Методическая статья

Визуализация адгезии образование в клетках посредством передовых спиннинг диска всего внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования

DOI:

10.3791/58756

⸱

21 января 2019 г.

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Расширенные микроскопов, которые позволяют быстро и с высоким разрешением изображений, изолированные плазматической мембраны и окружающие внутриклеточных объем, будет представлен. Интеграция спиннинг микроскопии флуоресцирования внутреннее отражение диска и всего в одной установки позволяет жить изображений эксперименты на приобретение высокой ставки до 3.5 сек на стек изображений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В живых клетках процессы, такие как формирование адгезии включать широкие структурные изменения в плазматической мембраны и внутренних ячейки. Для того, чтобы визуализировать эти весьма динамических событий, были объединены два взаимодополняющих световой микроскопии методы, которые позволяют быстро изображений живых образцов: спиннинг диск микроскопии (SD) для записи объем быстро и с высоким разрешением и полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF) для точной локализации и визуализации плазматической мембраны. Всеобъемлющей и полной визуализации протокол будет показан для руководящих через пробоподготовки, калибровки микроскопа, формирования изображений и приобретения, что приводит к многоцветные SD-TIRF живой серии изображений с высоким разрешением пространственно временной. В макросе самостоятельной письменной предусмотрено все необходимое изображение после обработки шаги для создания многомерной живой визуализации наборов данных, т.е. регистрации и сочетание отдельных каналов, с открытым исходным кодом ImageJ. Изображения флуоресцентных белков во время посвящения и созревания адгезии комплексов, а также формирование актина цитоскелета сети, была использована как доказательство принципа для этот новаторский подход. Сочетание 3D микроскопия высокого разрешения и TIRF содержится подробное описание этих сложных процессов в пределах клеточной среды и, в то же время, точной локализации мембраны связанных молекул, обнаружены с высоким Соотношение сигнал фон.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наших дней, световой микроскопии методы обеспечения высокой/супер резолюции изображений в фиксированной и живой образец быстро развиваются. Суперразрешением методы, такие как стимулировали выбросов истощения (интереса), структурированные освещения микроскопии (SIM) и фото активации локализации микроскопии (PALM) или прямой стохастических оптических реконструкции микроскопии (буря), соответственно, являются коммерчески доступных и включение изображений внутриклеточных структур, показывая детали почти на молекулярном уровне1,2,3,4,5,6. Однако эти подходы имеют ограниченную применимость для живых изображений экспериментов, в которых большие объемы нужно быть визуализированы с несколько кадров в секунду скорость приобретения. Разновидности весьма динамических процессов, регулируется через плазматическую мембрану, например Эндо- / экзоцитоз, адгезии, миграции или сигнализации, происходят с высокой скоростью в пределах крупных сотовых томов. Недавно для того, чтобы заполнить этот пробел, интегрированный микроскопии техника была предлагаемая называется спиннинг диска TIRF (SD-TIRF)7. В деталях TIRF микроскопии позволяет специально изолировать и локализовать плазматической мембраны8,9, в то время как SD микроскопии является одним из наиболее чувствительных и быстро жить методы визуализации для визуализации и отслеживания внутриклеточных органелл в цитоплазме10,11. Сочетание обоих методы визуализации в одиночной установки уже был реализован в прошлом12,13, однако, Микроскоп, представленные здесь (рисунок 1) наконец отвечает критериям для выполнения живых изображений SD-TIRF эксперименты из вышеупомянутых процессов в 3 кадров в секунду скорость. Поскольку этот Микроскоп является коммерчески доступных, цель этой рукописи — описать в деталях и предоставлять открытым исходным кодом инструменты и протоколы для захвата изображений, регистрации и визуализации, связанный с SD-TIRF микроскопии.

Установки на основе инвертированным микроскопом, подключенных к блокам два сканирования через независимых порта - левый порт связан с блоком SD и задней порт блок сканера для TIRF и фото активации / отбеливания экспериментов. До 6 лазеры (405/445/488/515/561/640 Нм) могут быть использованы для возбуждения. Для возбуждения и обнаружения сигнала флуоресценции, либо 100 x / NA1.45 масло или 60 x / NA1.49 масло TIRF цели, соответственно, были заняты. Испускаемого света расколот дихроичное зеркало (561 Нм Лонг Пасс или 514 Нм Лонг pass) и фильтруется различными полосовые фильтры (55 Нм широкий центрированного 525 Нм, 54 Нм широкий центрированного 609 Нм для зеленой и красной флуоресценцией, соответственно) перед двумя EM-CCD камеры Эра. Пожалуйста, обратите внимание, что более подробные технические сведения об установке перечислены в Zobiak и др. 7. в TIRF конфигурации SD блок перемещается из света путь в течение около 0,5 s так, что же две камеры могут быть использованы для обнаружения, позволяя быстрое переключение между двумя визуализации формы, по сравнению с около 1 s, что было сообщено в прошлом13 < /C2 >. Эта функция позволяет одновременное приобретение двойного канала, таким образом 4 канала SD-TIRF изображений на ранее непревзойденную скорость и точность могут быть выполнены. Кроме того выравнивание между SD и TIRF образов ненужной. Выравнивание изображения между двумя камерами, однако, должна проверяться перед началом эксперимента и исправления в случае необходимости. В следующий протокол в макросе самостоятельной письменной ImageJ был реализован обычной регистрации коррекции. Кроме того макрос был главным образом позволяют одновременное визуализация SD - и TIRF наборов данных, несмотря на их различные размерности. Приобретение программного обеспечения, сама не представила эти возможности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка клеток

  1. За два дня до эксперимента, семян 3 * 105 HeLa или NIH3T3 клетки в 2 мл полного роста среднего за хорошо пластины 6-ну культуры клеток. Убедитесь, что клетки обрабатываются в Ламинарный шкаф на протяжении настоящего Протокола.
  2. Один день до эксперимента, подготовьте трансфекции реагентов в соответствии с рекомендациями изготовителя или эмпирически определяется протоколом, например:
    1. Разбавьте 1 мкг ЗП-Lifeact и 1 мкг рекламы ЯФП-Vinculin в общей сложности 200 мкл сокращение сыворотке среды. Вихревой трансфекции реагент кратко, мкл 4 200 мкл ДНК и вихрь снова. Инкубируйте трансфекции смесь для 15-20 минут при комнатной температуре.
    2. Добавьте смесь всего трансфекции каплям непосредственно к клеткам. Mix встряхнув тарелку и поместите его обратно в инкубаторе.
  3. В день эксперимента Подготовьте образец для живых изображений:
    1. Подготовка 10 мкг/мл раствора фибронектин в PBS для покрытия поверхности стекла 35 мм стекла дно тарелки. Используйте только высококачественные 0,17 мм стекла coverslips для оптимальной производительности TIRF и избежать пластика дно блюда. Оставьте раствор на поверхности стекла, за 30 мин при комнатной температуре, затем удалите ее и просушите пусть блюдо.
    2. Разбавить раствор мульти флуоресцентные бусины 0,1 мкм плотность 1.8 x 109 частиц на мл в дистиллированной воде и добавьте в решение для 30-60 s фибронектин покрытием стеклянной поверхности. Немедленно удалите решение и пусть блюдо воздушно-сухой.
      Примечание: Этот шаг необходим, только если TIRF плоскости должно быть найдено до заполнения ячеек или приобрести 2-цветный эталонный образ для регистрации на основе бисера образ.
    3. Приготовляют раствор аскорбиновой кислоты (AA) 0,1 М и разбавляют до конечной концентрации 0,1 мм среднего роста (AA-средний). Поместите раствор в ванну воды 37 ° C.
      Примечание: Используйте оптимизированные флуоресценции клеток питательной среды, если это возможно, такие как phenolred бесплатный и Флавин снижение среднего (Рибо-). АА является анти окисляющий агент, который может уменьшить фототоксических эффекты во время живых изображений14. Мы проверили это успешно в этом assay, т.е. больше клеток появился здоровый на условиях, применяемых чем без добавления AA. Однако рН среды была снижена на 0,17 единицы pH.
    4. Вымыть клетки с 2 мл PBS, 250 мкл трипсина-ЭДТА и ждать, пока клетки являются полностью отсоединяется (2-3 мин в инкубаторе 37 ° C). Ресуспензируйте клетки тщательно в 1 мл предварительно разогретую AA-средний с пипетки и добавить его в 4 мл AA-средний в трубы культуры клеток 15 мл. Место суспензию клеток с слегка открытой крышкой в инкубаторе, равным 37 ° C и 5% CO2 неподалеку от Микроскоп.
    5. Добавить 1 мл предварительно разогретую AA-средний блюдо дно стекла и поместите его в держатель подогретую микроскопа (см. следующий пункт).

2. живой изображений

  1. Запуск экологического контроля микроскоп для достижения стабильной 37 ° C, 5% CO2 и влажной атмосфере.
    Примечание: Здесь, палата верхней инкубации маленькую сцену был использован разрешенных стабильные параметры в течение примерно 15 минут больше инкубаторы потребуется больше времени для достижения стабильных условий.
  2. Исправить все приобретения параметры в Микроскоп, перед применением суспензию клеток:
    1. Задать интервал времени до 30 s и продолжительностью до 60-90 мин активировать автоматический пистолет фокус функция аппаратного авто фокус на каждый момент времени (значение «1»).
    2. Настройка экспозиции камеры и выгоды, а также мощности лазера для каждого канала. Высокие уровни усиления, низким воздействия времени и мощности лазера низкой рекомендуется уменьшить фото токсичность.
      Примечание: Данные, представленные здесь была приобретена с 200 мс экспозиции, получить уровень 500 и 20% мощности лазера, которая равна интенсивности возбуждения 0.5 Вт/см² для 488 нм и 1 Вт/см² для 561 Нм, соответственно.
    3. Установка z стек каналов спиннинг диск до 10 мкм с шагом 0,4 мкм. Деактивировать z стеки каналов TIRF. Смещение в нижней части-«0», т.е. плоскости низкие будет фокус позиции оборудования авто фокус.
    4. Активируйте функцию многоточечный «этап позиции».
      Примечание: До 3 позиции могут быть записаны в интервале времени 30 s.
  3. Найти флуоресцентные бусины с epi дневного освещения на окуляр или на экране компьютера, затем активировать один канал TIRF и задать угол освещения в значение, которое обозначает TIRF освещения. Активировать в авто фокус, нажав на кнопку на панели микроскоп и настроить фокус с помощью смещения колесика. Приобрести 2-цветной набор данных, то есть TIRF-488 и TIRF-561, для регистрации последующих шарик-изображений (см. пункт 3.1).
    1. Необязательно: Чтобы TIRF освещения, добавьте несколько микролитров свободно Плавающая подвеска флуоресцентные разноцветные бусы (см. пункт 1.3.2.). Активировать живой просмотр канала TIRF и увеличить угол освещения. Non сторонник шарики исчезнут за критический угол, обеспечивая правильное освещение TIRF8.
  4. Перемешать суспензию клеток снова, инвертирование закрытой трубе 2 - 3 раза и применять 1 мл клеток к визуализации блюдо.
  5. Быстро найти двойной transfected клеток с низкого уровня epi дневного освещения. Центр ячейки в окне предварительного просмотра живой камеры, используя яркие области освещения и отметьте положение. Найти еще 1-2 точек интереса и сохранить их в списке positions.
    Примечание: В начале, клетки легко можно отсоединить благодаря сценическое движение, поэтому 4-5 позиций и перепроверить все перед началом захвата изображений. После этого отказаться от позиции 1-2.
  6. Начало сбора данных, нажав на кнопку «Последовательности».

3. После обработки в ImageJ

  1. Чтобы создать без регистрации hyperstack в Фиджи15, была написана макрос с именем «SD-TIRF_helper», которые могут применяться для 2-4 канала SD-TIRF timelapse наборов данных. Сохраните файл «SD-TIRF_helper_JoVE.ijm» в Фиджи подпапки «макросы» и запустите макрос, щелкнув на команде меню «Плагины > Макрос > Run...».
    1. Если цветовые каналы регистрации коррекции, выберите вариант и создать новую ссылку регистрации на основе бисера (ориентир-файл) или использовать существующий файл, который был создан раньше.
      Примечание: Turboreg плагин16 будет применяться к флуоресцирования бусины исходных образов. Установите плагин в Фиджи программное обеспечение согласно общие руководящие принципы для установки плагина.
    2. Импорт данных с био форматы импорта и выбрать hyperstack как вариант просмотра. Загрузить набор данных изображения, выберите SD-серии в первый шаг и TIRF-серии на втором шаге. Фиджи будет отображать данные, отсортированные по канала и стадии позиции, т.е. обычно все SD-каналы и все TIRF-каналы показывают как один hyperstack для каждой стадии позиции, который был выбран.
      Примечание: Импорт данных из различных типов файлов, например TIFF-серии или зависящих от платформы файлов типы, такие как * .nd. Тип файла не могут быть признаны только, если он не был экспортирован на приобретение программного обеспечения как независимые, сжатия менее TIFF формат.
    3. Применить коррекцию регистрации по соответствующим каналам, загрузив файл заранее достопримечательности.
    4. Выберите желаемый цвет просмотровые таблицы (LUT) для каждого канала SD - и TIRF и объединить их в единый, многомерные hyperstack.
      Примечание: Во время обработки TIRF каналов, количество z самолетов с нулевыми значениями интенсивности добавляются поверх нижней плоскости, совпадает с числом z самолеты в наборе SD. Этот шаг важен для визуализации окончательной hyperstack. Эта методология является правильным, поскольку глубина TIRF освещения (менее7200нм) меньше, чем размер z шаг SD стека (400 Нм).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того, чтобы показать потенциал изображений SD-TIRF, assay был разработан, должен раскрыть пространственно временной организации комплексов адгезии клеток матрица и их взаимодействие с цитоскелета во время клеточной адгезии. Таким образом сторонник HeLa или, альтернативно, NIH3T3 которую клетки были transfected с рекламы ЯФП-Vinculin и ЗП-Lifeact за 18-24 ч, trypsinized и посеян на фибронектин покрытием стекла дно блюда. Эти клеточные линии были выбраны для их произносится цитоскелета ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом документе было представлено первое успешное осуществление микроскопии SD и TIRF в конфигурации подходит для проведения живых клеток экспериментов и изображений, т.е. приобретение высокой ставки как 2 SD-TIRF стеки изображений в минуту в 3 различными этап позиции, соответствующие в общей сложности 168 фреймов (около 3 кадров в секунду), были приобретены. Несколько SD-TIRF Микроскопы, которые были описаны ранее12,13, главным образом отсутствием дост...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сильно благодарю научного сообщества из университета медицинский центр Гамбург-Эппендорф за поддержку нас с образцами для оценки. А именно мы благодарим Sabine Windhorst для NIH3T3 клеток, Андреа Mordhorst для рекламы ЯФП-Vinculin и Рудольф Maren для ЗП-Lifeact.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<стронг>микроскоп и комплектующие
SD-TIRF микроскопVisitron Systems
Ti с идеальной системой фокусировкиNikonИнвертированная подставка для микроскопа
CSU-W1 T2YokogawaБлок вращающихся дисков в конфигурации с двумя камерами
iLAS2 Сканер Roper ScientificTIRF/FRAP
Evolve ФотометрическиеEM-CCD камеры
PiezoZ stageLudl Electronic ProductsМоторизованная Z-ступень
Bioprecision2 XY stageLudl Electronic ProductsМоторизованная XY-ступень
Stage Верхняя инкубационная камераOkolabBold LineТемпература, CO2 и подача влаги
<сильная>клеточная культура
HeLa Клетки рака шейки маткиDSMZACC-57
NIH3T3 фибробластыDSMZACC-59
Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический раствор (PBS)Gibco14190144
Trypsin-EDTA 0,05%Gibco25300054
модифицированный Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)Gibco31966-021
OptiMEMGibco31985070Пониженная сывороточная среда
Фетальная телячья сыворотка (FCS)Gibco10500064
пенициллин/стрептомицин (PenStrep)Gibco15140148
полноценная питательная среда (DMEM с добавлением 10% FCS и 1% PenStrep)
TurboFectThermoFisher ScientificR0531Transfection реактив
Аскорбиновая кислота (АА)SigmaA544-25G
6-луночный планшет для культивирования клетокSarstedt83.392
Стеклянные донные тарелкиMatTekP35G-1.5-10-C35мм, 0.17мм стеклянный покровный стекло
Фибронектин, бычья плазмаThermoFisher Scientific33010018
Neubauer улучшенная камераVWR631-0696
Бусины TetraSpeckThermoFisher ScientificT7279
Plasmids
RFP-LifeactМарен Рудольф, Институт медицинской микробиологии, Университетская клиника Гамбурга Эппендорф,
Германия YFP-VinculinАндреа Мордхорст, Институт медицинской микробиологии, Университетская клиника Гамбурга Eppendorf, Германия
Software and plugins
VisiViewVisitron SystemsVersion 3
ImageJVersion 1.52c
Turboreg pluginhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"эта публикацияhttps://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmerверсии 6.2.2

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
  2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  7. Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
  8. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
  9. Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
  10. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  11. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
  12. Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024(2009).
  13. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  14. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  17. Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
  18. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  19. Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
  20. Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
  21. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  22. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  23. Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
  24. Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
  25. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Spinning Disk MicroscopyTIRF MicroscopyLive Cell ImagingAdhesion FormationCytoskeletal NetworkFluorescent ProteinsImage RegistrationMicroscope CalibrationSample PreparationMulti Color Imaging

Похожие статьи