Методическая статья

Протеомного анализа человека макрофагов поляризации в среде с низким содержанием кислорода

DOI:

10.3791/58727

⸱

7 января 2019 г.

 ,  , 
1Team Mechanobiology, Immunity and Cancer, Institute for Advanced Biosciences, INSERM U1209, CNRS UMR5309, 2Université Grenoble Alpes, 3Pôle Recherche, Centre Hospitalier Universitaire des Alpes

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол для получения подписи proteomic человека макрофагов и применить это к определению влияния среды низким содержанием кислорода на макрофагов поляризации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макрофаги являются врожденные иммунные клетки, участвует в ряде физиологических функций, начиная от ответов на инфекционных возбудителей ткани гомеостаза. Различные функции этих клеток связаны с их активации государств, которая также называется поляризации. Молекулярные точное описание этих различных поляризациях является одной из приоритетных задач в области биологии макрофагов. В настоящее время признается, что многоаспектный подход необходимо описать как поляризации контролируется экологические сигналы. В настоящем докладе мы описываем протокол, разработанный для получения proteomic подписания различных поляризациях в человека макрофагов. Этот протокол основан на лейбл свободный количественной оценки экспрессии белков макрофагов, полученные из геля фракционированный и Lys C/трипсина переваривается лизис клеточных содержание. Мы также предоставляем протокол, основанный на пищеварение-решение и изоэлектрического, сосредоточив внимание фракционирование для использования в качестве альтернативы. Поскольку концентрация кислорода соответствующих экологических параметров в тканях, мы используем этот протокол для изучения состава как атмосферы или среде с низким содержанием кислорода влияет на классификации макрофагов поляризации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макрофаги являются врожденные иммунные клетки участвуют в осуществлении ряда физиологических функций, начиная от ответов на инфекционных возбудителей ткани гомеостаза, включая вывоз apoptotic клеток и реорганизацию внеклеточная матрица1. Эти клетки характеризуются сильной фенотипические пластичности2 , который переводит на многие государства возможности активации, которые также называются поляризаций. Молекулярные точное описание этих различных поляризациях является одной из приоритетных задач в области биологии макрофагов3. Было предложено классифицировать эти поляризаций, используя так называемые дихотомия М1/м2, в котором M1 представляет провоспалительных и м2 представляет противовоспалительное макрофагов. Эта модель хорошо вписывается в различных патологических ситуациях как острые инфекции, аллергии и ожирение4. Однако в хронически воспаленных тканей и рака, было продемонстрировано, что эта классификация не в состоянии понять широкий репертуар фенотипические, что макрофаги в некоторых сотовых средах5,6, 7. Нынешний консенсус является что макрофагов поляризации лучше описывается использование многомерной модели для интеграции конкретных сигналов microenvironmental8. Этот вывод был подтвержден путем анализа транскриптомики человека макрофагов, показывая, что модель М1/м2 является неэффективным в описании полученные поляризаций9.

Это исследование представлено призвана обеспечить протокол для получения proteomic подписи различных поляризациях в человека макрофагов. Мы опишем, как отличить человека макрофагов в средах различных уровней кислорода и получать пептиды от всей макрофагов протеома выполнить количественную оценку лейбл бесплатно. Эта количественная оценка позволяет сравнивать уровни выражения различных белков. Как исследование стволовых клеток показал важность кислорода в качестве экологического параметра key10, мы стремимся понять, как этот параметр ткани может повлиять макрофагов поляризации в организме человека. Парциальное давление кислорода было установлено в диапазоне от 3 до 20% (общее атмосферное давление) в человеческом теле, где 20% примерно соответствует то, что обычно используется в инкубатор культуры клеток (точное значение составляет 18,6% принимая присутствие воды во внимание).

Предыдущие работы показал, что альвеолярные отличаются от интерстициальных макрофаги от функциональных и морфологической точки просмотров11 и что эти различия, вероятно, частично из-за различных кислорода, которым они подвергаются12. Кроме того костного мозга, полученных макрофаги показывают увеличение способность фагоцитируют бактерий при контакте с низким содержанием кислорода среды12. Противоположный эффект было найдено для THP1-продифференцировано человека макрофаги13, но эти результаты поддерживают идею, что кислород является регулятор макрофагов биологии и что это необходимо уточнить эту роль на молекулярном уровне в человека макрофагов. В предыдущем исследовании мы применили протеомики подход к решению этих вопросов. Путем измерения уровня выражения для тысяч белков одновременно, мы подчеркнул влияние кислорода на поляризации и представила список новых молекулярных маркеров. Мы также смогли увязать эти результаты некоторых функций макрофагов. В частности мы обнаружили, что уровень фагоцитоз apoptotic клеток был увеличен в IL4/IL13-поляризованных макрофагов, который был связан с upregulation ALOX15, как свидетельствуют протеомного анализа14. В настоящем исследовании мы опишем, как для выполнения такого анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы крови человека (LRSC) от здоровых, обезличенных доноров были получены из EFS (Французская Национальная служба крови) как часть протокола уполномоченным (CODECOH DC-2018 – 3114). Доноры дали подписанного согласия для использования крови.

1. средства массовой информации и подготовка буфера

  1. Подготовка среднего макрофагов [RPMI glutamax + 10 мм HEPES + 1 x несущественные аминокислот (NEAA)] и нагреть его до 37 ° C.
  2. Подготовить макрофагов средний + 10% человеческой сыворотки от AB плазмы (НКС), фильтр (0.22 мкм фильтром), затем нагреть его до 37 ° C (именуемые макрофагов средний + 10% SAB далее).
  3. Подготовить буфере сортировки [1 x-фосфатный буфер (PBS) + 0,5%, бычьим сывороточным альбумином (БСА) + 2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)], фильтр (0.22 мкм фильтром) и поддерживать его на 4 ° C.

2. изоляция мононуклеаров периферической крови (получения) от Leukoreduction системы камеры (LRSC)

  1. 15 мл плотности градиента клетки разделения раствора (см. Таблицу материалы) в 50 мл центрифугирования пробки, так что он может нагреться до комнатной температуры (RT) до получения LRSC.
    Примечание: Плотность зависит от температуры. Как этот продукт хранится при температуре 4 ° C, этот шаг должно быть сделано заранее, так что он может сбалансировать для RT.
  2. Пустой LRSC в 50 мл трубки центрифугирования, добавить 50 мл ПБС и перемешать. Очень медленно добавьте 25 мл смеси подготовлен на шаге 2.2 поверх 15 мл градиентного раствора плотностью разогревается во время шага 2.1.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы не смешивать фаз во время этого шага. Крови должны быть добавлены на плотность градиента решение без каких-либо нарушений этого этапа.
  3. Центрифуга для обеих трубок центрифугирования для 25 мин на 700 x g без перерывов.
    Примечание: В конце плотность градиентного центрифугирования, являются слои от дна к верхней части: гранулоцитов формирование гранул, плотность градиента решение фазы, слой репликацию, и плазмы и эритроцитов.
  4. Пипетки проходят через этап плазмы без аспирационных его и собирать КСДОР слой в новой центрифугирования Тюбик 50 мл. Добавьте до 50 мл 1 x PBS для получения как стиральная шаг и центрифуги для 10 мин на 300 x g.
  5. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 40 мл среды макрофагов.

3. магнитные маркировки и изоляции CD14+ клеток (моноциты)

  1. Граф репликацию в камере Malassez. Вывести количество получения необходимых для проведения эксперимента (обычно 100-300 x 106 клеток), поместите их в трубку центрифугирования и центрифуги для 10 мин на 300 x g.
  2. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 80 мкл буфере сортировки, подготовленные во время шага 1.3 за 107 получения. добавить 20 мкл CD14 микрошарики на 107 получения. микс Ну и Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C под постоянным агитации.
  3. Добавьте 1 mL сортировки буфера за 107 получения как стиральная шаг и центрифуги для 10 мин на 300 x g. аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл сортировки буфера за 108 репликацию.
  4. Место в магнитном поле разделителя столбца. Подготовьте столбце промыв его с 3 мл сортировки буфера.
  5. Примените суспензию клеток на столбец. Столбце зависит количество клеток быть изолированы (здесь, используются столбцы LS для получения до 109 ). Собирайте потока через содержащих немеченого клетки.
    Примечание: Начиная с этого шага, все трубы (положительные и отрицательные параметры) хранятся позднее проверки различных этапов проточной цитометрии.
  6. Промойте колонку с 3 x 3 мл сортировки буфера. Соберите немеченого клетки, проходя через же трубку от шага 3.12. Выполните Стиральная путем добавления сортировки буфера, будьте осторожны, чтобы не высушить ваши колонки. Место сбора трубку в столбце и удалить его из сепаратора.
  7. Пипетка 5 мл сортировки буфера в столбце. Немедленно промойте магнитно помечены клетки, твердо толкает поршень в столбце. Для повышения чистоты CD14+ клетки, eluted фракция обогащается на второй столбец.
  8. Повторите шаги с 3,4 до 3,7 с новым столбцом.

4. обшивка моноциты

  1. Граф моноцитов в камере Malassez. Проверить чистоту CD14+ клеток путем проточной цитометрии. Вывести количество моноцитов, необходимого для выполнения эксперимента и поместите их в трубу центрифугирования.
  2. Центрифуга для 10 мин на 300 x g. аспирата супернатант и Ресуспензируйте Моноцит Пелле в среде макрофагов. Пластина клетки и пусть они поселиться за 50 мин до 1 ч. аспирационная среднего и заменить его с макрофагов средний + 10% SAB + 25 нг/мл макрофагальный колонии стимулирующий фактор (M-CSF) чтобы побудить дифференциации.

5. поляризация макрофагов в день 6

  1. Аспирационная среды. Замените его макрофагов средний + 10% САБ с различных раздражителей. Например добавьте 10 нг/мл интерферона гамма (INFγ) + 1 нг/мл липополисахарида (LPS) для получения M1 поляризации, или 20 нг/мл интерлейкинов 4 (IL4) + 20 нг/мл интерлейкинов 13 (IL13) для поляризации м2.
    Примечание: Стимуляция может производиться между 24 и 48 часов прежде чем другие тесты.
  2. Урожай клеток с использованием отсоединение решения или скребок ячейки.

6. клеточной культуры в условиях низкой кислорода

  1. Начиная с шага 4, поддерживать моноцитов и затем макрофагов в контролируемой кислородом среде для выполнения анализа гипоксические состояния. Использование гипоксии рабочей станции для поддержания клеток под парциального давления кислорода желаемого во время эксперимента.
    Примечание: При работе под давлением низким содержанием кислорода, важно подготовить все средства массовой информации и стиральная буферов под станцией и ждать достаточно, чтобы получить правильный парциальное давление в жидкости. Например 10 мл PBS в 60 мм Петри блюдо требует примерно за 2 ч до 25 мм рт.ст на O2 парциальное давление, начиная от атмосферного давления (как мы измеряли его с помощью волоконно оптических кислородный датчик). Во многих гипоксических станции или инкубаторы давление кислорода устанавливается в процентах от атмосферного давления. Если необходимы точные измерения, то лучше использовать станцию, разрешающие непосредственно установить давление кислорода в мм рт.ст..

7. lysis и в гель пищеварения (протокол 1)

Примечание: В этом и следующих разделах описаны два протоколы, используемые для получения пептидов и выполнять анализ LC-MS/MS. Протокол 1 описывает лизис клетки и в гель фракционирования и пищеварение, а протокол 2 лизис клеток в решение, следуют в решение пищеварение и фракционирования, используя метод изоэлектрической фокусировки.

  1. Выполните лизис клеток в буфер Лэмли [234 мм трис-HCL (рН 6,8), 7,5% SDS, 37% глицерина, 33,3% (v/v) β-меркаптоэтанол, бромфеноловый синий 0,2% w/v]. Загрузите белка эквивалент 300 000 клеток для каждого образца, на 4-12% бис трис акриламида гели.
  2. Контролировать время электрофорезного миграции разрешить каждый образец протеина разделить на 6 гель полос, как проявляется в рисунке 3.
  3. Исправить гель с раствором крепления (30% этанола + 7,5% уксусной кислоты для 20 мин), а затем добавьте окрашивание раствора (R-250 Кумасси синий для 45 мин). Destaining решение (30% этанола + 7,5% уксусной, пока не появятся полосы) добавить до иссечения белка полосы с чистой скальпель.
  4. Кости каждый обрезанию группы до введения в 500 мкл трубы. Чистую стеклянную поверхность является оправданным во избежание загрязнения с кератины (5% раствор SDS в деионизированной воде может использоваться для очистки поверхностей).
  5. Вымойте ломтики гель 3 раза в 200 мкл бикарбонат аммония 25 мм для 20 минут при 37 ° C, следуют один мыть в бикарбонат аммония 25 мм и ацетонитриле (50% v/v). Обезвоживает гель куски с 200 мкл Ацетонитрил 100% за 10 мин.
  6. Инкубировать каждый кусок гель с 10 мм DTT (Дитиотреитол) в бикарбонат аммония 25 мм для 45 мин на 56 ° C (200 мкл), следуют 55 мм iodoacetamide в бикарбонат аммония 25 мм (200 мкл) 35 мин в темноте на RT.
  7. Чтобы остановить алкилирования, инкубировать каждый кусок гель с 200 мкл 10 мм DTT в бикарбонат аммония 25 мм для 10 мин на RT. мыть гель куски в 200 мкл бикарбонат аммония 25 мм, а затем обезвоживает с 200 мкл Ацетонитрил 100% за 10 мин.
  8. Переваривать белки на ночь при 37 ° C с трипсина/Lys-C смеси согласно инструкциям производителя.
  9. Распакуйте полученный пептиды из кусочков гель, добавляя 50 мкл Ацетонитрил 50% за 15 мин, затем 50 мкл 5% муравьиной кислоты 15 мин и наконец, 50 мкл Ацетонитрил 100% за 15 мин бассейн и высушите каждую долю в трубки низкого поглощения ограничить адсорбции пептидов и Образец потери. Хранение образцов-80 ° C до дальнейшего анализа.

8. белка добычу и пищеварение-решение (протокол 2)

  1. Лизис клеток (2 x 106 клеток) выполните с 150 мкл следующих литического буфера:
    1. Мочевина 7 М, 2 М тиомочевины, 40 мм трис и 4% ПАРНЕЙ, дополняют ингибиторы протеазы (полный мини, ЭДТА бесплатно ингибитор протеазы коктейль).
  2. Решения для 30 мин на RT с греющую гомогенизировать. Центрифуга в 13800 x g 20 мин RT и держать супернатант.
  3. Удаление загрязнений с 2D комплект очистки:
    1. Комплект содержит осадителя раствора, Сопредседатель осадителя раствора, буфер мыть и мыть присадок.
    2. Добавить 300 мкл осадителя раствора и хорошо перемешать. Инкубируйте на льду для 15 минут добавить 300 мкл Сопредседатель осадителя раствора. Центрифуга трубы (по крайней мере) на 12000 g x 5 мин. Малый Пелле должен быть виден. Быстро перейти к следующему шагу, чтобы избежать ресуспендирования или дисперсии гранул. Удалите супернатант не нарушая гранулы.
    3. Центрифуга трубки снова с-шпингалет и гранулы наружу довести любые оставшиеся жидкости в нижней части трубки. Краткий импульс является достаточным. Там должно быть без видимых жидкого оставшихся в трубы.
    4. Не нарушая гранулы, 40 мкл Сопредседатель осадителя раствора. Пусть трубе сидеть на льду на 5 мин центрифуги для 5 минут, затем снимите и выбросьте мыть. 25 мкл деионизированной воды. Вихревой каждой трубки для 5-10 s. Гранулы должны разогнать но не растворяются в воде.
    5. Добавьте 1 мл буфера мытья (предварительно охлажденным для по крайней мере 1 час при температуре-20 ° C) и 5 мкл мыть добавки. Вихрь, до тех пор, пока гранулы полностью рассеяны. Инкубировать трубы при-20 ° C для по крайней мере 30 минут Vortex для 20-30 s каждые 10 мин
      Примечание: Трубы может храниться при температуре-20 ° C до 1 недели с минимальным белка деградации или модификации.
    6. Центрифуга трубы (по крайней мере) на 12000 g × 5 мин тщательно удалить и удалить супернатант. Должны быть видны белые гранулы. Разрешить Пелле в airdry не более 5 минут (при слишком сухой, это будет трудно Ресуспензируйте гранулы).
  4. Ресуспензируйте Пелле белка в 300 мкл бикарбонат аммония карбамид и 0,1 М 8 М. Вихревой сильно за 1 мин определяют концентрацию протеина, с использованием колориметрического анализа.

9. решение пищеварение (протокол 2)

  1. Уменьшить мосты дисульфида, добавив 5.1 мкл 700 мм DTT водный раствор (конечная концентрация 12,5 мм) на ресуспензированы белки от шаг 8.4 и инкубировать при 37 ° C за 30 минут с греющую. Алкилата остатков цистеина, добавив 20.3 мкл 700 мм iodoacetamide водный раствор (конечная концентрация 40 мм) и инкубации при 25° C на 30 мин в темноте с греющую.
  2. 990 мкл бикарбонат аммония 0,1 М, к образцу. Добавьте соответствующий объем смеси трипсина/Lys-C (фермента: субстрат соотношение 1: 100 w/w). Инкубируйте при 37° C ночь с греющую.

10. Очистка картриджа (протокол 2)

  1. Влажные картридж объёмом 1 колонка-(1 мл) метанола. Очистить картридж с 1 колонка объем (1 мл) воды 80% Ацетонитрил/ВЭЖХ класс и отбросить потока через. Сбалансировать патрон с 4 колонки тома (4 мл) воды муравьиной кислоты/ВЭЖХ класса 0,1% и отбросить потока через.
  2. Подкислять образцы с 90 мкл 10% муравьиной кислоты или воды рН 2-3 (проверить рН с pH индикатор). Загрузить образцы Окислованная и собирать потока через. Перезагрузите потока через (содержащая пептиды не сохранен). Вымойте патрон с 6 столбцов тома (6 мл) воды муравьиной кислоты/ВЭЖХ класса 0,1%.
  3. Элюировать пептиды из картриджа с 1 колонка томов (1 мл) воды Ацетонитрил/ВЭЖХ класса 0,1% муравьиной acid/50%. Переезд в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Концентрат образца с помощью вакуумного концентратор (150 x g, вакуумные на 160 мбар).

11. фракционирование изоэлектрической сосредоточив (протокол 2)

Примечание: Пептиды разделены согласно их изоэлектрической точки с помощью фракционатор-гель на 13 см газа, охватывающих диапазон рН от 3 до 10. Мы использовали следующий протокол, предоставленных поставщиком (ниже кратко):

  1. Подготовить следующие решения: решение (600 мкл раствора глицерина, 60 мкл буфера OFFGEL, 4.34 мл ультрачистая вода) и решение B (1,776 мл раствора A) и 444 мкл ультрачистая вода.
  2. Соберите полоски IPG, фоторамки и электродов согласно инструкциям производителя.
  3. Ресуспензируйте образца с 1.8 мл раствора б. добавить 40 мкл раствора B в каждой скважине. Загрузите 150 мкл пример в каждой скважине.
  4. Выберите метод по умолчанию для пептиды: OG12PE00 (OFFGEL метод по умолчанию для пептидов для использования с низким Res 3100 OFFGEL комплект, рН 3-10, 12-ну кадров. Подождите, пока этот метод был завершено (~ 20 h). Сбор фракций в должным образом помечены трубы.

12. Очистка Гарвардского аппарат столбца обратного C18 пост МЭФ (протокол 2)

  1. Постепенно добавить несколько мкл в то время 1% TFA в деионизированной воде для каждой фракции для подкислять образца. Проверка с помощью РН бумаги, что pH около 3 или ниже.
  2. Подготовить следующие решения: решение 1 (5 мл ацетонитриле, 10 мкл рабочего раствора муравьиной кислоты, 4.99 мл ультрачистая вода) и решение 2 (0,5 мл ацетонитриле, 10 мкл муравьиной кислоты, 9.49 мл ультрачистая вода).
  3. Предварительно Намочите столбце спин с 150 мкл раствора 1. Центрифуги для 90 s на 750 x g и отмены потока через. Промойте колонку спин с 150 мкл раствора 2. Центрифуги для 90 s на 750 x g и отмены потока через.
  4. Пройти часть через колонку. Центрифуги для 90 s на 750 x g и отмены потока через. Промойте 150 мкл раствора 2. Центрифуги для 90 s на 750 x g и отмены потока через.
  5. Элюировать дроби с 50 мкл раствора 1. Центрифуги для 90 s в 750 x g. повторять эти шаги еще раз.
  6. Химчистка фракция с помощью вакуумного концентратор (150 x g, вакуумные 160 мбар) и хранить при температуре-80 ° C

13. анализ протеомических данных и биоинформатики18

  1. Анализировать данные, полученные от nano-LC-MS/MS массовые спектрометре с использованием программного обеспечения количественной оценки таких MaxQuant (версия 1.5.2.8) и Андромеда поисковой системы.
  2. Установите частоту ложных обнаружения (ФДР) 1% белков и пептидов и минимальная длина 7 аминокислот. Установить фермента специфику как C-терминал для Arg и Lys. Позвольте 2 пропущенных разобщенность пролина облигаций. Выберите carbamidomethylation цистеина как фиксированной модификации и N-терминальный белка ацетилирования и метионин окисления изменения переменной.
  3. Дальнейшего анализа данных статистического анализа программного обеспечения. Провести анализ функциональной обогащения с помощью программного обеспечения FunRich (www.funrich.org/). Выполните анализ обогащения онтология гена, с помощью Дэвид программного обеспечения (https://david.ncifcrf.gov/).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Начиная от мононуклеарных клеток периферической крови (получения) получено дифференциального центрифугирования, Протокол допускает получение населением CD14+ моноциты с начисленных чистоты более чем 98% проточной цитометрии (рис. 1). Вторично эти моноциты дифференцируются к различных поляризациях (рис. 2). Когда выбирается фракционированием на геле, миграция на гелях SDS-page приспособлен для получения количество желае...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Потому что протеомики является мощным инструментом для изучения выражение различных белков от всей ячейки или субцеллюлярные отсеков, Оптимизация протокола лизис клеток и переваривание белков рассматривался ряд исследований. Существует три основных класса методов, которые включают в гель пищеварения (переваривание белков в матрице геля полиакриламида)17, пищеварение в решение18 и фильтра aided образца подготовка19. Сообщается, что этот последний мето...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AM финансируется по программе лидер группы молодых (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), la le Национальная лига против рака и la Fondation дуги pour la recherche sur le рака. Мы благодарим Mariette Матондо от масс-спектрометрии для биологии платформы (UTECHS MSBIO, Институт Пастера, Париж). Мы благодарим Лорен Андерсон за ее чтение рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Рабочая станция гипоксииOxford OptronixHypoxylab
C6 Проточный цитометрBDAccuri C6
МочевинаAgilent Technologies5188-6435
Муравьиная кислота (FA)ARISTAR450122M
R-250 Coomassie blueBiorad1,610,436
Липополисахарид, E.Coli (LPS)Calbiochem437627
2D набор для очисткиGE Healthcare80-6484-51
RPMI 1640 среда, добавка глутамаксаGibco61870044
HEPES 1 MGibco15630-080
MEM Раствор заменимых аминокислот (NEAA) 100XGibco11140-035
Фосфатный буферный раствор (PBS) 1XGibco14190-094
Колонка Гарвардского аппарата Обратная колонка C18 микроспиновая колонкаГарвардская аппаратура74-4601
EDTA 0,5 M, pH 8,0InvitrogenAM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12%Life Technologies SASNP0321 BOX
CD14 Микрогранулы человекаMiltenyi Biotec130-050-201
Разделительная колонка MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401
Макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF)Miltenyi Biotec130-096-485
Интерлейкин 4 (IL4)Miltenyi Biotec130-093-917
Интерлейкин 13 (IL13)Miltenyi Biotec130-112-410
Интерферон гамма (INFγ)Miltenyi Biotec130-096-482
CD14-FITC (клон TÜ K4)Miltenyi Biotec130-080-701
MACSmix Ротатор трубокMiltenyi Biotec130-090-753
Трифторуксусная кислота (TFA)Pierce28904
Смесь трипсина/Lys-CPROMEGAV5073
Complete Mini, коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАRoche11836170001
Density Gradient Solution ( Histopaque 1077)Sigma Aldrich10771-100ML
AccumaxSigma AldrichA7089-100ML
Человеческая сыворотка из мужской AB-плазмы человека (SAB)Sigma AldrichH4522-100ML
Бычья сыворотка Альбумин (БСА) раствор 30%Sigma AldrichA9576-50ML
Трисма-основаниеSigma AldrichT1503
ГлицеринСигма Олдрич49767
&бета;-меркаптоэтанолСигма ОлдричM3148
Бромофенол синийСигма Олдрич114405
Додецилсульфат натрия (SDS) 20%Сигма Олдрич5030
Бикарбонат аммонияСигма Олдрич9830
АцетонитрилСигма Олдрич34888
ДитиотреитолСигма Олдрич43819
ЙодоацетамидСигма Олдрич57670
ТиоуреаСигма ОлдричT8656
CHAPSСигма ОлдричC9426
Набор для анализа микро BCAThermoFisher23235
5 мл стерильная пластиковая пипеткаVWR612-1685
Термомиксер C EppendorfVWR460-0223
Sep-Pak tC18 картриджи с обратной фазой, 100 мгводыWAT036820

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
  2. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  3. Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
  4. Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
  5. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  6. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  7. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
  8. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  9. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  10. Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
  11. Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
  12. Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
  13. Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926(2013).
  14. Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
  15. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  16. Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  18. Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
  19. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  20. Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
  21. Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
  22. Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
  23. Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
  24. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  25. Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
  26. Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Lys CCD14

Похожие статьи