Здесь мы представляем протокол для оценки мыши фагоцитоза перитонеальных макрофагов с помощью расширенной зеленого флуоресценции белков выражая Escherichia coli.
Методическая статья
* These authors contributed equally
Здесь мы представляем протокол для оценки мыши фагоцитоза перитонеальных макрофагов с помощью расширенной зеленого флуоресценции белков выражая Escherichia coli.
Эта рукопись описывает простой и воспроизводимый метод для выполнения анализа фагоцитоза. В первой части этого метода предполагает строительство ПЭТ сумо-EGFP вектор (сумо = небольшой убиквитин как модификатор) и выражая зеленый флуоресценции белков (EGFP) в Escherichia coli (BL21DE). Выражая EGFP E. coli coincubated с макрофаги за 1 ч при 37 ° C; отрицательный контроль группы инкубированы на льду за такое же количество времени. Затем макрофаги готовы для оценки. Преимущества этого метода включают шаги его простой и прямой, и фагоцитоза могут быть измерены оба потока цитометр и флуоресцентным микроскопом. Выражая EGFP E. coli являются стабильными и отображать сигнал сильная флуоресценция, даже после того, как макрофаги крепятся с помощью параформальдегида. Этот метод является не только подходит для оценки макрофагов клеточных линий или первичной макрофагов в пробирке, но также подходит для оценки фагоцитоза гранулоцитов и моноцитов в периферической крови мононуклеаров. Результаты показывают, что фагоцитарной способности перитонеальных макрофагов от молодых мышей (8 недельных) выше, чем макрофагов от возраста (16-месячного) мышах. Таким образом этот метод меры макрофагального фагоцитоза и подходит для изучения функции иммунной системы.
Макрофагального фагоцитоза анализов часто используются для изучения врожденной иммунной функции. Врожденный иммунный ответ может указывать восприимчивость к инфекции. Линии клетки макрофагального широко используются в исследования иммунологии. Однако расширенный отрывок может привести к потере гена и скомпрометировано иммунной функции в этих клеточных линий. Таким образом основной перитонеальные макрофаги являются идеальный объект для изучения клеток функции1.
Хотя считалось, что врожденный иммунный ответ быть нетронутыми в возрасте тело, фагоцитарной способности может уменьшиться по сравнению с что в младшей тела
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все процедуры были проведены под национальные институты здравоохранения руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных, и протоколы были одобрены животное уход и использование Комитета Даляньский медицинский университет. 16 месячного (с массой тела 30-35 g) и 8 недельных (20-25 g) SPF (конкретного возбудителя бесплатно) самцов мышей C57BL/6 были получены из центра животных SPF Даляньский медицинский университет. Все мыши хранились в стойлового содержания скота с доступом к ad libitumпродовольствия и воды. Температура хранилась на 20-24 ° C, влажность была 40% - 70%, и освещение было 12 h свет/12 h темно. Животные были позволены акклимати....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
ПЭТ сумо вектор использует модификатор маленький убиквитин как разрешить выражение собственных белков в E. coli. СУМО Фьюжн может значительно улучшить EGFP растворимости, что позволяет легко обнаружить. Если выражение EGFP успешно индуцированных лактозы, зеленых колоний можно наблюдать в темноте (рис. 1A). Зеленые точки, представляющие EGFP-выражая E. coli, можно наблюдать под микроскопом флуоресценции, используя 40 x объектив (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Шаги в этом протоколе, являются довольно простое и понятное. Одним из важных шагов является побудить EGFP выражение на E. coli. Обычно когда ген от эукариот, как EGFP, планируется выразить в прокариотах, таких как кишечная палочка, есть риск, что белка образует неактивные агрегатов (включение органы), который изменяет белка собственной структуры и деятельности. С помощью ПЭТ сумо вектора и строительство плазмида ПЭТ сумо-EGFP, синтез белка EGFP-сумо выразил успешно, и световой сигнал был достаточно силь.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы не имеют ничего сообщать.
Национальный фонд Китая естественных наук (№ 31800046) и естественные науки фонд провинции Ляонин (№ 20170540262) поддержали эту работу. Эта работа была выполнена в лаборатории научно-исследовательского центра на второй больницы Даляньский медицинский университет. Авторы хотели бы поблагодарить Сяо-Лин Санг за помощь с проточной цитометрии и Qu Бо и Донг-цюань Ян за их помощь в производстве видео.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BD FACSCanto II Проточный цитометр | BD Biosciences-Biotin | ||
| антимышиный CD16/32 Антитело | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression System | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | - | |
| DAPI(4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE антитело против мышей для FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Инвертированный микроскоп | Leica | Microsystems-PE | |
| Rat IgG2a, κ-изотип контроль | Biolegend | Cat400507 | |
| Фаллоидин 633 флуоресцентный краситель сопряженный рабочий раствор | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Тиогликоллат средний | Sigma-Aldrich | T9032 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение