Методическая статья

Использование бактериальных патогенов чтобы зонд для сотовых и организмический уровне принимающей ответов

DOI:

10.3791/58775

⸱

22 февраля 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы опишем, как анализы в vitro и in vivo инфекции, которые могут использоваться для анализа деятельности хост кодирования факторов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует целый ряд стратегий, которые используют бактериальных патогенов выжить и размножаться раз внутри эукариотической клетки. Так называемые «цитозольной» патогенов (Listeria monocytogenes, шигеллам Флекснера, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisи риккетсии spp.) получить доступ к зараженной клетки цитозоле физически и ферментативно унижающего достоинство первичной вакуолярной мембраны. Однажды в цитозоле, этих патогенов как размножаться, так и создания достаточной механических сил, чтобы проникнуть плазматической мембраны клетки-хозяина, чтобы инфицировать новые клетки. Здесь мы покажем, как этот терминал шаг цикла сотовой инфекции моноцитогенес л (Lm) может быть определена количественно, образуя колонии подразделение анализов и проточной цитометрии и привести примеры как оба возбудителя и хост кодировке факторов воздействия, это процесс. Мы также показывают, тесная связь Lm инфекции динамики культивируемых клеток, инфицированных в пробирке и тех клеток печени, производные от мышей инфицированных в естественных условиях. Эти функции на основе анализов относительно просты и могут быть легко масштабируются для обнаружения на основе экранов высокой пропускной способностью для модуляторы функции эукариотических клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекции на основе экспериментальной модели изначально сложным вследствие их зависимости от начального состояния узла и возбудителя, различные стратегии возбудителя инфекции и трудности приписывая возбудителя и хост-процессов на основе результатов. Бактерией листерий (Lm) стал идеальным патогена на зонд узла обороны ответы из-за его генетических и микробиологических уступчивость, его стратегии быстрого и processive клеточных инфекции и относительно ясно связь между своей сотовой и организмический уровень инфекции фенотипов. Клеточных инфекции Lm проходит через четыре этапа1: (i) сотовых вторжения, которое заключает с Lm заключены в вакуоль; (ii) Lm-растворение мембраны вакуоль и выпуска Lm в цитозоль; (iii) intracytosolic репликации; и (iv) физического проникновения плазматической мембраны, что приводит либо инфекции непосредственно смежных ячеек (например, эпителиальные лист) или, в одиночных клетках, выпуск Lm в внеклеточной окружение. Каждый из этих этапов способствует конкретным Lm-кодировке факторов (упоминаемые как «факторы вирулентности»), при удалении, вызвать инфекции дефекты в клеточном и животных моделях. Эта стратегия общие инфекции независимо претерпела ряд так называемых «цитозольной» патогенов2.

Колония формирование подразделения (CFU) анализы широко используются для оценки как в лабораторных условиях (т.е., сотовой) также как в естественных условиях (т.е., гештальтпсихология) исходы инфекции. В дополнение к их высокая чувствительность, особенно для в-vivo инфекций CFU анализов обеспечивают недвусмысленный индикации возбудителя вторжение и внутриклеточных выживания/распространения. КОЕ анализы широко использовались для анализа Lm и принимающей ячейки определяющих влияние инфекции. Как информативным, как эти предыдущие исследования были анализировать сотовой вторжения и intracytosolic репликации, кое анализов не, в меру наших знаний, были использованы для отслеживания четвертый этап процесса инфекции Lm : сотовой побег. Здесь мы описываем относительно простые средства как сотовой побега (именуемый в дальнейшем «появление») могут контролироваться пробирного CFU (а также проточной цитометрии) и показать примеры как оба возбудителя и хост кодировке факторов регулировать этот этап лм цикл инфекции. Анализ терминала фазы клеточного цикла Lm инфекции может сделать возможным определить дополнительные возбудителя и принимающей ячейки инфекции специфические факторы и мероприятия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышей обращались гуманно в соответствии с все соответствующие правительственные руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных из национальных институтов здравоохранения и их использовании была утверждена для этого всего исследования Университета Майами институционального ухода за животными и использование Комитета (протокол 16-053).

1. Подготовка клетки для инфекции

  1. Распространять мыши Макрофаг подобных клеток линии RAW 264.7 в среде DMEM культуры ткани СМИ с 10% сыворотки плода теленка (далее DMEM/FCS) с помощью 125 мл флакон и инкубатор культуры ткани, поддерживается на 37 °C/5% CO2.
  2. За день до инфекции, используйте скребковых ячейка удалить ячейки из расширения колбу и собирать в 15 мл колпачок Конические трубки. Центрифуга клетки на 800 x g за 10 мин, сцеживаться супернатант и приостановить Пелле клеток в 1 мл DMEM/FCS (без антибиотиков) и определяют титр, используя Горяева или счетчик автоматизированных клеток.
  3. Отрегулируйте титр 2 х 106 клеток/мл и добавьте 0,10 мл (2 x 105 клеток) скважин 48-ну тканевые культуры блюдо. Убедитесь, что суспензию клеток охватывает всю поверхность хорошо.
    1. Плита клетки в дополнительных скважин для источника позже кондиционером средств массовой информации. Также место 0,10 мл DMEM/FCS в трех дополнительных скважин в качестве «нет ячейки».
  4. Инкубируйте на ночь в инкубатор культуры ткани на 37 °C/5% CO2. Следующий день, не удаляйте из инкубатора до тех пор, пока бактерии посевным материалом, подготовлен и готов к использованию.

2. Подготовка листерий (Lm) для инфекции

  1. Прививать 2 мл настоя мозга сердце (BHI) с одной колонии от пластины свежего прожилками агар (< 2 дней) из лм и инкубировать на ночь при 37 ° C при встряхивании в 130 вращ. / мин.
  2. Следующий день, добавьте 0,10 мл ночь культуры до 2 мл предварительно разогретую BHI и продолжить инкубации при 37 ° C с тряски до тех пор, пока оптической плотности (600OD) составляет 0,4 и 0,6.
  3. Определите приблизительное бактериальных титр, с помощью формулы эмпирически производного преобразования. В нашей лаборатории, экспоненциально растущего культура Lm в BHI находится примерно 1.3 x 109 колонии, образуя единиц (CFU) / OD600. Свести к минимуму количество времени, бактериальных культурах подвергаются до комнатной температуры.
  4. Просто до инфекции Отрегулируйте титр 5 x 107 кое/мл, используя подогретым DMEM/FCS в качестве разбавителя.

3. инфекции

  1. Работает быстро и точно, 20 мкл (1 х 106 CFU; кратности инфекции, MOI = 5) из свежеприготовленных Lm посевным материалом (шаг 2.4 выше) для скважин, слегка наклоняя блюдо и тщательно размещение наконечник пипетки в вышележащих СМИ;
    Примечание: не касайтесь стен скважины с кончиком пипетки.
  2. Аккуратно накапайте содержимое каждой скважины для обеспечения завершения смешивания; не поколебать или значительно наклона пластины, как это будет распространяться Lm на стены колодца. Возвращение клетки культуры блюдо в 37 °C/5% CO2 инкубатора.
  3. Приготовляют раствор гентамицина 10 мкг/мл, с использованием кондиционированного СМИ от неинфицированных скважин как разбавителя.
  4. На 30 минут пост инфекции (mpi), тщательно добавить 30 мкл раствора гентамицина (конечная концентрация 2,5 мкг/мл) и аккуратно накапайте содержимое также раньше и возвращения клетки культуры блюдо 37 °C/5% CO2 инкубатора.
  5. На 60 mpi урожай соответствующие скважин для пробирного CFU (60 mpi время точка) или анализ ТСМ (как описано ниже в разделах 4 и 5, соответственно).
  6. Для остальных скважин в разное время после этого либо урожай клетки, как раньше, или, для assay появление Lm , полностью удалить СМИ из скважины и заменить 150 мкл гентамицин свободный кондиционером средств массовой информации.

4. отбор, обработка и анализ Lm внутриклеточные и возникающим в CFU Assay

  1. Урожай, слегка наклоните блюдо и тщательно удалить весь носитель из колодца. Добавьте 0,50 мл стерильной дистиллированной воды (dsH2O) в колодец. После 30 сек, передачи результате lysate воды (100) пробки microcentrifuge 1,5 мл и вихревой энергично для 10 s.
  2. Подготовка 10-1 и 10-2 разведений путем добавления либо 4.5 мкл или 50 мкл воды lysate 450 мкл dsH2O и кратко Вортекс для обеспечения тщательного перемешивания.
  3. Распространения 50 мкл 100, 10-1 или 10-2 образцов на lysogeny плиты агара в бульон (LB).
  4. Проба для эмерджентных Lm (шаг 3,6 выше), удалить 10 мкл наложение СМИ и разделить его на два 5 мкл аликвоты: для одной Алиготе добавить 5 мкл 5 мкл DMEM/FCS и второй Алиготе DMEM/FCS, содержащий 5 мкг/мл гентамицина. Последний элемент управления различает внеклеточного Lm (гентамицин чувствительных) и внутриклеточных Lm (гентамицин устойчив) в последующих CFU пробирного.
  5. После 5 минут при комнатной температуре добавьте 90 мкл dsH2O, вихревой энергично для 10 s и распространение 50 мкл на плитах агара фунтов.
  6. Перечисление Lm колоний на плитах агара фунтов после 2 дней инкубации при температуре 37 ° C.

5. отбор, обработка и анализ Lm внутриклеточные и возникающим подачей Cytometry (FCM)

  1. Подготовка сырья 264.7 клетки, как описано в шагах 1.1-4. Отрегулируйте клетки до 1 x 106 клеток/мл и добавьте 1 mL (1 х 106 клеток) для скважин 6-ну тканевые культуры блюдо.
  2. Подготовить бактерия посевным материалом, как описано в шаге 2.1-2.3 и заразить клетки с объемом посевным материалом, соответствующий MOI 50 (5 x 107 кое).
  3. На 1,5 часа пост инфекции (hpi) сбор средств массовой информации из первого набора скважин и место в 1,5 мл microcentrifuge трубка с 500 мкл параформальдегида 4% (PFA) и место на льду, пока не будут обработаны все скважины.
  4. Для сбора внутриклеточных Lm, добавьте 1 mL dsH2O колодец и после 60 s, передать результирующее воды lysate пробки microcentrifuge 1,5 мл с 500 мкл 4% PFA. Вихрь энергично для 10 s и место на льду, пока не будут обработаны все скважины. (Образец обработки описано в шаге 5.8 ниже.)
  5. Для остальных скважин Удалите СМИ и замените 1 мл DMEM/FCS с 5 мкг/мл гентамицин убить внеклеточного Lm и оперативно вернуться клетки в инкубатор.
  6. После 30 мин (2 hpi) удалите СМИ и замените DMEM/FCS без гентамицина.
  7. После 2-4 ч (4 и 6 hpi) принять второй и третий раз очков, собирая средства массовой информации и лизатов как шаги 5.3 и 5.4.
  8. Центрифуга для трубы на 10000 x g для 7 мин удалить супернатант без тревожных Пелле.
  9. Приостановить каждой гранулы в пятнать коктейль 50 мкл 4% PFA и 15 мкл Фаллоидин. Инкубируйте трубы в темноте при температуре 4 ° C для 20 мин.
  10. После инкубации добавьте 1 mL СУИМ буфера для каждой трубки и пипетки вверх и вниз, чтобы смешать.
  11. Спин трубы на 10000 x g для 7 мин удалить супернатант без тревожных Пелле.
  12. Приостановить каждой гранулы 400 мкл буфера СУИМ для немедленного использования, или 200 мкл буфера СУИМ и 200 мкл 4% PFA если хранение для последующего анализа.
  13. Выполнение примеров на проточной цитометрии и анализировать собранные данные.

6. отбор, обработка и анализ Lm колонизации и разместить ответы в печени

  1. Подготовьте Lm для инфекции, как описано в шаге 2.1-2.3.
  2. Рассчитайте необходимое количество субкультуры для желаемого титр 3 х 106 кое/мл.
  3. Просто до инфекции разбавляют количество вычисляемых бактерий с подогретым Хэнк сбалансированный соли раствора (HBSS) в окончательном объеме 1 мл. Это входной посевным материалом, который вводится в мышь.
  4. С помощью 28 G½ 100У инсулина шприца, привлечь 100 мкл (3 x 105 CFU) ввода посевным материалом и удалите любые видимые воздушные пузыри.
  5. Поместите курсор мыши (штамм C57BL/6; мужчин в возрасте от 6 до 12 недель) в холдинг сдержанность и использовать теплую воду (не более 45 ° C) для расширения вен хвост, а затем придать входной посевным материалом в Вену.
  6. Пластина 10-2 и 10-3 разведений ввода посевным материалом на LB агар 10bcm пластин и инкубировать на ночь при 37 ° C для определения фактического ввода дозы.
  7. На 18 hpi гуманно усыпить мыши (CO2 удушение следуют шейки матки дислокации) и с помощью брюшины стерильными ножницами вырезать открыть мышь для сбора лобной доли печени с помощью отдельных пар ножницы и щипчики для снаружи и внутри мыши. Место печени в 6 см Петри на льду.
  8. Печень нарезать мелкими кубиками и поместить в стеклянный флакон с магнитной перемешать бар. Добавьте 2 мл 2 мг/мл коллагеназы D воссоздана в среде DMEM без FCS. Инкубируйте флаконов при 37 ° C на магнитной мешалкой для 30−45 мин. После гомогенизации ткани, добавьте 3 мл DMEM/FCS для инактивации коллагеназы.
  9. Фильтр клетки через стрейнер ячейки 70 мкм в конической трубки, добавив больше DMEM/FCS, при необходимости.
  10. Центрифуга клетки на 800 x g окатышей на 4 ° C на 10 мин, удалить супернатант и приостановить Пелле клеток в 500 мкл буфера ACK лизируют красных кровяных клеток.
  11. Инкубируйте клетки при комнатной температуре за 5 мин в ACK буфера. Приостановите клеток в 1 мл DMEM/FCS.
  12. Центрифуга клетки на 800 x g окатышей на 4 ° C на 10 мин, удалить супернатант и приостановить в 1 мл DMEM/FCS. Затем подсчитать количество ячеек с помощью Горяева или счетчик автоматизированных клеток.
  13. Передачи 1 x 106 клеток пробки microcentrifuge 1,5 мл и спина в гранулах. Затем приостановите в 1 мл dsH2O и вихревой Лизируйте клетки. Пластины 50 мкл на ФУНТ пластин в неразбавленном и 10-2 разведений и инкубировать при 37 ° C для перечисления Lm CFU анализа.
  14. Передача 1 х 106 клеток в СУИМ трубы для каждого образца ткани согласно клеток и мыть с 1 мл буфера СУИМ.
  15. Центрифуга клетки на 800 x g окатышей на 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант.
  16. Подготовка антител коктейль, содержащий антитела интерес, на основе рекомендуемая концентрация для каждого антитела и СУИМ буфера. Смотрите Таблицу материалы для рекомендованных сумм, используемых в анализе.
  17. Приостановить Пелле в 100 мкл антител коктейль и инкубировать и трубы в темноте при температуре 4 ° C за 30 мин.
  18. После инкубации добавить 2 мл буфера СУИМ в каждую пробирку и приостановить клетки.
  19. Центрифуга клетки на 800 x g пеллет при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Затем приостановить гранулы 400 мкл буфера СУИМ для немедленного использования, или 200 мкл буфера СУИМ и 200 мкл 4% PFA если хранение для последующего.
  20. Анализировать клетки подачей cytometry (см. шаг 5.13).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка роли возбудителя и хост кодировке факторов, влияющих на клеточном инфекции
Используя описанные выше условия инфекции, 0,15% от входного одичал типа Lm восстанавливается после 1,5 h совместно инкубации с искусственного макрофагов (рис. 1А). В последующие 1,5 h совместно инкубации (3 h пост инфекции, hpi) 4-кратное увеличение восстановления жизнеспособной Lm и от 3 до 6 hpi было увеличение дополнител...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Из-за его быстрого и processive клеточных инфекции программа Lm является идеальным возбудителя зонда клеточной деятельности, влияющих инфекции. Были определены ряд принимающих факторов, положительно или отрицательно влияют на Lm сотовой инфекции11,12,,1314. Два таких принимающей факторы характерны в нашей лаборатории, Перфорины-2 и АБС битор регулируется гема (P2 и Привет), ре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ACK Лизирующий буферGibco 
Бусины для компенсации аминов ArC Life TechnologiesA10346
BHI (Brain Heart Infusion) бульонEMD Milipore110493
Cell Strainer, 70 & микро; mVWR10199-656
Коллагеназа DRoche11088858001
DMEM media Gibco 11965-092
Трубы FACS BD Falcon352054
FBS - Термоинактивный Sigma-AldrichF4135-500ML
Хэнкс Сбалансированный солевой растворSigma-AldrichH6648-6X500ML
LB агарGrow Cells MSMBPE-4040
LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания желтых мертвых клеток Life TechnologiesL349S9
Родамин фаллоидин Спектральный
SP6800
MIDSCITP92048
TPP Tissue Culture, 6-луночные планшеты MIDSCITP92406
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42
Antigen
CD11b БиолегендаФлурохром = ПЭ Cy5, Разведение = 1/100, Клонирование = M1/70
CD11CБиолегендаФлурохром = AF 647, Разведение = 1/100, Клонирование = N418
CD45БиолегендаФлурохром = APC Cy7, Разведение = 1/100, Клонирование = 30-F11
F4/80БиолегендаФлурохром = ПЭ, Разведение = 1/100, Клонирование = BM8
Живой/МертвыйИнвитрогенФлурохром = AmCyN, разведение = 1/100
Ly6CBiolegendФлурохром = PacBlue, разведение = 1/200, клонирование = HK1.4
MHC IIBiolegendфлурохром = AF 700, разведение = 1/200, клонирование = M5/114.15.2
NK 1.1BiolegendФлурохром = BV 605, разведение = 1/100, клонирование = PK136
A1049201 анализатор Thermo Fischer R415 Sony Шприц 28 г 1/2" 1cc BD 329461 TPP Культура тканей 48 лунок Планшеты 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
  2. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
  3. Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
  4. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
  5. Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
  6. Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
  7. Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085(2018).
  8. Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
  9. Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
  10. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
  11. Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  12. Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
  13. Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
  14. Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
  15. Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754(2013).
  16. Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707(2018).
  17. Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734(2017).
  18. VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Listeria monocytogenes

Похожие статьи