Расширенные микроскопов, которые позволяют быстро и с высоким разрешением изображений, изолированные плазматической мембраны и окружающие внутриклеточных объем, будет представлен. Интеграция спиннинг микроскопии флуоресцирования внутреннее отражение диска и всего в одной установки позволяет жить изображений эксперименты на приобретение высокой ставки до 3.5 сек на стек изображений.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация адгезии образование в клетках посредством передовых спиннинг диска всего внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В живых клетках процессы, такие как формирование адгезии включать широкие структурные изменения в плазматической мембраны и внутренних ячейки. Для того, чтобы визуализировать эти весьма динамических событий, были объединены два взаимодополняющих световой микроскопии методы, которые позволяют быстро изображений живых образцов: спиннинг диск микроскопии (SD) для записи объем быстро и с высоким разрешением и полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF) для точной локализации и визуализации плазматической мембраны. Всеобъемлющей и полной визуализации протокол будет показан для руководящих через пробоподготовки, калибровки микроскопа, формирования изображений и приобретения, что приводит к многоцветные SD-TIRF живой серии изображений с высоким разрешением пространственно временной. В макросе самостоятельной письменной предусмотрено все необходимое изображение после обработки шаги для создания многомерной живой визуализации наборов данных, т.е. регистрации и сочетание отдельных каналов, с открытым исходным кодом ImageJ. Изображения флуоресцентных белков во время посвящения и созревания адгезии комплексов, а также формирование актина цитоскелета сети, была использована как доказательство принципа для этот новаторский подход. Сочетание 3D микроскопия высокого разрешения и TIRF содержится подробное описание этих сложных процессов в пределах клеточной среды и, в то же время, точной локализации мембраны связанных молекул, обнаружены с высоким Соотношение сигнал фон.
Введение
Наших дней, световой микроскопии методы обеспечения высокой/супер резолюции изображений в фиксированной и живой образец быстро развиваются. Суперразрешением методы, такие как стимулировали выбросов истощения (интереса), структурированные освещения микроскопии (SIM) и фото активации локализации микроскопии (PALM) или прямой стохастических оптических реконструкции микроскопии (буря), соответственно, являются коммерчески доступных и включение изображений внутриклеточных структур, показывая детали почти на молекулярном уровне1,2,3,4,<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка клеток
- За два дня до эксперимента, семян 3 * 105 HeLa или NIH3T3 клетки в 2 мл полного роста среднего за хорошо пластины 6-ну культуры клеток. Убедитесь, что клетки обрабатываются в Ламинарный шкаф на протяжении настоящего Протокола.
- Один день до эксперимента, подготовьте трансфекции реагентов в соответствии с рекомендациями изготовителя или эмпирически определяется протоколом, например:
- Разбавьте 1 мкг ЗП-Lifeact и 1 мкг рекламы ЯФП-Vinculin в общей сложности 200 мкл сокращение сыворотке среды. Вихревой трансфекции реагент кратко, мкл 4 200 мкл ДНК и вихрь снова. Инкубируйте трансфекции смесь для 15-20 мин....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для того, чтобы показать потенциал изображений SD-TIRF, assay был разработан, должен раскрыть пространственно временной организации комплексов адгезии клеток матрица и их взаимодействие с цитоскелета во время клеточной адгезии. Таким образом сторонник HeLa или, альтернативно, NIH3T3 которую клетки были transfected с рекламы ЯФП-Vinculin и ЗП-Lifeact за 18-24 ч, trypsinized и посеян на фибронектин покрытием стекла дно блюда. Эти клеточные линии были выбраны для их произносится цитоскелета .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом документе было представлено первое успешное осуществление микроскопии SD и TIRF в конфигурации подходит для проведения живых клеток экспериментов и изображений, т.е. приобретение высокой ставки как 2 SD-TIRF стеки изображений в минуту в 3 различными этап позиции, соответствующие в общей сложности 168 фреймов (около 3 кадров в секунду), были приобретены. Несколько SD-TIRF Микроскопы, которые были описаны ранее12,13, главным образом отсутствием дост.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы сильно благодарю научного сообщества из университета медицинский центр Гамбург-Эппендорф за поддержку нас с образцами для оценки. А именно мы благодарим Sabine Windhorst для NIH3T3 клеток, Андреа Mordhorst для рекламы ЯФП-Vinculin и Рудольф Maren для ЗП-Lifeact.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <стронг>микроскоп и комплектующие | |||
| SD-TIRF микроскоп | Visitron Systems | ||
| Ti с идеальной системой фокусировки | Nikon | Инвертированная подставка для микроскопа | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Блок вращающихся дисков в конфигурации с двумя камерами | |
| iLAS2 | Сканер Roper Scientific | TIRF/FRAP | |
| Evolve | Фотометрические | EM-CCD камеры | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Моторизованная Z-ступень | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Моторизованная XY-ступень | |
| Stage Верхняя инкубационная камера | Okolab | Bold Line | Температура, CO2 и подача влаги |
| <сильная>клеточная культура | |||
| HeLa Клетки рака шейки матки | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 фибробласты | DSMZ | ACC-59 | |
| Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический раствор (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| модифицированный Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Пониженная сывороточная среда |
| Фетальная телячья сыворотка (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| пенициллин/стрептомицин (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| полноценная питательная среда (DMEM с добавлением 10% FCS и 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection реактив |
| Аскорбиновая кислота (АА) | Sigma | A544-25G | |
| 6-луночный планшет для культивирования клеток | Sarstedt | 83.392 | |
| Стеклянные донные тарелки | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35мм, 0.17мм стеклянный покровный стекло |
| Фибронектин, бычья плазма | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer улучшенная камера | VWR | 631-0696 | |
| Бусины TetraSpeck | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Марен Рудольф, Институт медицинской микробиологии, Университетская клиника Гамбурга Эппендорф, | ||
| Германия YFP-Vinculin | Андреа Мордхорст, Институт медицинской микробиологии, Университетская клиника Гамбурга Eppendorf, Германия | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | эта публикация | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | версии 6.2.2 |
Ссылки
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
- Gustafsson, M. G. L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
