг mWasabi выражение ежедневно, чтобы подтвердить трансфекции качества с помощью микроскопа, настроенные для визуализации EGFP.
    Примечание: mWasabi выражение должно быть очевидным, минимально на 2 день и увеличение яркости с каждой дополнительной transfection.

5. каждый-другие-день Transfections (3, 5, 7, 9, 11 и 13 дней)

  1. Выполните трансфекции, как описано в шаге 3.2. Не изменяйте среды на дни transfection.
  2. Подготовка 4 мл Алиготе перепрограммирования среднего и поместите его в низкой O2 инкубатора чтобы сбалансировать для среднего изменения на следующий день. Не добавляйте bFGF и B18R до следующего дня.

6. процедуры после окончательного Transfection

  1. Выполнять ежедневные среднего изменения от 14 день через приблизительно 17-й день. Теплый 7 мл перепрограммирования средне-37 ° C. Добавьте bFGF в конечной концентрации 100 нг/мл.
    Примечание: B18R отпадает после окончательного transfection. За день 14 это больше не нужно сбалансировать среднего ночь в низкой O2 инкубатора.
  2. Удалите средство от всех скважин с использованием Серологические Пипетки. Продолжать избегать использования аспирации. Добавьте 2 мл перепрограммирования среднего дополнена bFGF за хорошо.
  3. В дни, 17 и 18 анализируйте перепрограммировать скважин под рассечения или инвертированный микроскоп. Если колонии формируются в непосредственной близости друг от друга из-за высокой эффективности перепрограммирования и может быть вручную изолированные, отдельные колонии, выполняя Факультативный пассированый перепрограммировать скважин, описанный в шаге 7 ниже. Если колонии являются разреженные и хорошо разделяются, вручную выберите клоны непосредственно от перенесенной хорошо, как описано в шаге 8 и iPSCs субкультура согласно стандартных протоколов.

7. факультативные процедуры: Пассированый клетки от перепрограммировать скважин с использованием ЭДТА

  1. Подготовьте 0,5 мм ЭДТА в DPBS (ЭДТА) путем разбавления ЭДТА Стоковый раствор 0,5 М. Фильтр стерилизуют EDTA, с использованием системы вакуумной фильтрации 0,22 мкм.
  2. Подготовка среднего фидер бесплатно плюрипотентных стволовых клеток (PSC) (например, mTeSR1) согласно инструкциям производителя. Предварительно теплой 32 мл PSC средних 37 ° C.
  3. Покройте все скважины двух 6-ну формат пластин с Госкомсанэпиднадзором квалифицированных внеклеточного матрикса (ECM) следуя инструкциям производителя. Печать пластины с парафином пленкой и инкубировать их за 1 час на RT.
  4. Аспирационная решение ECM с подогретым пластин и заменить его с 2 мл среды PSC в колодец. Не позволяют поверхности лунки для просушки. Отложите их в сторону.
  5. Аспирационная перепрограммирования среднего от 2 перепрограммировать скважин в день, когда колонии большие и четко сформированный (обычно 18 день). После промойте с 1 мл раствора ЭДТА и аспирата.
  6. Добавьте 1 мл ЭДТА на хорошо. Инкубируйте 4 мин при 37 ° C.
  7. Осторожно удалить пластину из инкубатора и поместите его в биобезопасности кабинета.
    Примечание: на данный момент, клетки могут быть очень слабо придерживался и легко выбили.
  8. Тщательно аспирационная ЭДТА с обеих скважин. Добавьте 3 мл подогретым PSC среднего для каждой хорошо относиться с ЭДТА. Использование ячейки скребок мягко, но тщательно выбить клетки от обеих скважин.
  9. Используйте Серологические Пипетки для нежно Пипетка суспензию клеток и распадаются крупные сгустки. Не Пипетка, пока все ячейки сгустки ушли. Сохраните iPSC кластеров.
    Примечание: Обшивка большого скопления не повлияет iPSC колонии нарост. Если существует чрезмерно больших клеток сгустки, просто Избегайте их перевода в следующий блюдо.
  10. С помощью Серологические Пипетки, равномерно распределять клетки от каждой скважины, ЭДТА лечение дозирования 0,5 мл в каждую лунку пластину 6-ну ECM-покрытием.
    Примечание: Не смешивайте клетки от перенесенной скважин (т.е., перепрограммировать хорошо 1 следует равномерно распределены в первые 6-ну пластину, и перепрограммировать хорошо 2 следует равномерно распределены в пластину второй 6-ну).
  11. Переместите покрытием клетки обратно в низкой O2 инкубатора. Чтобы равномерно распределить клетки, встряхните каждой плиты возвратно поступательное и side-to-side. Не водоворот. Замените средство PSC ежедневно.

8. сбор iPSC колоний

  1. Предварительно теплой 15 мл PSC средних 37 ° C. Покройте всех скважин одной пластине 6-Ну с Госкомсанэпиднадзором квалифицированных ECM следуя инструкциям производителя. Печать пластины с парафином пленкой и инкубировать их за 1 час на RT.
  2. Аспирационная питательной среды из скважин используются для сбора iPSCs. После промойте с 1 мл раствора ЭДТА и аспирата. Добавьте 1 мл ЭДТА на хорошо. Инкубируйте 4 мин при 37° C. В то время как инкубации клеток, аспирационная решение ECM с подогретым пластин и заменить 2 мл PSC среднего за хорошо. Отложите пластины.
  3. Осторожно удалите пластину с iPSCs взял из инкубатора и поместить его в области биобезопасности кабинета.
    Примечание: на данный момент, клетки могут быть очень слабо придерживался и легко выбили.
  4. Тщательно аспирационная ЭДТА. Очень аккуратно добавьте 3 мл подогретым PSC среды, стараясь не выбить iPSC колоний.
  5. Перемещение, пластину для рассечения или инвертированный область лучше визуализировать колоний. Подготовьте 1 мл пипетки с стерильных наконечником. Угнетают плунжер полностью, а затем аккуратно почистить колонии рисуя медленно жидкости в наконечник для сбора колонии в наконечник пипетки. Рисование как мало среды как можно при выборе iPSC колонии.
  6. Для передачи в колонии, Пипетка вверх и вниз 3-4 раза в одной хорошо ECM-покрытием плиты из шага 8.2. Повторяйте до тех пор, пока 6 колонии были собраны и переведены в индивидуальные добра. Выбрать не более 2 колонии от любого одного хорошо если необязательный пассированый описано в шаге 7 было выполнено.
  7. Используйте стандартный стволовых клеток человека протокол для замораживания вниз все остальные скважины. Размораживание и повторно пластины замороженные запасы, если больше колоний должны быть собраны позже.

9. характеристика iPSCs

  1. Выполните, TRA-1-60 пятная для анализа перепрограммирования эффективности (18 день).
    Примечание: 2 из 3 перепрограммировать скважин пассированные для будущих колонии комплектации. Остальные могут использоваться также для окрашивания TRA-1-60. Эта процедура может быть выполнена на вершине стенде лаборатории.
    1. Вымойте перепрограммировать хорошо с 1 мл раствора PBS. Исправьте клетки с ледяной метанола при-20 ° C за 5 мин.
    2. Аспирационная метанола. Сухой колодец для около 2 мин. Будьте осторожны, чтобы не слишком сухой. Клетки сушеные достаточно, когда они становятся полупрозрачными/матовый цвет.
    3. Мыть хорошо 3 раза с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежным встряхивания. Во время мойки Подготовьте 3 мл 3% перекиси водорода в PBS.
    4. Аспирационная PBS. Добавьте 2 мл разбавленного раствора перекиси. Инкубируйте 15 мин на RT с нежным встряхивания. Подготовка 4 мл раствора блокировки: 10% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS.
    5. Аспирационная перекисного раствора. Мыть хорошо 2 раза с 1 мл раствора PBS на 5 мин.
    6. Аспирационная PBS и добавить 2 мл блокирования раствора в скважину. Инкубировать 1 час на RT.
    7. Мыть хорошо 3 раза с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежным встряхивания.
    8. Разбавьте основного антитела анти TRA-1-60 на 1: 100 в решении блокировки, дополнена азид натрия 0.05%. Готовим 1 мл разбавления антитела для 1 хорошо блюдо 6-ну формат. Добавьте разбавления антитела к колодцу и обернуть тарелку с парафина, чтобы избежать испарения. Инкубируйте на ночь при 4 ° C с нежным встряхивания.
      Примечание: При необходимости, инкубация с основное антитело может быть сделано за 1 час на RT с нежным встряхивания. Основное антитело разрежения может повторно использоваться до 5 раз.
    9. После инкубации с основного антитела мыть хорошо 3 раза с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежным встряхивания.
    10. Разбавленных вторичных HRP-конъюгированных антител анти мыши при 1: 200 в решении блокировки. Инкубируйте колодец с вторичное антитело разбавления 2 h на RT с нежным встряхивания.
    11. Аспирационная вторичное антитело разрежения и мыть хорошо 3 раза с 1 мл раствора PBS на 5 мин с нежным встряхивания.
    12. Во время третьей стирки Подготовьте раствора субстрата после инструкции производителя. После окончательной стирки аспирационная PBS. Добавить 1 мл раствора субстрата и инкубировать до тех пор, пока желаемый цвет развивается (примерно 10 минут).
    13. Аспирационная раствора субстрата. Промойте колодец с водой в течение 5 мин при нежно тряска.
    14. Подсчет колоний, при желании. Перепрограммирование эффективность = (количество колоний) / (количество покрытием фибробластов) х 100%.
    15. Для длительного хранения аспирационная воды от окрашенные пластины и просушите на ночь на RT. Seal сушеные пластины с парафина и хранить при 4 ° C на срок до 2 лет для оценки эффективности перепрограммирования позже.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это обычно занимает около 5-6 недель с начала фибробластов перепрограммирования замораживания первых ампул iPSCs (рис. 1). Перепрограммирования протокол в целом можно подразделить на два этапа. Этап 1 включает в себя культуры фибробластов и семь transfections, с перепрограммирования РНК коктейль выполняется каждые 48 ч. Фаза 2 изоляции, расширения и характеристик iPSC колоний.

Перед началом протокол, следует обеспечить, что фибробласты чтобы перепрограммировать имеют хорошее качество. Здоровые фибробластов должен появиться веретеновидной формы, биполярный и refractile с удвоение время около 24 ч. День 0 250000 клетки покрытием в 10 см блюдо в день -2 должен вырасти до 40 – 60% confluency (рис. 1, день 0) и дают примерно 6 – 10 x 105 клеток. Клетки, растет более медленными темпами, могут быть компенсированы для обшивки на более высокой плотности на день -2 и на день 0 для перепрограммирования.

Фибробласты должен появиться очень разреженный следующие покрытия в колодец формат 6-ну блюдо для перепрограммирования (рис. 2, 1 день). Двадцать четыре часа после первого трансфекции, фибробласты теряют форму шпинделя и принять более округлые морфологии (рис. 2, 2-й день), который поддерживается через остаток перепрограммирования. Зеленая Флуоресценция от mWasabi мРНК следует минимально наблюдаемых на 2 день и неуклонно увеличение яркости будет отчетливо видна на 4 день. Способность обнаруживать mWasabi флюоресценции может зависеть от сферы чувствительность и установки. Плотность клеток постепенно и последовательно увеличится на протяжении первых трех transfections (дни 1-6), с очевидной всплеск распространения, происходящих между 7 и 8 дней. Клетки должны появиться во многом вырожденная день 10 (Рисунок 2, 10 день). Первые колонии iPSC может появиться уже в день 11 (рис. 2, 11 день); Однако колоний, не может быть наблюдаемой до позднего вечера 18 день. Как правило, дней 15 – 18, будет большой и очевидным iPSC колоний, которые явно отличаются от окружающих, неполно перепрограммировать фибробластов (Рисунок 2, день 15 и на рисунке 3, 17-й день). Иммуноокрашивания для плюрипотентности маркер TRA-1-60 может выполняться для оценки эффективности перепрограммирования (рис. 3, день 17, TRA-1-60). По нашему опыту, большинство линий фибробластов принести сотни колоний за перепрограммировать хорошо (рис. 3, Вставка B).

Неоптимальный обшивка плотность является наиболее распространенной причиной для снижения эффективности перепрограммирования в наш протокол и часто ассоциируется с фибробласты, которые больной, стареющей или высокой проход. Если покрытие плотность является слишком низким, там будет большой бесклеточной бесплодной патчи в конце перепрограммирования (рис. 4 c), и iPSC колоний не могут образовывать (рис. 4 d). Перепрограммировать клетки должен быть очень вырожденная днем 14 (Сравните Рисунок 4A и 4B Рисунок 2, день 14). Аналогично Если клетки покрыты слишком плотно или слишком быстро размножаться, перепрограммирование эффективность резко снижается.

Для поддержания однородности пациента производные iPSCs, важно расширить линии клетки от одной колонии. После перепрограммирования эффективность очень высока в наш протокол, соседних iPSC колоний может формируют в непосредственной близости от и вырасти в каждой другой (рис. 3, дней 15 – 17). Это иногда затрудняет механически отделить единую колонию клоновых расширения. Мы нашли, что это полезно для первого прохода перепрограммировать хорошо и разбавить его через большую область культуры. Отношение хорошее прохождение состоит из равномерно расщепления перепрограммировать 6-хорошо формат плиты по всей пластине 6-хорошо.

После разбавления проход iPSCs растут как колоний и легко отличить от фибробластов (рис. 5, 18 день). Первоначально iPSC колонии может быть слабо упакованы, и отдельные клетки имеют относительно большой цитоплазматических области. В течение 4-7 дней iPSCs размножаются и образуют характерный плотно упакованные колонии с определенными краями. Отдельные клетки внутри колонии имеют большой ядерной дроби с ядрышками видно (рис. 5, день 22). Там должно быть много колоний, которые формируют в каждой скважине, и только те, с классические iPSC морфология следует выбрал для расширения.

figure-results-1
Рисунок 1 : Перепрограммирования фибробластов в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Представлена схема протокола для перепрограммирования фибробластов. Фибробласты сначала пассированной на низкой плотности в колодец формат 6-ну блюдо, следуют семь transfections выполняются с интервалом 48 ч. Средний — заменил 16 – 20 ч после каждого transfection. Перепрограммировать iPSCs сначала пассированной на приблизительно день 18 и клоновых колонии собираются на день 26. Как правило фибробластов, полученных iPSC линии могут быть заблокированы для длительного хранения день 38. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2 : Представитель ежедневные изображения во время каждого дня перепрограммирования. Фибробласты должно быть примерно 40-60% притока на время прохождения инициировать перепрограммирования (день 0, клетки покрыты в 10 см блюдо). Первый трансфекции (T1) происходит на 1 день, и клетки должны появиться на данный момент очень редок. В следующий день (2), более округлые морфология должно стать очевидным. Клетки продолжит увеличение плотности по всей протокол с iPSC кластеры, начинают появляться уже в день 11 (обведено красным). На 15 день iPSC колонии будет большим с сдержанный границ. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3 : Формирования колонии, после transfections с перепрограммирование изменение мРНК и имитирует Мирна. Низкий увеличение изображения были взяты представителя перепрограммирования дни 15 – 17. После окончательного трансфекции перепрограммировать iPSCs будет образуют четкие колонии с определенными границами, которые расширить размер и уплотняют стать явно отличается от неполно перепрограммировать окружающие фибробластов. Иммуноокрашивания для плюрипотентности маркер TRA-1-60 указывает на присутствие iPSCs (врезные A) и может использоваться для расчета перепрограммирования эффективность путем подсчета всех колоний в пределах одной скважины (врезные B, примеры countable колоний, обведена зеленым). Шкалы бар = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4 : Представитель изображения югу оптимального покрытия плотности для перепрограммирования. (A, B) Примеры фибробласты, которые являются слишком редкий день 14 перепрограммирования (Сравните Рисунок 2, день 14). (C) малое увеличение изображения на день 17 перепрограммирование с большой, бесплодную патч кружил в красный цвет. (D) же хорошо фиксированной и витражи для тра-1-60 для подтверждения общего бедных перепрограммирования эффективности из-за низкой клеток плотности. Масштаб баров = 200 мкм (A, B) и 1 мм (C, D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5 : Представитель изображений iPSCs после первоначального прохода. После завершения transfections с перепрограммирование модифицированных мРНК и Мирна мимики, перепрограммировать клетки являются пассированной на 17 – 20 дней. iPSCs имеют преимущество роста в среде PSC и быстро настигнуть любого фибробласты, которые неполностью были перепрограммированы. Первоначально iPSCs сформирует колоний, которые могут появиться свободно с плохо определенными границами. В течение нескольких дней клетки быстро размножаться и взять на характерные морфологию клеток плотно упакованные с высоким соотношением ядро и цитоплазму, плотно кластеризации в колонии с различных границ. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает клинически значимых, -интеграции, на основе РНК метод, который позволяет для перепрограммирования линий нормальной и болезней, связанных фибробластов человека в iPSCs в ультра-высокой эффективности. На сегодняшний день, каждая линия фибробластов человека, которую мы пытались прошить с описанной протоколом принесло удовлетворительное количество высокого качества iPSCs течению приложений. Полученный iPSCs немедленно могут передаваться и расширена в условиях свободной подачи культуры.

Качество фибробласты для перепрограммирования:

Перепрограммирование успех в значительной степени зависит качество начиная фибробластов. В идеале перепрограммирования следует начать с низкий проход фибробластов, для достижения максимальной эффективности. Перепрограммирование эффективность лучше с фибробластов прохода 2 – 4. Перепрограммирование может по-прежнему работать с высоким проход (проезд 5 – 8), даже стареющей фибробластов, хотя и с ограниченной эффективностью. Иногда низкий проход фибробластов недоступны или у пациентов образцов генетической мутации, которая предотвращает здорового роста. В этом случае может потребоваться оптимизация первоначального покрытия плотности. Перепрограммирование скомпрометировано фибробластов линий обычно ассоциируется с повышенной клеточной гибели во время transfections РНК. В результате клетки в перепрограммировании хорошо появится быть разреженными, 10 – 14 дней перепрограммирования. Большие площади бесклеточной также будут видны в колодец. Если это так, перепрограммирования протокол будет нужно быть повторно начатый с выше первоначального начальное количество фибробластов. Обшивка 3000 ячеек ввода на хорошо блюдо 6-ну формат работает последовательно для большинства взрослых фибробластов линий. Однако увеличение числа обшивки до 5000-10000 (50,000 для стареющей линий) может помочь улучшить перепрограммирования болезни связанные образцов, как уже сообщалось в нашей предыдущей публикации8. Наоборот клетки, достигнув confluency слишком рано может быть также устойчив к перепрограммированию. Если клетки проходят transfections с перепрограммирование RNAs размножаются слишком быстро (как это иногда бывает с первичной неонатальной фибробластов), инициировать, перепрограммирование с 500 фибробластов в хорошо 6-ну формат блюдо8.

Обработка по transfection буфера:

PH трансфекции буфера (сокращение сыворотке средний скорректирована с рН 8,2) имеет первостепенное значение для достижения оптимального трансфекции эффективность, необходимые для этого перепрограммирования протокол. По этой причине рекомендуется использовать несколько мер предосторожности относительно обработки трансфекции буфера. Мы обнаружили, что даже короткое воздействие буфера трансфекции атмосферного воздуха влияет на pH буфера. Таким образом transfection буфера должен быть aliquoted в контейнер колпачок с минимальным воздушным пространством (мы используем 5 или 15 мл колпачок конические трубы). Для дальнейшей минимизации воздействия воздуха, используйте каждый буфер трансфекции аликвота для максимум двух transfections. Наконец начиная с температуры воздействия рН, важно, что буфер трансфекции является достижение равновесного уровня для RT для Ассамблеи трансфекции комплексов. Он посоветовал не теплый трансфекции буфера до 37 ° C.

Пассированый из iPSCs:

Хотя многие ранее опубликованные протоколы рекомендуют сбор индивидуальных iPSC колоний в конце перепрограммирования, это может быть трудно добиться при очень высокой эффективности перепрограммирования или если колоний кластера вместе, как это часто бывает в нашей Протокол. Поэтому если iPSC колонии находятся в непосредственной близости друг к другу, мы рекомендуем сначала пассированый клетки разложить перепрограммировать iPSCs до вручную комплектации колоний. Существует несколько преимуществ для выполнения этого шага раннего проход. Разводя колонии дает им больше возможностей для роста, приносит гораздо больше колоний для комплектации, чем в противном случае может быть достигнуто в оригинальной хорошо. Это значительно повышает уровень успеха в создании iPSC линии от взял клон. Мы также считаем, что время дополнительные культуры фибробластов, хотя и в соотношении разбавленным, представляется улучшить среднее качество взял iPSC колоний. Неполно перепрограммировать фибробласты могут предоставлять поддержку паракринными факторов, которые продолжают помогать устанавливать iPSCs и облегчить прямой переход в условиях культуры фидер свободных клеток. Фибробласты случайно имеют недостаток селективный рост по сравнению с iPSCs когда культивировали в mTeSR1. Таким образом загрязняющих популяции клеток фиброцита быстро разбавляют до незначительное количество в течение 3 – 4 ходов.

РОК ингибиторы, такие как Y-27632 часто используются для повседневной культуры человека iPSCs. Мы нашли, что частые и/или расширенной культуры некоторых iPSC линий с Y-27632 может иметь пагубное влияние на общее качество. При использовании комок пассированый метод, таких как с ЭДТА, Y-27632 не является необходимым для поддержания жизнеспособности iPSC после разделения. Мы полностью исключили дополняя СМИ для всех iPSC изоляции, расширения или повседневной культуры с Y-27632.

Протокол ограничения:

Одно ограничение для перепрограммирования описан подход, основанный на РНК является первоначальной стоимости и сложности, связанные с подготовкой перепрограммирования реагентов. Хотя подготовительные процедуры для создания мРНК реагенты являются все обычные и были ранее описанных (ПЦР, в vitro транскрипция DNase, укупорка, дефосфорилирование, лечение очистки), совокупно производство мРНК реагентов является относительно длительный и нетривиальные процесс. Другой серьезной проблемой в этот протокол является необходимость transfect клетки каждые 48 ч, увеличивая интенсивность труда перепрограммирования протокола. Эти соображения могут быть непомерно высокими, если перепрограммирования лишь несколько образцов пациента. Однако если главным соображением является поколения клинически значимых iPSCs или очень высокой эффективности перепрограммирования, описанных перепрограммирования подход, основанный на РНК является идеальным.

В целом описанных высокой эффективности на базе РНК перепрограммирования метод зависит эффективность оптимизированного трансфекции соматической клетки типа чтобы перепрограммировать как описано в нашей предыдущей публикации8. Протокол transfection РНК, представленные в настоящем исследовании высоко настраивается для первичного фибробластов, но потенциально могут быть адаптированы для других типов клеток, повышения перепрограммирования эффективности различных соматических клеток.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

И.к. г.б., Сопредседатель изобретателей на патент под названием «Методы и композиции для перепрограммирования клетки», приложение № РСТ PCT/US2016/063258.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признательны за финансовую поддержку от национальных институтов здравоохранения (T32AR007411-33) и центр основных исследований Университета Колорадо кожи заболеваний (P30AR057212). Мы также благодарим буллозного эпидермолиза (EB) исследования партнерства, EB медицинский исследовательский фонд, Cure EB благотворительности, дистрофические буллозного эпидермолиза исследований ассоциации (Дебра) Международная, Фонд короля Бодуина Vlinderkindje фонд и ворота Фонд границ.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Plasmid шаблоны для PCR
pcDNA3.3_KLF4Addgene26815
pcDNA3.3_SOX2Addgene26817
pcDNA3.3_c-MYCAddgene26818
pcDNA3.3_LIN28AAddgene26819
pCR-Blunt_hM3OAddgene112638
pCR-Blunt_hNANOGAddgene112639
pCR-Blunt_mWasabiAddgene112640
Modified mRNA in vitro транскрипция и miРНК mimics
Forward PrimerIntegrated DNA TechnologiesTTGGACCCTCGTACAGAAGC
TAATACG
Reverse Праймер (заказывается в виде ультрамера, в масштабе 4 нмоль)Integrated DNA Technologiesbr/> TTTTTTTTTTTTTTTTТТТТТТТТТТТТ
TTTTTTTTTTТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ
TTTTTTTTTTTTТТТТТТТТТТТТТТ
TTTTTTTTTTTTТТТТТТТТТТТТТТТТ
CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA
AAGACCA
ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G New England BiolabsS1411S
Pfu Ultra II Hotstart 2x Master MixAgilent600850-51
5-метилцитидин-5'-трифосфатTrilink BiotechnologiesN-1014
Антарктическая фосфатазаNew England BiolabsM0289L
DNase INEBM0303S
MEGAscript T7 Набор длятранскрипцииThermoFisher ScientificAM1334
Псевдоуридин-5'-трифосфатTrilink BiotechnologiesN-1019
Ингибитор РНКазы РибогавардЛюцигенRG90910K
РНК Clean & КонцентраторZymoResearchR1019
Syn-has-miR-302a-3p miScript miRNA MimicQiagenMSY0000684
Syn-has-miR-302b-3p miScript miRNA MimicQiagenMSY0000715
Syn-has-miR-302c-3p miScript miRNA MimicQiagenMSY0000717
Syn-has-miR-302d-3p miScript miRNA MimicQiagenMSY0000718
Syn-has-miR-367-3p miScript miРНК имитируетQiagenMSY0000719
воде (без нуклеазы, не обрабатывается DEPC)FisherAM9937Использование для разбавления модифицированных мРНК и мимики микроРНК
<сильная>Культура фибробластов и перепрограммирование
0,1% желатина в технологиях H2OStemCell#07903
Стерильная вакуумная фильтрационная система Stericup-GVEMD MilliporeSCGVU05REИспользуется для стерилизации трансфекционного буфера и 0,5 мМ ЭДТА в DPBS
2-меркаптоэтанолThermoFisher Scientific21985023
6-луночные планшеты (обработанные культурой тканей)Corning3516
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320033
плода крупного рогатого скота СывороткаFisher26-140-079
FGF BasicThermoFisher Scientificphg0263
Добавка GlutaMaxThermoFisher Scientific35050061Добавка с глютамином используется для подготовки среды
Термоинактивированная FBSGibco Technologies10438026
замена сыворотки KnockOutThermoFisher Scientific10828010
Реагент для трансфекции Lipofectamine RNAiMAXThermoFisher Scientific13778500Протокол оптимизирован для реагента для трансфекции Lipofectamine RNAiMax
MEMThermoFisher Scientific11095080
MEM Заменимые аминокислотыThermoFisher Scientific11140050
Opti-MEM I Сниженная сыворотка MediumThermoFisher Scientific31985070Среда с пониженным содержанием сыворотки, использовать для приготовления буфера для трансфекции, регулируя pH до 8,2, 500 мл
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermoFisher Scientific31985062Среда с пониженным содержанием сыворотки, использовать для приготовления буфера для трансфекции, регулируя pH до 8,2, 100 мл
10 М NaOHSigma-Aldrich72068Приготовить 1 М раствор, разбавляя в воде, не содержащей нуклеаз, и использовать для регулировки
pH.Вода (не содержит нуклеаз, не обработана DEPC)FisherAM9932 Используйте для разбавления NaOH и промывки рН-метром
Pen/Strep/FungizoneGE HealthcareSV30079.01
rhLaminin-521ThermoFisher ScientificA29248Поставляется в концентрации 100 &микро; г/мл, использование в качестве матрицы для процедуры перепрограммирования
фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS)Life Technologies14190144
Трипсин-ЭДТА 0,25% фенола RedLife Technologies2520056
вирус коровьей оспы B18R (CF)ThermoFisher Scientific34-8185-86
iPSC culture
Corning Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning354277Внеклеточный матрикс (ECM) для культивирования iPSCs
EDTA, 0,5 М стоковый растворK& D Medical RGF-3130Разбавить до 0,5 мМ в DPBS, стерилизовать фильтр и использовать для пропускания iPSC
mTeSR1StemCell Technologies85850Среда плюрипотентных стволовых клеток (PSC), обеспечивает преимущество роста iPSCs по сравнению с фибробластами
<сильные>антитела и обнаружение
Rabbit anti Mouse (HRP conjugated)Abcamab97046
Tra-1-60 (мышиный анти человек)Stemgent09-0010
Перекись водорода (30%)LabChemLC154301Разбавить до 3% с
PBS Бычьего сывороточного альбумина (BSA)FisherBP9703100
Фосфатно-буферный салин (PBS) HycloneSH30258.02Поставляется в 10 раз, разбавлен до 1x
VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate KitVector LaboratoriesSK-4800
Special Equipment<
strong>DescriptionNotes
Бокс
для культуры увлажненных тканейОткалибруйте CO2 с помощью цифрового измерителя, fyrite или эквивалента. Уравновесьте инкубатор до 5% CO2, 37 °C.
Тригазовый инкубатор для увлажненныхОткалибруйте CO2 с помощью цифрового измерителя, fyrite или эквивалента. Уравновесьте инкубатор до 5% CO2, 5% O2, 37 °C. Используйте для процедуры перепрограммирования.
pH-метрдолжен иметь разрешение с точностью до двух знаков после запятой. По возможности обозначается работа с РНК.
Инвертированный микроскопМикроскоп сконфигурирован для визуализации EGFP для мониторинга эффективности трансфекции.
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTТТТТТТТТТТ<( помощью биологической безопасностиОбычный инкубатор тканей

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
  4. Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1. Science. 302 (5644), 415-419 (2003).
  5. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  6. Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency. Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).
  7. Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
  8. Kogut, I., et al. High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  9. Hirai, H., et al. Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD. Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).
  10. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  11. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. , e51943(2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

367 302pHTRA 1 60

Похожие статьи