Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Листерий Инфекция мозга

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58723

⸱

2 октября 2018 г.

 , 
1Department of Microbiology and Immunobiology, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Во время инфекции Listeria monocytogenes способна пересечения blood - brain барьер колонизировать мозга. В этом протоколе мы продемонстрируем оценить бактериальной колонизации органов после инфицирования мышей. Предусмотрена процедура для выполнения весь орган перфузии для конкретного определения бактериальной чисел в паренхиме мозга.

Аннотация

Листерий является внутриклеточных бактериальных патогенов, который часто ассоциируется с пищевыми инфекции. L. моноцитогенес возможность пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) относительно как это может привести к жизни менингит и энцефалит. BBB защищает мозг микроокружения от различных токсических метаболитов и патогенных микробов в крови после инфекции и поэтому поддерживает гомеостаза головного мозга. Механизмы, которыми л моноцитогенес в кровь Креста BBB, чтобы вызвать мозг инфекции полностью не поняты и есть также отсутствие системы надежную модель для изучения мозга инфекций л моноцитогенес. Здесь мы представляем простой мыши инфекции модель для определения ли бактерии пересекли BBB и quantitate бремя бактерий, которые колонизировали мозга в естественных условиях. В этом методе животные были инфицированы внутривенно с L. моноцитогенес и были гуманно euthanized под воздействием CO2 следуют шейки матки дислокации. Сердца перфузии животных была выполнена до уборки инфицированных органов. Кровь была собрана до перфузии и количество бактерий на орган или мл крови определяется покрытие разведениях крови или орган гомогенатах на плитах агара и подсчитывать количество колоний сформирован. Этот метод может использоваться для изучения взаимодействия Роман рецептор лиганд, которые повышают инфекции мозга, L. моноцитогенес и может быть легко адаптирована для изучения нескольких бактериальных патогенов.

Введение

Грамположительные бактерии листерий является факультативной внутриклеточных патогенов и один из наиболее смертоносных пищевых патогенов во всем мире. Проглатывание л моноцитогенес загрязненных продуктов питания может привести к листериоз в организме человека, тяжелой инвазивное заболевание ориентации основном беременных женщин, новорожденных, пожилым и ослабленным иммунитетом лица1. L. моноцитогенес является одной из ведущих причин смерти в результате пищевого патогена в США и летальности от листериоз достигает 20 – 30%, самый высокий для всех пищевых патогенов2. Для л моноцитогенес в настоящее время существует нет вакцины и способность бактерий, эффективно распространяться в дистальной органов и мозг через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) может привести к жизни менингит и колонизации мозга3 , 4 , 5 , 6. Бактериальный менингит обычно суров; Хотя большинство людей, которые получают лечение выздоравливают, инфекции может вызвать серьезные осложнения, например, повреждения головного мозга, потеря слуха или обучения инвалидов в детей. L. моноцитогенес прогнозам, приходится менее 10% всех сообщества приобрели менингита в США7.

Основным маршрутом для бактериального распространения мозга и мозговых оболочек — через кровь. Бактерии, циркулирующих в кровеносных сосудов в мозге могут пересекать BBB вызывают инфекции головного мозга. BBB является системой весьма васкуляризированной барьер, защищающий мозг от посторонних частиц, циркулирующих в крови. Эндотелиальные клетки образуют слой, что линии внутренней поверхности кровеносных сосудов8,9. В дополнение к л monocytogenesнесколько бактериальных патогенов, таких как Neisseria meningitidis, пневмококк, кишечная палочкаи Haemophilus influenzae типа b (Hib) способны колонизации мозг, перейдя в BBB3,4,5,6. Однако при изучении бактериальной нагрузки в головном мозге зараженных мышей, важно определить ли бактерии пересекли BBB, в противном случае бактериальной нагрузки в головном мозге может представлять бактерий, которые все еще находятся в кровеносных сосудов мозга. Таким образом это необходимо для perfuse мышей всех крови до определения формирования колонии единиц (CFU) гомогенатах мозга.

В этом исследовании мы описываем в vivo методы для изучения л моноцитогенес инфекции мозга. Для методов, описанных здесь мы использовали л моноцитогенес штамм 10403S. L. моноцитогенес 10403S является одним из наиболее широко используемых лабораторных штаммов для изучения системных листериоз в мышиной модели инфекции10. Этот протокол основан на стандартных внутривенным введением л моноцитогенес следуют перфузии мышей. Схематический план инфекции протокола в мышах показано на рисунке 1. L. monocytogenes-инфицированных мозги и других органов от-увлажненную или перфузии мышей были собраны и бремя бактериальных органа определяется. Эти методы являются полезными для определения не только общей бактериальной колонизации мозга в зараженных животных, но также являются полезными для определения, является ли бактерии проникли BBB в vivo посредником вторжения головного мозга. Важно подчеркнуть, что этот протокол лаборатория должна проводиться после консультаций с руководством Фонда соответствующих институциональных биобезопасности Комитета и животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные должны быть сохранены и обработаны с максимальной осторожностью, чтобы свести к минимуму дискомфорт во время процедуры. Процедура должна проводиться в соответствии с использование Комитета и институциональный уход животных и все федеральные, государственные и местные законы. Также, обратите внимание, что лабораторные эксперименты должны проводиться в соответствии с принципами 2-го уровня биобезопасности.

1. рост L. моноцитогенес мыши инфекции исследований

  1. Автоклав 500 мл среднего мозга сердце инфузии (BHI) агар в колбу Эрленмейера 1 Л подготовить твердых СМИ пластины. Разрешить СМИ для охлаждения в водяной бане 56 ° C и затем добавить стрептомицина в конечной концентрации 100 мкг/мл.
    1. Налейте в Петри пластины 25 мл СМИ/Петри. Разрешить пластины высохнуть при комнатной температуре (22 oC-25 ° C). При необходимости, пластины можно сушить при 37 ° C, пока не высохнет.
  2. С помощью стерильных пересевать цикла и асептической техники, получить полный цикл из замороженных л моноцитогенес штамм 10403S11,12 из фонда культуры, замороженных в BHI медиа плюс 30% глицерина и поддерживать в морозильной камере-80 ° С.
    1. Полоска моноцитогенес л на BHI агар/стрептомицина пластины, таким образом, что один бактериальных колоний могут быть изолированы. Поместите пластины в инкубатор 37 ° C ночь (18 h до 24 ч) расти л моноцитогенес колоний.
    2. С помощью стерильных пересевать цикла, выбрать единый л моноцитогенес колонии от BHI агар пластины и прививать колонии в стерильные пробирки, содержащие 5 мл бульона BHI, содержащие 100 мкг/мл стрептомицина.
  3. Инкубируйте л моноцитогенес культуры трубки слегка наклонена на 30 ° ночь в статической инкубатора.
    1. Следующий день, осмотрите л моноцитогенес культуры для роста (BHI СМИ будет мутная) и вихревой кратко для обеспечения единообразного подвеска культуры.
    2. Асептически удалить 1 мл Алиготе бактериальной культуры и измеряют оптическую плотность на 600 Нм (600OD) с помощью спектрофотометра.
      Примечание: Стерильные BHI отвар используется как бланк для спектрофотометр чтения перед началом измерения оптической плотности л моноцитогенес культуры. L. моноцитогенес культуры также может быть разбавлен (два на пять раз) в BHI перед чтением оптической плотности.
    3. Определите количество л моноцитогенес колонии формируя единиц (CFU) мл BHI культуры, покрытие десятикратного серийных разведений культуры. Это позволяет установить связь между оптической плотности л моноцитогенес культуры и количество бактерий / мл культуры. В общем ОД600 1.0 л моноцитогенес культуры равняется примерно 1 х 109 CFU бактерий / мл.

2. Подготовка л моноцитогенес инфекции мышей

  1. Восемнадцати до двадцати четырех часов до животных инфекции, расти культур л моноцитогенес в BHI бульон, содержащий 100 мкг/мл стрептомицина и определить ОД600/ ~ кое / мл, как указано в шаге 1.
    Примечание: Мыши обычно упорядочиваются одну неделю до начала инфекции и акклиматизации животных фонда перед инфекцией, выполненных исследований. В этом исследовании 6 – 8 недель старых самок мышей BALB/c (5 мышей каждой группы) были размещены в среде барьер в объекте животных сдерживания Гарвардской медицинской школы BSL2-уровень и поставки продовольствия и воды ad libitum.
  2. Определить количество л моноцитогенес культуры требуется заразить каждой мыши, основанный на ~ кое / мл бактериальной культуры. Сделать разрежения в стерильных фосфат амортизированное физиологический рН 7,2 л моноцитогенес культуры (PBS) для соответствующей концентрации бактерий. Мышь обычно инфицированы внутривенно 200 мкл PBS, содержащие 1 – 2 × 104 CFU бактерий/животного.
  3. Проверьте количество л моноцитогенес в посевным материалом, покрытие десятикратного серийных разведений на плиты агара BHI, содержащие 100 мкг/мл стрептомицина. Инкубируйте пластины в 37 ° C инкубатор на ночь, чтобы определить количество л моноцитогенес прививанные на мыши следующим:
    Посевным материалом (CFU) = (количество колоний x коэффициент разрежения) / мл покрытием x объем (мл) вводят

3. заражение мышей с L. моноцитогенес через внутривенные инъекции Вену хвост

  1. Снимите крышку и продовольствия бункеров из клетки, содержащие мышей и поместить клетку под лампой инфракрасного тепла 250 W за 5 мин.
    Примечание: Этот метод позволяет хвост вен разбавить, обеспечение легче выполнять инъекции.
    1. Осторожно поместите животное в соответствующего размера мыши, сдерживающих устройства безопасно удержать животное во время инъекции Вену хвост.
  2. Смешать л моноцитогенес посевным материалом (шаг 2.2) и загрузить посевным материалом в 1 мл шприц с иглой 26 G.
  3. Найдите Вену боковой хвост мыши и очистить место инъекции спиртом салфеткой или спрей этанол 75%.
  4. Аккуратно придать мышь с 200 мкл подвески л моноцитогенес в Вену боковой хвост с помощью шприца с иглой 26 G.
    1. Используйте хлопчатобумажной марли кратко давление на месте инъекции, чтобы остановить любое кровотечение и поместите животное в новой клетке.
      Примечание: Выполните этот процесс для всех мышей, чтобы быть введены и Марк клетка с соответствующих меток. Чтобы определить концентрацию посевным материалом моноцитогенес л впрыск, повторите шаг 2.3, используя оставшееся количество посевным материалом. Внутривенно л моноцитогенес инфекции посевным материалом на мышь сообщается как средняя CFU измеряется от образцов предварительная и впрыск посевным материалом.
  5. Ежедневно контролировать зараженных животных и отметить каких-либо явных признаков болезни (например, трепал меха, Сгорбленная осанка, вялым движением, потеря веса). Удаление животных, которые могут быть значительно умирающий до 72 ч после инфекции (например, 24, 48 часов после заражения) от исследования и гуманно жертву. Далее, ежедневный мониторинг до тех пор, пока все оставшиеся животных приносятся в жертву на 72 ч после инфекции.
    Примечание: 50% летальной дозы (LD50) для штамма 10403S L. моноцитогенес в мышей BALB/c является ~ 1 – 2 х 104 CFU/животное. Мышей, инфицированных LD50 доз л моноцитогенес используя этот протокол может проявлять признаки болезни, как указано выше, и следователи могли ожидать мышей, чтобы начать изнемогать к инфекции после 72 ч после инфицирования.

4. Вскрытие и сердечной перфузии мышей, инфицированных с моноцитогенес л

  1. На 72 ч после инфекции (или в точке ранее желаемое время) усыпить зараженных мышей с использованием протокола, одобренного Комитетом институциональных животных этики, например CO2 удушение следуют шейки матки дислокации.
    Примечание: Если сбор крови должны быть выполнены, свести к минимуму разрыв кровеносных сосудов при выполнении шейки матки дислокации.
    1. Подтвердите, что мышей были умерщвлены отсутствие ответа лапы дергаться.
      Примечание: Если сердца перфузии должны быть выполнены, установите систему автоматизированной насос/перфузии при скорости потока тома 4 мл/мин.
  2. Поместите животное на его обратно в кастрюлю диссекции и применять 75% этанола на поверхности брюшной мех/кожа.
  3. С помощью ножниц, делают разрез в брюшной стенке и расширить надрез чуть ниже грудной клетки.
  4. Разоблачить диафрагмы и висцеральных органов.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы не разрывают любых внутренних органов.
  5. Откройте грудной полости, сокращения диафрагмы и разрезать грудную клетку на двусторонней основе подвергать левого желудочка сердца.
  6. Использование тупой щипцы, нежно обхвати сердца и вставка бабочка иглой 21 G подключен к системе перфузии в левый желудочек и затем осторожно вырезать правого предсердия для сбора крови (~0.2 мл) в 2-мл пробирку, содержащую 10 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) для предотвращения свертывания крови. Схематическая диаграмма сердечных перфузии в мыши показано на рисунке 2.
    Примечание: Если перфузии не будет выполняться, кровь может собирать сердца прокол, используя шприц 1 мл и быстро переведены в 2-мл пробирку, содержащую 10 мм ЭДТА для предотвращения свертывания крови. L. monocytogenes -инфицированных органов затем собирают как описано (шаг 5.1).
  7. Начать перфузии и perfuse животное для 4 мин с 15 – 20 мл PBS, содержащие 10 мм ЭДТА.
    Примечание: Оценки перфузии, наблюдая за кровь и решение PBS-ЭДТА, протекающей через правое предсердие и в кастрюлю, рассечение. После полного перфузии, обеспечение того, чтобы оставшиеся бактерии от собранного органов и не циркулирующей крови появится бланшированные мозг и печень.

5. орган лесозаготовок и определение бактериальной нагрузки

  1. Следующие перфузии, урожай органов (например, печень, селезенка), тщательно удалив любые сосудистую и связки придает и место органов отдельно в стерильных 15 мл конические трубка, содержащая 5 мл стерильного холодного (4 ° C) PBS. Хранить образцы на льду, до тех пор, пока дальнейшая обработка происходит.
  2. Урожай мозга, обезглавить головы, за ушами, используя ножницы и вырезать кожи головы in-between животного глаз вниз по средней линии. При необходимости, обрежьте излишки ткани, сохраняя ножницы, прижавшись черепа.
    1. Аккуратно вставьте один подсказки ножниц в затылочного (отверстие в основании черепа, через который проходит спинного мозга) и нарезать сбоку черепа с обеих сторон.
    2. Аккуратно вырежьте черепа in-between грызунов глаза вниз по средней линии, будучи уверенным применить боковое давление. Избегайте возмущений мозга и поддерживать минимальный контакт между мозговой ткани и ножницы.
    3. Откройте с помощью штрафа отзыв щипцы, черепа, чтобы разоблачить мозга и место шпателем между нижней части мозга и основания черепа, чтобы удалить мозга.
      Примечание: Это приводит к разрывам мозга нервных волокон.
    4. Тщательно переводить мозг 15 мл конические трубка, содержащая 5 мл стерильного холодного PBS.
    5. Отменить мыши тушу и повторите эти действия для остальных животных.
      Примечание: После того, как были собраны все органы, очистить процедуры области и подготовить для гомогенизации орган для определения бактериальной нагрузки.
  3. Чистить и стерилизовать кончик ткани гомогенизатор, помещены в биобезопасности кабинета, вставив наконечник и запустив гомогенизатор для 10 s последовательно в 5% отбеливателя, стерильная вода, 75% этанола, стерильную воду, содержащуюся в отдельный 15 мл Конические трубки.
  4. Однородный зараженных мозга (~ 20 s на установке 6, максимальные обороты) в 15 мл Конические трубки до тех пор, пока остаются без видимых ткани фрагменты.
    1. Очистить гомогенизатор как описано в шаге 5.3 для предотвращения бактериального переносятся загрязнения на следующий образец орган.
    2. Выполните процесс гомогенизации для всех других органов (например, печень, селезенка).
    3. После завершения процесса гомогенизации, очистите гомогенизатор, как описано в шаге 5.3 и хранить до дальнейшего использования.
  5. Подготовить десятикратного серийных разведений гомогенатах орган в стерильных PBS и тарелка разведений на плитах агара/стрептомицина BHI определить кое за орган.
    Примечание: Аналогичный метод выполняется для определения кое / мл крови.
    1. После того, как покрытие всех разведениях, передать пластины инкубатора 37 ° C на ночь.
    2. Следующий день, подсчитать количество колоний на каждой пластине, чтобы определить общее количество бактерий на орган или мл крови следующим:
      CFU/орган = (количество колоний x коэффициент разрежения) / мл огневки покрытием x 5
      КОЕ/мл крови = (количество колоний x коэффициент разрежения) / мл крови покрытием

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мозг очень васкуляризированной и L. моноцитогенес известен заразить типы клеток в крови3,13. Описывается протокол используется для демонстрации способности л моноцитогенес пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) приводит к инфекции мозга мышей. Чтобы определить, если бактерии пересекли BBB в естественных условиях, перфузии крови в мыши выполняется до определения бактериальной нагрузки в головном мозге...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

L. monocytogenes способна вызвать менингоэнцефалит, угрожающих жизни людей. Предыдущие исследования показали способность бактерий пересечь blood-brain барьер (BBB) и колонизировать мозга. Были предложены три маршрута мозга вторжения во время инфекции: прямое проникновение BBB бактериями, стелс транспорта бактерии, содержащиеся внутри мононуклеарных клеток3и аксональной миграции л моноцитогенес штаммов, которые вызывают rhombencephalitis15. Поскольку мозг о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения США Грант AI103806 от национальных институтов здоровья.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инфузия сердца для мозгаБектон Дикинсон237200
Стрептомицина сульфат Amresco0382-50G Чашки
ПетриVWR25384-342
ГлицеринVWR97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Базовый гомогенизаторIKA3352109Модель: T18BS1
СпектрофотометрBeckman CoulterDU 800 серия
BALB/c мышиJackson LaboratoryModel #000651
Шприцы 1 млБектон Дикинсон309659
26 г иглыБектон Дикинсон305115
21 г иглы бабочкиБектон Дикинсон367281
этилендиаминтетрауксусная кислота;Sigma-Aldrich60004
15 мл конические пробиркиVWR21008-918
Пробирки с круглым дномVWR60819-546
Фосфатно-солевой буфер Corning46-013-CM
Шпатель из нержавеющей сталиVWR82027-520
Ножницы из нержавеющей стали (6,5 дюйма)VWR82027-592
Ножницы из нержавеющей стали (4,5 дюйма)VWR82027-578
Тупые щипцы из нержавеющей стали  (4.5 дюйм)VWR82027-440
Щипцы с тонким наконечником из нержавеющей стали  (6 дюймов)ВВР82027-406

Ссылки

  1. Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
  2. de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
  3. Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
  4. Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
  5. Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
  6. Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
  7. Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
  8. Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
  9. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).
  10. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  11. Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
  12. Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
  13. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  14. Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
  15. Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
  16. Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

PBS EDTA
Листерий Инфекция мозга
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.