С помощью усиленной зеленый флуоресценции белков выражая Escherichia Coli оценить мыши перитонеальных макрофагов фагоцитоз

Макрофагального фагоцитоза анализов часто используются для изучения врожденной иммунной функции. Врожденный иммунный ответ может указывать восприимчивость к инфекции. Линии клетки макрофагального широко используются в исследования иммунологии. Однако расширенный отрывок может привести к потере гена и скомпрометировано иммунной функции в этих клеточных линий. Таким образом основной перитонеальные макрофаги являются идеальный объект для изучения клеток функции¹.

Хотя считалось, что врожденный иммунный ответ быть нетронутыми в возрасте тело, фагоцитарной способности может уменьшиться по сравнению с что в младшей тела^2,3. Здесь мы покажем способ оценить фагоцитоза перитонеальных макрофагов от молодых (8 недельных) и возраста (16-месячного) мыши, с помощью выражения EGFP E. coli, который удобно, быстро и экономически.

Использование штамма EGFP-выражая E. coli является одним из преимуществ этот assay, потому что эти бактерии являются стабильными и отображать сигнал сильная флуоресценция, даже после того, как макрофаги фиксируются параформальдегида 4% (w/v). Кроме того, с помощью выражения EGFP E. coli, исследователи не требуется дальнейшее окрашивание после фагоцитоза, который экономит время. Кроме того макрофаги являются immunoresponsive для поверхностного антигена E. coli , делая E. coli больше подходит для assay фагоцитоза чем используя EGFP-выражая грибов или помечены флуоресцеин бусины.

С EGFP-выражая E. coliфагоцитоз пробирного можно легко осуществляется в 2 h и измеряется как поток цитометрии и флуоресценции микроскопии, в зависимости от назначения исследователя. Так как этот метод напрямую меры фагоцитарной способности, результаты более воспроизводимые чем другие косвенные методы.

Этот метод также были проверены в линии клетки RAW264.7 и периферической крови человека мононуклеарных клеток⁴. Приведенный ниже текст содержит подробные пошаговые инструкции для выполнения этот assay и освещаются важнейшие шаги, которые исследователи могут изменять для удовлетворения потребностей своих экспериментов.

Все процедуры были проведены под национальные институты здравоохранения руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных, и протоколы были одобрены животное уход и использование Комитета Даляньский медицинский университет. 16 месячного (с массой тела 30-35 g) и 8 недельных (20-25 g) SPF (конкретного возбудителя бесплатно) самцов мышей C57BL/6 были получены из центра животных SPF Даляньский медицинский университет. Все мыши хранились в стойлового содержания скота с доступом к ad libitumпродовольствия и воды. Температура хранилась на 20-24 ° C, влажность была 40% - 70%, и освещение было 12 h свет/12 h темно. Животные были позволены акклиматизироваться к окружающей среды по крайней мере за 7 дней до эксперимента.

1. Строительство ПЭТ сумо-EGFP плазмиды и индукции EGFP выражения

1. Синтезировать фрагмента гена EGFP (717 bp последовательность синтезированных службой синтеза пользовательских гена, см. Таблицу материалов и дополнительных файлов 1 последовательности) и усилить фрагмент с вперед грунтовка ( 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') и обратить вспять грунт (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), используя высококачественные полимеразы дна Taq.
2. Для обеспечения единого 3' аденин свесы для клонирования TA на следующем шаге продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), используйте модуль 30 мин при 72 ° C, после последнего цикла (см. дополнительный файл 1 для условия PCR). Проверьте продукт PCR электрофорезом геля агарозы.
3. Клонировать продукт PCR в ПЭТ сумо вектор (см. Таблицу материалы) с использованием клонирования метод⁵ с T4 ДНК лигаза TA. Инкубируйте реакции при комнатной температуре (20-25 ° C) за 30 мин. Вектор линеаризованных между нуклеотидами 653 и 654 с 1 bp 5′ T-навес на каждую прядь.
4. Трансформировать продукт перешнуровки в химически компетентным штамм E. coli BL21(DE) следующим образом: 5 мкл (100 нг) ПЦР продукта на 100 мкл BL21(DE) компетентных клеток через теплового шока при 42 ° C 90 s; Хранить смесь на льду на 3 мин, а затем, добавьте 400 мкл lysogeny бульон (LB) среды разогретую при 37 ° C, встряхивания в течение 1 ч при 37 ° C и 120 об/мин.
5. Прививать 100 мкл бактерий на поверхности пластины LB-канамицин (100 мкг/мл) с индуктором лактозы (0.5 ммоль/Л), уступая EGFP выражение штамма. Инкубируйте пластины при 37 ° C на ночь.
   Примечание: Если успешно выражается EGFP, некоторые колонии можно наблюдать как светящийся зеленый свет в темноте.
   1. При необходимости выберите колоний для проверки вставленного фрагмента EGFP, секвенирования ДНК. Праймеры для секвенирования ДНК являются: вперед, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; обратный, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
6. Прививать позитивные колонии в 5 мл среды фунтов с 100 мкг/мл канамицин. Инкубировать в 37 ° C, пожимая инкубатор на 120 об/мин 2 h и затем добавьте индуктором лактозы до конечной концентрации 0.5 ммоль/Л и продолжают сотрясать за 6 ч, вызывая EGFP выражение. Эмпирически когда встряхивания в течение 6 ч, оптическая плотность 600 Нм (OD600) может достичь 0,7 и выше.
7. 10 мкл бактериальной питательной среды на слайд, накройте его с coverslip и рассмотреть выражение EGFP под Перевернутый флуоресцентным микроскопом. Выражая EGFP бактерии могут храниться в среде при температуре 2-8 ° C в течение нескольких недель.

2. мышь перитонеальных макрофагов изоляции и основная культура

1. Добавьте 3.5 g thioglycolate 100 мл дистиллированной воды и автоклав смесь стерильности перед использованием. Насос thioglycolate среды в стерильный шприц 1 мл в капот для мыши перитонеальный инъекций. Используйте один мышь в шприц, чтобы избежать инфекции. Использование thioglycolate может увеличить количество макрофагов. -Резидентов перитонеальные макрофаги могут быть изолированы без thioglycolate, но с более низкой урожайности макрофагов.
2. Анестезировать мыши, с помощью метода утвержденных местных животных ухода и использования Комитетом. Inject 1 мл 3,5% thioglycolate среды в мыши брюшной полости с 1 мл шприц, с иглой 23 G.
   Примечание:, Вызывая анестезии, перитонеальный инъекции могут быть легко выполнены и уменьшает риск повреждения внутренних органов, вызванных инъекций.
3. Сохранить мыши с водой и продовольствием ad libitum на 3 дня. Контролировать тело вес и приема пищи животного каждый день. Если потеря массы тела более 10% в течение 3 дней, исключите животное из эксперимента.
4. После 3 дней усыпить мыши на шейки матки дислокации после быстро склонение анестезии, севофлюран в закрытом поле. В качестве альтернативы используйте метод, который был одобрен Комитетом местных животных ухода и использования усыпить мыши.
5. Поместите мышь в блюдо (с диаметром 10 см) с 75% этанола для стерилизации и передать его быстро на капот. Поместите курсор мыши на тарелку и прикрепите Передние лапы к доске, чтобы исправить положение мыши.
6. Используя шприц 5 мл, придает 20 G иглы, поместив скос иглы вверх под углом 30° - 40°, придать 5 мл холодного (4-10 ° C) фосфат амортизированное saline (PBS) в нижней части живота мыши брюшной полости, избегая проколов кишечника. При повреждении кишечника (или любой другой орган), мыши и его клетки могут больше не использоваться для экспериментов, как это может активировать клетки, которые не подходят для культуры главной ячейки.
7. Выполните мягкий массаж на обеих сторонах мыши живота. Затем аспирационная жидкость осторожно и медленно. Отказаться от перитонеальной жидкости в 50 мл пластиковых пробирок. Повторите эти шаги, 2 x или 3 x.
8. Центрифуга подвесной клетки для 10 мин на 400 x g в охлажденных центрифуги (4-8 ° C). Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в среду RPMI 1640 с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС). Подсчитать количество ячеек. Эмпирически плотность ячеек равна примерно 5 х 10⁶ клеток/мл когда клетки высокомобильна 10 мл среды.
9. Добавьте 5 х 10⁶ клеток в каждой скважине 6-ну плиты для потока цитометрии пробирного и 5 x 10⁵ ячеек на колодец в 24-ну пластина для флуоресцентным микроскопом. Культура клетки при 37 ° C в 5% CO₂ инкубатора на ночь. Культура средних может обновляться через 3 ч для удаления nonadherent клетки, потому что большинство из них являются лимфоциты. Адэрентных клеток являются главным образом макрофаги, и они могут также придерживаться ткани Культура лечение пластика.

3. макрофагального фагоцитоза пробирного с помощью микроскопа флуоресцирования

1. Наблюдать за клетки под микроскопом ярко поле для оценки жизнеспособности клеток и плотность клеток.
2. Удалите средство культуры с 24-ну пластины. Добавьте 100 мкл свежей питательной среды и 10 мкл бактериальных подвески (приблизительно 2 x 10⁷ клеток) в каждой скважины, как описано в таблице 1. Инкубируйте 1 час при 37 ° C, 5% CO₂ инкубатора.
3. Осторожно промойте 3 x-5 x с 500 мкл холодной PBS на хорошо промыть noninternalized бактерий.
4. Инкубируйте клетки с 4% формальдегида в PBS при комнатной температуре за 30 мин.
5. Мыть фиксированные клетки 3 x с PBS (500 мкл/хорошо).
6. Добавить 200 мкл Фаллоидин 633 флуоресценции красителя конъюгированных рабочего раствора (см. Таблицу материалы) пятна F-миозина. Хранить в темных, влажных месте (60% - 80%), при комнатной температуре на 60 мин смыть клетки 3 x с PBS (500 мкл/ну) чтобы удалить любой избыток Фаллоидин. Окрашивание F-актина, цитоплазме могут быть изложены и помочь отличить интернализированных бактерий.
7. 200 мкл рабочего раствора DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) (1 мкг/мл) пятно клеточного ядра и инкубировать в течение 5 мин в темных, влажных месте при комнатной температуре. Промойте 1 x с PBS (500 мкл/а) и 1 x с такой же объем дистиллированной воды. Затем клетки будет готов для наблюдения под Перевернутый флуоресцентным микроскопом.

4. макрофагального фагоцитоза пробирного с помощью проточной цитометрии

1. Минимуму экспериментальной ошибки и сделать правильное толкование результатов, набор групп и контроля трубок для эксперимента, перечисленные в таблице 2.
   1. Для контрольной группы, которая будет делаться на льду (Группа 4 в таблице 2), удалите носитель с 6-ну пластины и мыть его 1 x с PBS. Затем добавьте 1 мл 70 мм холодной ЭДТА в скважину отсоединить клетки и их передачу потока цитометрии трубки. 50 мкл бактериальной подвеска в трубку и поместите его на льду за 1 час.
   2. Для других групп удалите питательной среды. Добавьте 1 mL свежих среды в каждой скважине. 50 мкл бактериальной подвеска в скважины по данным группы настройки, как описано в таблице 2. Затем место пластину 6-Ну в 37 ° C, 5% CO₂ инкубатора для 1 h.
2. Чтобы утолить флуоресценции noninternalized E. coli, 200 мкл 0,8% Фиолетовый Кристалл (CV) водного раствора в скважину и вскоре, власть, таким образом избегая ложно положительных результата выражения EGFP E. coli привязкой к поверхности макрофаги, но не учитываются. Вымыть клетки 3 x с PBS для удаления любых остаточных CV.
3. Затем добавьте 1 мл 70 мм холодной ЭДТА в скважину отсоединить клетки и их передачу потока цитометрии трубки.
4. Центрифуга трубы на 400 x g 5 минут и удалить супернатант.
5. 100 мкл PBS Ресуспензируйте клетки. Мкл 5 F4/80-PE-конъюгированных антител (поверхностный антиген, выраженные на мыши макрофагов) в трубы, или использование IgG2a-PE изотипа, согласно параметр группы. Вихревой кратко и Проинкубируйте образцы на льду для 5-10 мин в темноте.
6. Добавьте 1 mL PBS в каждую пробирку и центрифуги на 400 x g для 5 минут удалить супернатант. Ресуспензируйте клетки окатышей с 200-300 мкл PBS для анализа потока цитометрии. Запустите каждую пробирку и приобретать данные для по крайней мере 10 000 событий F4/80⁺ клеток.

ПЭТ сумо вектор использует модификатор маленький убиквитин как разрешить выражение собственных белков в E. coli. СУМО Фьюжн может значительно улучшить EGFP растворимости, что позволяет легко обнаружить. Если выражение EGFP успешно индуцированных лактозы, зеленых колоний можно наблюдать в темноте (рис. 1A). Зеленые точки, представляющие EGFP-выражая E. coli, можно наблюдать под микроскопом флуоресценции, используя 40 x объектив (рис. 1B).

Анализ микроскопии показывает флуоресценции изображения (рис. 1 c) перитонеальных макрофагов из группы молодых и пожилых. Рисунок 1 c показано красной флуоресценцией F-актина, зеленая Флуоресценция EGFP-выражая E. coli, голубой флуоресценцией DAPI ядерной окрашивания и объединенного изображения всех трех каналов флуоресценции. 16-месячного мышей, которые были сосчитаны как возрасте мышей, были эквивалентны 60 - 65-летний людей. Эти изображения показывают, что макрофаги от молодых мышей представил сильнее фагоцитоза способности, чем те, от возрасте мышей.

Проточной цитометрии (рис. 2) был использован для количественной оценки и сравнения макрофагального фагоцитоза от группы молодых и пожилых. Рисунок 2A показывает cytometry анализ представительных потока молодежи, престарелых и групп управления. F4/80-PE антитела была использована для выявления и ворот макрофаги, и EGFP-позитивные сигналы указывают макрофаги, которые phagocytosed E. coli. Доля F4/80+ и EGFP+ клетки указывают на способность фагоцитирующих макрофагов. Результат (рис. 2B) молодой группы был 62,7% ± 5,1% (среднее ± SEM), который был значительно выше, чем 35,2% ± 2,9% (средний ± SEM) возрасте группы. Эти результаты согласуются с тенденцией результаты микроскопии флуоресцирования.

Рисунок 1 : Выражая EGFP E. coli и его фагоцитоз макрофагами. (A) выражая EGFP E. coli колоний. ПЭТ сумо-EGFP плазмида была преобразована в BL21(DE) клетки; бактерии были привиты на плите LB-канамицин (100 мкг/мл). Покрытие 0.5 ммоль/Л лактозы на поверхности пластины LB был использован как индуктор, уступая EGFP выражение. Если успешно выражается EGFP, желтоватый зеленый колоний наблюдаются с помощью ультрафиолетового света в темноте. (B) микроскопии флуоресцирования EGFP-выражая E. coli. Зеленый сигнал представляет EGFP-выражая E. coli. Шкалы бар = 50 µm. (C) многоканальный флуоресценции изображений макрофагов, которые phagocytosing E. coli. Клетки инкубировали с EGFP-выражая E. coli (зеленый) за 1 ч, а затем вымыть с PBS, фиксации с параформальдегида 4% и пятнать для F-актина с использованием Фаллоидин 633 рабочего раствора конъюгата (красный) и DAPI (синий). Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Поток результаты цитометрии. (A) представитель потока cytometry анализ молодежи, престарелых и групп управления. Перитонеальные макрофаги окрашивали с F4/80-PE после coincubation с EGFP-выражая E. coli. F4/80+ и EGFP+ клетки были редки в отрицательной контроля и управления (4 Группа: молодая группа на льду) групп. Молодых и пожилых потока гранулярных участки представляют группы 5 и 6, соответственно. (B) результаты анализа цитометрия потоков групп молодых и пожилых. Для изучения разницу между этими двумя группами использовался тест Манна-Уитни. Доля F4/80+ и EGFP+ клетки в группе молодых была значительно выше, чем в возрасте группе (*P < 0,05). Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: группа настройки для микроскопии флуоресцирования. Две группы, группы возрасте (16-месячного C57BL/6, n = 3) и молодой группы (8-недельных C57BL/6, n = 3), были использованы для подготовки перитонеальных макрофагов. Перитонеальные макрофаги каждой мыши были добавлены в отдельных скважинах. Приблизительно 2 x 105 клеток в объеме 100 мкл были добавлены к каждой скважины; затем приблизительно 2 x 107 EGFP-выражая E. coli клеток в объеме 10 мкл были добавлены к каждой хорошо и coincubated за 1 ч при 37 ° C.

Таблица 2: группа настройки для проточной цитометрии. Основная перитонеальных макрофагов от молодых и пожилых мышей были установлены как шесть групп. Группа 1 был установлен как изотипа управления; группы 2 и 3 были установлены как один положительный контроль для PE или EGFP канала, соответственно. Для обеспечения того, чтобы внутренняя флуоресценции для фагоцитоза, Группа 4 был инкубированы на льду. Фагоцитоз остановлена на льду из-за низкой температуры. Время инкубации было 1 час для всех групп.

Авторы не имеют ничего сообщать.