Методическая статья

Подготовка ритмично активные в Vitro неонатальной грызунов ствола мозга-спинного мозга и тонкий ломтик

DOI:

10.3791/58870

⸱

23 марта 2019 г.

 ,  ,  , 
1Center for Perinatal Biology, Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 2Department of Biology, The College of New Jersey, 3Department of Neurosurgery, Loma Linda University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол как визуально общается спинного мозга подготовки и разъясняет подготовку ствола мозга поперечных срезов всеобъемлющим образом шаг за шагом. Он был разработан для увеличения воспроизводимость и повысить вероятность получения жизнеспособных, длительное, ритмично активные фрагменты для записи нейронной вывода из дыхательных регионов мозга.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У млекопитающих вдоха ритм генерируется из нейронной сети в регионе мозга называется preBötzinger комплекс (КПБ), которая производит сигнал вождения Ритмичное сокращение мышц вдоха. Ритмические нейронной активности в КПБ и в других нейронов бассейны диск мускулатура дыхания могут быть изучены с использованием различных подходов, включая комплектно нерва и поперечный срез записей. Однако опубликованных ранее методы не описал подробно процесс вскрытия спинного мозга на основе прозрачной и воспроизводимость для будущих исследований. Здесь мы представляем всеобъемлющий обзор метод, используемый для герметизации нарезать ломтиками ритмично активные ствола мозга, содержащий необходимые и достаточные нейрональных схемотехника для генерации и передачи вдоха диск. Эта работа опирается на предыдущие протоколы электрофизиологии спинного мозга для повышения вероятности надежно получения жизнеспособных и ритмично активные фрагменты записи нейронов выходного от КПБ, подъязычного премоторной нейронов (XII ПМН), и подъязычный двигательных нейронов (XII MN). Работы, представленные расширяет предыдущий опубликованные методы, предоставляя подробный, шаг за шагом иллюстрации рассечения, от всего крыса щенка, в пробирке фрагмент, содержащий XII корешков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Респираторные нейронной сети мозга обеспечивает плодородные домен для понимания общие характеристики художественной нейронных сетей. В частности интерес является в развитие новорожденных грызунов дыхание и понять, как развивается ритм дыхания. Это может быть сделано с использованием многоуровневого подхода, в том числе в vivo весь животных плетизмографии экстракорпорального комплектно нерва записи и in vitro фрагмент записи, которые содержат генератор ритм дыхания. Редукционистской в vitro en блока и фрагмент записи являются выгодным методом для использования при опрашивания механизмы за дыхательной ритмогенеза и нейронные цепи в регионе спинного мозга развивающихся грызунов. Развивающихся дыхательная система включает в себя около 40 типов клеток, характеризуется стрельбы шаблон, в том числе из Центральной дыхательных1,2. Центральный дыхательных сеть включает в себя группу ритмично активных нейронов, расположенный в ростральной вентролатеральные продолговатого1,3. Млекопитающих дыхательных ритмогенеза генерируется из autorhythmic межнейронного сети называли preBötzinger комплекс (КПБ), которая была экспериментально локализован через срез и en блока подготовки новорожденных млекопитающих спинного мозга шнуры3,4,5,6,,78. Этот регион служит аналогичную функцию в синоатриальном узле (SA) в самом сердце и создает систему вдоха сроков для привода дыхания. От КПБ вдоха ритм осуществляется в других регионах мозга (включая ядро подъязычного двигатель) и позвоночника мотор бассейнов (например, диафрагмальный двигательных нейронов, которые привод диафрагмы)9.

Ритмической активности может быть получен с помощью спинного мозга en блока препаратов или фрагментов из различных клеточных популяций, в том числе С3-С5 нервных корешков, XII нервных корешков, ядро подъязычного двигатель (XII MN), подъязычного премоторной нейронов (XII ПМН), и КПБ3,10,,1112. Хотя эти методы сбора данных успешно через несколько лабораторий, многие из протоколов не представлены таким образом, чтобы полностью воспроизводимый для новых исследователей, входящие в область. Получения жизнеспособных и ритмично активных en блока и ломтик препаратов требует острого внимания к деталям через все шаги диссекции и ломтик резки протокола. Предыдущих протоколов подробно описывают различные процедуры записи и электрофизиологии, но не хватает деталей в наиболее важной частью получения подготовки жизнеспособных ткани: выполнение процедуры вскрытия и ломтик спинного мозга.

Эффективно получение ритмично активных и жизнеспособной en блока или ломтик подготовка спинного мозга электрофизиологии записей требует все действия правильно, тщательно и быстро (как правило, вся процедура связанных здесь может быть выступал в приблизительно 30 мин.) Критические точки протокола электрофизиологии спинного мозга, которые не были ранее хорошо описаны относятся рассечение нервных корешков и нарезки процедуры на vibratome. Этот протокол является первым поэтапного визуально общаться рассечение спинного мозга для новых исследователей и экспертов в области. Этот протокол также тщательно объясняет хирургические методы, достопримечательности и другие процедуры для оказания помощи будущих исследователей в стандартизации ломтиками и комплектно препараты содержат точные схемы, желательно в каждом эксперименте. Процедуры, представленные здесь могут использоваться в крысы и мыши новорожденных щенков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующий протокол принят и утвержден институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Лома Линда университета. NIH руководящие принципы этического обращения животных идут в всех животных эксперименты, проведенные в лаборатории. Все этические стандарты были поддержаны лицами, выполняя этот протокол.

1. решения

  1. Подготовка искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО).
    1. Подготовьте свежие фаго вечером перед эксперимент в 1 Л пакетов с помощью следующих рецепт: 7.250 г NaCl (124 мм), 0.224 г KCl (3 мм), 2.100 g NaHCO3 (25 мм), 0.069 g NaH2PO4 • H2O (0,5 мм), 0,247 g MgSO4 • 7 H2 O (1,0 мм) и 5.410 g D-глюкоза (30 мм), 0,221 g CaCl2 • 2 H2O (1,5 мм). Всегда последние добавьте CaCl2 • 2 H2O.
    2. Растворите в 1 Л деионизированной воды компоненты. Мешайте в течение 20-30 мин.
    3. Измерение pH фаго и приспособиться к 7.40 ± 0,02 с использованием малых объемов (обычно < 0,5 мл) разбавляют NaOH, KOH, или HCl.
      Примечание: Подготовленные фаго может храниться в холодильнике (4 ° C, pH 7.40 ± 0,02) до трех дней, прежде чем рост бактерий влияет на жизнеспособность тканей во время эксперимента. Используйте фильтры 0,2 мкм для уменьшения загрязнения, грибков и бактерий, присутствующих в лаборатории после экспериментов может длиться до 36 ч. Для повышения эффективности фаго рецепт описал может быть расширены до 4 Л пакетов после тот же протокол и этот объем будет длиться до трех дней экспериментов.

2. Подготовка диссекции и Vibratome Рог

  1. Установите лезвие.
    1. Используйте свежие обоюдоострый лезвия для резки ткани на vibratome. Промойте лезвие с 100% этанола и ополосните деионизированной водой до резки или щелкая лезвие пополам и вставка лезвие в держатель зажима на vibratome.
    2. Измените лезвие, каждый раз, когда новый препарат ткани монтируется на vibratome для нарезки или если она врезается в парафин плиты во время нарезки. Остатки парафина сделает практически невозможным аккуратно прорезать неонатальной нервной ткани.
  2. Установите плиту парафина.
    1. Используйте любое встраивание стиль парафина. 10 g вложения средств массовой информации в тепло терпимо стекла стакан и использовать низкий тепла для плавления парафина бусы для жидкости.
    2. Добавить примерно 0,5 г порошка графита и смешать раствор тщательно и равномерно в жидкий парафин.
    3. Используйте небольшие пластиковые плиты как субстрат для парафина. Вырежьте небольшой (0,5 - 1 см толщиной и приблизительно 2 x 2 см2 широкий) кусок пластика (поликарбоната или алюминия могут также использоваться). Используйте файл машинист к царапинам канавки в пластмассу, asthis будет гарантировать, что парафин придерживается пластик.
      Примечание: Кроме того используйте подогревом 18 G подкожных игл поместить угловых отверстий в лист, чтобы обеспечить, что смесь парафина графит придерживается пластик.
    4. Использование задней аппликатор отзыв хлопок закапать смесь парафина графит на пластик, неоднократно погружением в расплавленный парафин графит смесь аппликатор, капает навозной жижи на пластиковый блок и строительство парафин Графит для приблизительно 1,5 см толщины на вершине пластик.
    5. После того, как достаточно толстый слой парафина графит смесь наносится на блок, установите блок сторону остыть и затем форма для размещения спинного мозга.

3. Вскрытие и изоляции Neuraxis

  1. Выполнение первоначального вскрытия и анестезии.
    Примечание:     животных, используемых в этом исследовании может варьируются в размерах от эмбриональных день 18 (E18) послеродового день 10-20 в мышей или крыс, начиная от E18 до послеродового день 5/6. Крыс или мышей любой деформации, лечения или пола может использоваться, в зависимости от экспериментальный дизайн. Выполните анестезии и предварительной диссекции под зонт с изофлюрановая используется (0,25 мл в камере 25 мл).
    1. Вес щенка, а затем поместите его в камеру анестезии, содержащие 0,25 мл изофлюрановая, размещены на 2 x 2 дюйма2 кусок Марли. После того, как животное достигает хирургические плоскости анестезии (Проверено на мыс пинча с без вывода рефлекс), контактный животное на чашку Петри заполнены с парафином или силиконовые эластомера.
      Примечание: Новорожденных грызуны также может быть под наркозом через cryoanesthesia13,14, изофлюрановая испарения15, или инъекции16 сбалансированы с кислородом.
    2. Место животных вентральной стороне вниз и сделать срединной разрез от позади глаз в регион среднего поясничного отдела позвоночника с числом 10 или 11 скальпель лезвие или Ножницы хирургические. Отражать кожи и decerebrate животное на уровне теменной/затылочной шва (см. Рисунок 1) и снять кожу, transecting животное ниже диафрагмы. Затем удалите оружие, резка на плечевом суставе с ножницами или скальпелем.
    3. После удаления кожи, передачи животное перфузии палату с силиконовой elastomerin дно для дальнейшего вскрытие и подготовка спинного мозга.
    4. Пузырь фаго водохранилище (сторона порт бутылка 500 мл) непрерывно с охлажденным (4 ° C, pH 7.40 ± 0,02) фаго и кислородом с смесь 95% O2 и 5% CO2 (также называемые «Карбоген»). Во время вскрытия используйте охлажденные фаго периодически очищать камеру, обеспечивая свежего кислородом фаго всей изоляции спинного мозга.
      Примечание: Красные кровяные клетки можно увидеть в оставшихся артерий и вен, и, когда достаточно кислородом, это ярко-красный.
    5. Использовать перфузии самотечный поток через НКТ и краном, чтобы периодически или постоянно perfuse ткани с кислородом Фаго (болюс тома или через капельно медленно с помощью краном, примерно 0,5 - 1,0 мл/мин). Это насыщает кислородом тканей и поддерживает ясно операционного поля.
    6. Удалите избыток жидкости, при необходимости системой вакуумного всасывания фильтрации.
    7. Выполните рассечение, с использованием рассечения микроскопа. Модель непрерывного масштабирования предпочитают позволяют тонкая настройка увеличения и позволяют оптимальной визуализации региона интерес во время каждого шага рассечение.
      Примечание: Микрохирургия инструменты рекомендуется включают в себя широкий спектр зубчатый ткани щипцы, тупой щипцы, #5 щипцы, угловой ткани щипцы, широкий спектр микро Рассекающий ножницы (Весна ножницы) и регулярные насекомых и микро Рассекающий булавки.
    8. Подвергнуть мозг через середину линии часть черепа вдоль Сагиттальный шов затем придавить отраженного клапанами с микро Рассекающий булавками и закрепление позвоночника в хвостовой конец покрытые силиконовые нижней палаты рассечение, используя 27 G иглы.
      Примечание: Остальная часть рассечение требует рассечение Микроскоп, чтобы обеспечить ясное представление о ткани и ориентиров для обеспечения максимальной вероятности получения художественной фиктивных вывода на краниальной корешками ствола мозга и корешков спинного мозга. Выполните эти шаги рассечение, с использованием средних весной ножницы или Ирис ножницы и тонкой щипцами.
  2. Оперативно передать ствол изолированных животного газированных диссекцию камеры. Место на спинной стороне ткани вверх с ростральной конца (мозга) с видом на передней камеры. PIN-код ткани на плечи и наиболее хвостовой конец спинного мозга.
    1. Сделайте середине Сагиттальный разрез через череп после париетальной шовный материал, чтобы избежать повреждения коры головного мозга и ствола мозга, лежащие в основе черепа.
      Примечание: Новорожденных костной ткани полностью не кальцинированная и является очень хрупким. Кости/ткани будет гибкой в степени, но жестче, чем окружающие соединительной и мышечной ткани.
    2. Используйте средний весной или Ирис ножницы для СНиП затылочной швы черепа, начиная в Сагиттальный шов и боков. Это создаст «закрылки» черепа, что может быть отражено и возлагали на якорь в ростральной части черепа и обеспечить некоторую стабильность в ткани (см. Рисунок 2).
    3. После отражающие череп закрылки, отрезаны от остальной части коры головного мозга, оставляя хвостовой части мозжечка (червя) относительно нетронутыми (рис. 2B).
  3. Выполняйте спинного Ламинэктомия.
    1. Удаление мышц, окружающих черепа и позвоночного столба, с помощью микро весной ножницы, щипцы. Удаление ткани вдоль спинной стороне грудной клетки, оставляя нетронутыми, грудная клетка, как это будет закреплен позже якорь ткани во время вентральной ламинэктомии, свести к минимуму вероятность повреждения спинного мозга.
    2. Тщательно СНиП прочь боковой процессов позвоночной пластинки с использованием средних весной ножницы или ножницы штраф Ирис. Отрежьте любые ткани вышележащих моста и продолговатого мозга. Червя мозжечка, Понс и начале спинного теперь будет отчетливо видна (рис. 2C).
  4. Выполните брюшной Ламинэктомия.
    1. Поверните на спинной стороне ткани и закрепить в грудной клетке и наиболее хвостового конце позвоночника. Придавить ростральной части ткани с помощью заслонки черепа (рисA).
    2. Удаление вентральной половине грудной клетки, включая грудины и все органы брюшной полости, используя же ножницы и пинцет. Вскрыть прочь мягких тканей придает грудную клетку, подвергая ребер и спинного мозга (рис. 3B).
    3. Удалите язык, пищевода, трахеи, гортани и всех других мягких тканей и мускулатура вышележащих основания черепа и позвоночника (как показано на рис. 3C).
    4. Вскрыть ткани вышележащих жесткий поддон. Определение твердого неба, найдя прямоугольной пластины кости в основании черепа с V-образной отступ на него (рис. 3C). Разрезать вдоль средней линии неба, тщательно поднять его вверх и выполнить поперечный, вырезать, чтобы удалить его (рис. 4A).
    5. Начните вентральной ламинэктомии, удалив пластинки, подвергая вентральной поверхности ствола мозга и спинного мозга от первого шейного позвонка до приблизительно грудного позвонка 7 (Т7), как показано на рисунке 4B.
    6. На этой стадии вентральных корешков будет видимым. Использование малых микро рассечение или весной ножницы, позаботьтесь, чтобы сделать отрезоки как можно ближе к пластинки и как далеко от корни происхождения на спинной мозг как можно скорее; Избегайте растяжения корни.
    7. СНиП 5-10 мм по обе стороны позвоночника на пластинки. Не режьте слишком близко к спинного мозга или в позвонков. Этот шаг позволяет удаление шейных позвонков подвергать спинного мозга. Избегайте резки корешков.
    8. СНиП корешков примерно 20-25 мм (на двусторонней основе) вдоль позвоночника (примерно, T7). Во время этой процедуры Избегайте резки в спинной мозг и манипулировать края позвонков, как показано на рисунке 4C.
    9. Удаление C1, C2 и C3 осторожно подняв ростральной краю каждого из позвонков и тесно ножниц под кость. Чем ближе к кости, что производится разрез, чем дольше корешок. Используйте крючок или изогнутые щипцы для помощи достижение крепко на каждом шейного позвонка делая сокращений (рис. 4C).
    10. После желаемой длины спинного изолирована и расчлененный от позвоночного столба, сделать поперечного раскроя для удаления спинного мозга (рис. 5A и 5 рисунокB).
  5. Удаления твердой мозговой оболочки.
    Примечание:     изолированные ствола мозга-спинного может использоваться для комплектно в пробирке записи, как было ранее описано3,7. С мозга-спинного мозга удалены от позвоночного столба чтобы обеспечить оптимальный доступ для всасывания электродов для выполнения записи от отрезока черепа и позвоночника rootles должны быть удалены Дура. Кроме того удаление Дура делает возможным чисто срез ствола мозга и получить ритмично активных тонкими ломтиками для записи в пробирке.
    1. Тщательно ПИН, изолированные спинного мозга шнур ткани спинной стороне вверх чтобы разрешить доступ к Дура, окружающих черепной rootles (рис. 5B). Штифты должен применяться через боковые поля ствола мозга, Ростральные XII корешков.
    2. Снимите дура от дорсальной поверхности ствола мозга, подняв дура с тонкой щипцами (#5) на спинной маржа Дура и отрезать от бокового к медиальному по всей длине ствола мозга с тонкой весной ножницами. Будьте осторожны избежать резки в ствол головного мозга, сам. Аккуратно поднимите кровеносных сосудов от поверхности ствола мозга и вырезать избежать препятствий vibratome лезвие при резании ствола мозга.
    3. Тщательно анализировать дура от медиальной и латеральной аспектов ствола мозга, как корешков черепных нервов проходят через Дура и легко разорвал прочь когда поднял Дура. Свести к минимуму вероятность корешков снял резанием осторожно вокруг них с небольшой весной ножницами.
    4. Флип спинного мозга, так что вентральной поверхности обращена вверх и черепной корешков, четко видны. Вскрыть дура от спинной стороне ствола мозга, осторожно подняв Дура непосредственно через район postrema, резка с ростральной хвостовой. Postrema области появится слегка розовый из-за большого количества microcapillaries, perfusing этот регион.
    5. Используйте штраф насекомых ПИН для дразнить прочь любые оставшиеся Дура и удалить оставшиеся кровеносных сосудов в непосредственной близости от головы и шейки матки корешков.

4. slice протокол

  1. После удаления Дура, место ствола мозга в центре платформы парафина на пластиковый блок (в дальнейшем именуемый «режущий блок»). Штифт хвостовой конец ствола мозга через дистальной спинной мозг с помощью тонкой насекомых контакты, которые были сокращены до не более чем 1 см в длину, как показано на рис. 5C.
  2. Выровняйте парафин охватывает резки блок с закрепленного ствола мозга в держатель блока vibratome так, что лезвие отрубы перпендикулярно на Ростральных лицо ствола мозга.
  3. Сделайте первоначальный срез удалить неравномерным, посторонние ткани на конце ростральной большинство. Этот первоначальный разрез может быть, 200-300 мкм обычно, но тщательно избегать удаления IX, X и XII черепной корешков. Этот шаг обычно покажет хвостового степени лица ядра (VII) и Языкоглоточного корешков и делает возможным согласовать ствола мозга, таким образом, чтобы его лицо пар плоские vibratome лезвие. Сделать небольшие изменения при необходимости обеспечить пар плоскостность и сделать небольшие разрезы для удаления тканей, что является неравномерным.
    Примечание: Корешков Языкоглоточного (IX) будет отображаться на краю бокового ствола мозга, как одно режет каждый последовательных фрагментов, и они обеспечивают ориентир для rostro хвостового расстояние до ствола мозга нейронной схемы, необходимые для ритм поколения. На вентральной стороне ствола мозга, подъязычного Корешков (XII) также должны быть видны слегка хвостового вырезать лицо, показаны IX корешков. Окончательный ориентир будет obex (точка в на котором четвертого желудочка сужает стать Центральный канал спинного мозга человека) на спинной стороне ствола мозга. С этими тремя точками отсчета видно, правильный секущей плоскости создан (см. Рисунок 6A) и ритмично активный срез будет надежно получено.
  4. Продолжайте резки ростральной в хвостовой до IX корешков находятся вблизи поверхности вырезать лица ствола мозга.
  5. Обратитесь к рис для памятников и правильной ориентации. Отрегулируйте парафин плиты в зажим vibratome, так что следующий угол перерезка создаст фигуру весьма незначительные «клина» на вырезать фрагмент и нарезать ломтиками примерно 100-200 мкм до тех пор, пока достопримечательности описаны может быть хорошо видно(рис. 6).
    Примечание: Этот небольшой клин увеличивает количество XII двигательных нейронов, захвачен в срез и максимизирует вероятность получения ритмической активности во время записи. С помощью ориентиров описано (Ростральные корешков от Языкоглоточного нерва расслоение, корешков от подъязычный нерв расслоение, obex) будет гарантировать, что срез можно воспроизвести содержит по крайней мере большая часть КПБ (Рисунок 6B).
  6. Вырезать 300-500 мкм срез ствола мозга от этих ростральной нейроанатомический маркеров для захвата КПБ и связанные цепи передачи.
    Примечание: «Идеальный» фрагмент будет содержать наиболее ростральной корешок подъязычный корешок расслоение надежно получить вдоха деятельность не прибегая к поверхности записи с помощью всасывания электрод через ритм генерации/передачи локусов в пределах ствола мозга.

5. запись процедуры

  1. Место среза в камере запись, постоянно perfuse с Фаго (0,5 - 1,0 мл/мин) и использовать всасывания или внеклеточная электродов для активности записи населения от XII корешков или от КПБ, XII ПНЛ или XII мотонейронов. Для процедур подробные записи смотрите предыдущие публикации по электрофизиологии спинного мозга и патч зажима10,11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленные здесь метод позволяет исследователь заинтересован в получении ритмично активные срезы мозга можно воспроизвести и надежно отрезать кусочек жизнеспособной, надежный, которые позволят запись фиктивных мощность двигателя для многих часов. Все элементов минимально необходимые нейронных цепей для генерации и передачи вдоха ритма могут быть захвачены в тонкий ломтик с помощью этого метода. Эти элементы включают в себя: preBötzinger комплекс, премоторной нейронов, проектирование п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Адаптация протокола представлены здесь в en блока или ломтик рабочего процесса является выгодным для лабораторий и исследования, которые хотели бы использовать либо комплектно ствола мозга-спинного мозга и/или тонкий ломтик подготовка к записи электрофизиологии. Метод вскрытия и ломтик представил, в сочетании с методами сообщалось ранее другими17,18,19, позволит воспроизводимые подготовки надежной и жизнеспособной ткани, которая...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.B.P является получателем Лома Линда университета летом Бакалавриат стипендии для проведения исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NaClFisher ScientificS271-500
KClSigma AldrichP5405-1KG
NaHCO3Fisher ScientificBP328-1
2PO4 • H2OSigma AldrchS9638-25G
CaCl2• 2H2OSigma AldrichC7902-500G
MgSO4• 7H2OSigma AldrichM7774-500G
D-глюкозаSigma AldrichG8270-1KG
Источник холодного света Галогенная лампа 150 ВтAmScopeH2L50-AY
Диссекционный микроскопLeicaM-60
Vibratome 1000 PlusVibratomeW3 69-0353
Магнитное основаниеKaneticMB-B-DG6C
Изофлуран, USPPatterson VeterinaryNDC 14043-704-06
Меч Классические двулезвийные лезвияWilkinson97573
HistoclearSigma-AldrichH2779
Dumont #5 Тонкие щипцыFine Science Tools11254-20
Dumont #5/45 ЩипцыFine Science Tools11251-35
Лезвия скальпеля # 10Fine Science Tools10010-00
Scalpel Handel # 3Fine Science Tools10003-12
Пружинные ножницы прямые Fine Science Tools15024-10
Узкий узор Щипцы зубчатые/прямыеFine Science Инструменты11002-12
Castroviejo Микродиссекционные пружинные ножницы; Прямыеножницы RobozRS-5650
Vannas 3" изогнутыеRobozRS-5621
Булавки от насекомых, 0Инструменты для тонкой науки/884060426000-35 
Булавки от насекомых, 0, SSFine Science Tools26001-35
Булавки от насекомых, 00Fine Science Tools26000-30
Pins от насекомых, 00, SSFine Science Tools26001-30
Pins от насекомых, 000Fine Science Tools26000-25
Pins от насекомых, 000, SSFine Science Tools26001-25
Minutien булавки, 0,10 ммFine Science Tools26002-10
Мелкие булавки, 0,15 ммFine Science Tools26002-15
Мелкие булавки, 0,2 ммFine Science Tools26002-20
Fisher Tissue prep Parafin рыбакT56-5
Графит Рыбак G67-500
Делрин Пластик Игла3HMT2
18 калибраBD305195
для подкожных инъекций Grainger

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
  2. Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6(2000).
  3. Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
  4. Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
  5. Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
  6. Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
  7. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
  8. Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
  9. Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113(2000).
  10. Rousseau, J. -P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071(2015).
  11. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
  12. Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
  13. Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
  14. Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
  15. Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
  16. Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
  17. Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
  18. Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
  19. Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
  20. Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
  21. Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
  22. Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
  23. Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
  24. Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
  25. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (1997).
  26. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PreB tzinger

Похожие статьи