Маргинальные зоны B клеток (MZBs) реагировать силы сдвига потока путем переориентации их миграции путь вверх поток. Этот протокол показано, как записывать и анализировать миграции с помощью fluidics блока, насоса, Микроскоп съемочной системы и свободного программного обеспечения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ миграционных потока индуцированного сдвига мышиных маргинальные зоны B клеток In Vitro
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Маргинальные зоны B клетки (MZBs) являются население B-клетки, которые находятся в мыши селезеночной маргинальных зонах, которые окутывают фолликулов. Чтобы достичь фолликулов, MZBs необходимо перенести вверх поперечной силы потока крови. Мы представляем здесь метод для анализа этого потока индуцированной MZB миграции в пробирке. Во-первых MZBs изолированы от Хандра мыши. Во-вторых MZBs поселились на Интегрин лигандов в поток камеры слайды, подвергается сдвига потока и образ под микроскопом во время миграции. В-третьих изображения перенос MZBs обрабатываются с помощью MTrack2 автоматическая ячейки отслеживания плагинов ImageJ, и результирующий треков ячейки являются количественно с помощью инструмента хемотаксис Ibidi. Миграции данных показывают, как быстро переместить ячейки, как часто они изменить направление, ли вектор сдвига потока влияет на их направление миграции и какие Интегрин лигандов участвуют. Хотя мы используем MZBs, метод может быть легко адаптирована для анализа миграции лейкоцитов, который реагирует на силы сдвига потока.
Введение
Иммунные клетки являются наиболее подвижные клетки в организме человека и часто должны бороться с поперечной силы от крови и лимфы. Однако существует сравнительно мало исследований на сдвиг силы индуцированной миграции лейкоцитов1,2,3,,45. Мы представляем здесь надежный и количественный протокол для анализа реакции иммунной клетки потока в пробирке. Выполнение анализа не требуется изготовление компонентов, и все оборудование и расходные материалы являются коммерчески доступными. В протокол, включая анализ о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты, связанные с использованием животных были ранее одобрены Landesverwaltungsamt Галле (Саксония-Анхальт), Германия, в соответствии с все руководящие принципы медицинского факультета OVGU Университета Магдебурга.
1. MZB клетки очистки
-
Изолируйте лейкоцитов.
- Жертву 8 до 16 недели старая мышь и удаление селезенки16. Отделить селезенки в 5 мл ледяной клеток буфера [фосфат амортизированное saline (PBS) + 0.5% свободных жирных кислот бычьим сывороточным альбумином (БСА)], либо с помощью диссоциатором ткани или аккуратно затирания селезенки через сетку фильтра клеток 70 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы использовали протокол, описанные выше для сравнения миграции MZBs на слайдах ИКАМ-1-покрытием без потока (0 Дин/см2) и подвергается сдвига потока (4 Дин/см2). Клетки были автоматически отслеживаются с MTrack2 и в результате трек, что файлы были обложил на фильмы миграции клеток не потока (0 Дин/см2) и (4 Дин/см2), чтобы показать распределение и форма треков (рис. 4A). Затем ячейки треков были импортированы в Ibid.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем метод для анализа миграции клеток, которые обнаружить силы сдвига потока и реагировать, не изменяя их миграции. Анализ MZBs показал, что MZBs спонтанно мигрируют на ИКАМ-1 и в присутствии потока, будет мигрировать вверх поток. В нашей предыдущей работы мы показали, что MZBs не переносить вверх поток VCAM-1, но вместо этого остаются зафиксированными на месте. Мышиных селезенки маргинальной зоне содержит главным образом ИКАМ-1, а красная мякоть ИКАМ-1 и VCAM-1. Из этих данных можно сделать вывод, что MZB.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантов от «Deutsche Forschungsgemeinschaft» SFB 854/TP11 K.-д.ф.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Сетчатый фильтр VWR, 70 & микро; m | VWR | 10199-656 | |
| Фильтры предварительной сепарации, 30 & микро; m | Miltenyi | 130-095-823 | |
| MZB и FOB набор для изоляции клеток | Miltenyi | 130-100-366 | |
| B220 CD45R, клон RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 | |
| CD21 / CD 35, клон 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 | |
| CD23, клон B3B4, PE | Biolegend | 101608 | |
| HBSS | Biochrom | L2035 | |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 | |
| BSA альбумин фракция V, без жирных кислот | Roth | "0052.3" | |
| ICAM-1 | R& D Systems | 796-IC-050 | |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, гидрофобный, без покрытия | Ibidi | 80601 | |
| Перфузионный набор, белый, 50 см, 0.8 мм | Ibidi | 10963 | |
| Ibidi Насосная система | Ibidi | 10902 |
Ссылки
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
