Method Article

Авторадиографии как простой и мощный метод для визуализации и характеристика фармакологического целей

DOI:

10.3791/58879

⸱

March 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методом авторадиографии обычно используется для изучения привязки radioligands в разделах ткани для определения качественных или количественных фармакологии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В vitro авторадиографии стремится визуализации анатомического распределения протеин интереса в ткани экспериментальных животных, а также людей. Метод основан на конкретной привязки лиганд своей биологической цели. Таким образом замороженные ткани секции инкубируют с решением лиганд, и привязки к целевому впоследствии локализуется путем обнаружения радиоактивного распада, например, с помощью светочувствительной пленки или фосфора изображений пластины. Результате цифровой autoradiograms отображения замечательные пространственного разрешения, который позволяет количественной и локализации лиганд привязки в различных анатомических структур. Кроме того количественная оценка позволяет фармакологическая характеристика сродство лиганда с помощью константы диссоциации (dK), константы ингибирования (Kя), а также плотность сайтов связывания (BМакс) в отдельных тканях. Таким образом метод предоставляет сведения о локализации целевого и лигандом избирательности. Здесь техника проявляется с autoradiographic характеристика высокоспецифичные гамма-оксимасляная кислота (ГОМК) привязки сайтов в ткани мозга млекопитающих, с особым упором на методологические соображения относительно привязки пробирного параметры, выбор лиганд и метод обнаружения.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторадиографии — это метод, который предоставляет изображения радиоактивного распада. Метод обычно используется для изучения распределения ткани протеина интереса в vitro на основе конкретных фармакологических взаимодействия между радиоизотопами соединения и его цель. Это обеспечивает прямую информацию о избирательность лигандом для целевого объекта. Радиоавтографией в пробирке может также использоваться для количественного определения фармакологических привязки параметров radioligands, таких как Константа диссоциации (dK) и плотности сайтов связывания (BМакс), а также для определения Ингибирование константа (iK) конкурирующих лигандов1,2. По сравнению с традиционными огневки лиганд привязки, радиоавтография имеет преимущество возможность визуализировать пространственных анатомии и кратким указанием региональных выражение модели3. Методом авторадиографии является поэтому соответствующие альтернативы immunocytochemistry, особенно в отсутствие проверенных антитела. Авторадиографии легко реализуется в стандартной радиоизотопной лаборатории, при условии наличия подходящего лиганд с необходимые фармакологических специфичность, доступ к микротом криостат для подготовки разделов ткани и подходящих изображений устройство, которое имеет возможность анализа распределения радиоактивности в разделах соответствующие ткани. В частности важным критерием отбора для лиганд является ограниченное количество привязки на сайты, не являющиеся объектом. Это может быть другие белки, мембраны или такие материалы, как пластик или фильтры и коллективно называется неспецифичный привязки. Обычно неспецифичный привязки не конденсаторе, но может быть конденсаторе, если она включает в себя конкретные-целевого белка. Лучший способ проверки истинный конкретной привязки является для сравнения тканей, генетически не хватает целевого объекта, например, инженерии тканей (нокаут)4.

Здесь методология иллюстрируется с autoradiographic характеристика высокоспецифичные связывающие сайта для γ-оксимасляная кислота (ГОМК) в мозге млекопитающих. Понимание фармакологических взаимодействия между ГОМК и его привязки сайта имеет значение как ГОМК снадобье как клинически полезным в лечении нарколепсии и алкоголизма5, но также природных составляющих млекопитающих мозга и отдыха наркотиками6. Высокоспецифичные ГОМК привязки сайтов впервые были описаны с помощью [3H] ГОМК привязки для мозга крысы огневки7. С годами, дальнейших исследований авторадиографии с [3H] ГОМК и аналог [3H] NCS-382 показал высокую плотность привязки сайтов в регионах мозга крысы8,9,10, мыши9 , свинья11и обезьяна/человеческий мозг12. Однако молекулярной идентификации и точное функциональные актуальность этих сайтов связывания остаются недостижимой.

С намерением для дальнейшей характеризации привязки сайтов и для облегчения исследования о физиологической роли ГОМК, были разработаны несколько radioligands включения различных изотопов, наделенных различными сходство ([3H] ГОМК, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA и [125я] BnOPh-GHB)13,14,,1516(обзор в17) (рис . 1). Сочетание выборочного высокоспецифичные radioligands и ткани очень высокой плотности привязки сайтов, позволили для производства высококачественных изображений с использованием люминофора, изображений техники9,11. Наряду с изложение практических точек в создании эксперимент autoradiographic и иллюстрации иллюстрируют детали в разделе обсуждения особое внимание будет уделяться i) выбор радионуклидов, ii) выбор условий пробирного и iii) использование фосфора визуализации пластины по сравнению с рентгеновской пленки. Общая цель этого документа заключается в том, предоставлять технических, методологических и научных сведений по технике авторадиографии для информирования о распределении ткани и фармакологические анализа белковых мишеней.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все животные обработка была выполнена в соответствии с руководящими принципами датского инспекции экспериментов животных.

Примечание: Протокол, описанные здесь охватывает Подготовка тканей (т.е., ткани мозга мыши), в пробирке autoradiographic assay достаточно подробно для создания метода в новой лаборатории, воздействие фосфора изображений пластины, а также последующие денситометрических анализ autoradiograms (рис. 2) с целью локализации и количественного определения привязки лиганд в различных анатомических структур. Для гистологической сравнения включен протокол для количество кресил фиолетовое окрашивание. Кроме того определение неспецифической привязки с конкурирующего лиганд включен в протокол. Подробное описание о том, как определить Kd, BМакс или Kяпредыдущие публикации4см.

1. Подготовка тканей, Cryosectioning

  1. Усыпить мыши, вывих шейного и немедленно вскрыть из мозга, используя ножницы и пинцет. Непосредственно перейти к следующему шагу, чтобы избежать повреждения тканей.
  2. Snap замораживание ткани погружение в порошок сухого льда, газообразных CO2 или изопентан. Напрямую передавать замороженные ткани криостат с температурой, набор до-20 ° C. Кроме того магазин тканей в-80 ° C до обработки.
    Примечание: Избегайте повторных оттаивания/замораживания для уменьшения повреждения тканей.
  3. Пусть акклиматизироваться до-20 ° C в криостат для 20 минут перед дальнейшей обработкой чтобы избежать сокрушительное ткани ткани.
  4. Обложка держатель ткани с внедрения средой за пределами криостат и быстро место замороженные ткани образец в желаемой ориентации, в то время как средство вложения до сих пор жидкости. Например место мозга мыши вертикально на мозжечке достижения ростральной коронковой части. Передать криостата держатель ткани и разоблачить внедрения средних температур ниже-10 ° C для упрочнения.
    Примечание: Образец хрупкой ткани следует покрытием в встраивание среднего в ткани плесени до монтажа.
  5. Расположите держатель ткани в микротом криостата. Отрегулируйте ориентацию ткани, чтобы избежать наклонной секции.
  6. Вырезать ткань с руководством стереотаксического Атлас18 в разделах требуемой толщины (12 мкм, рекомендуется для [3H] помечены лигандами). Тщательно выпрямить и разворачиваться раздел с помощью кисти небольшого размера, в случае необходимости и оттепель Маунт раздел на слайд микроскопа. Последовательно Соберите разделы из региона интерес для требуемой технической репликации (например, 4 секции на слайд).
  7. Разрешить разделы на слайдах высохнуть за 1 ч до дальнейшей обработки.
    Примечание: Добавление осушитель материала слайд коробки минимизирует накопление влаги на разделах ткани. Протокол может быть приостановлена здесь путем хранения секции долгосрочный в слайд коробки-80 ° c.

2. радиоавтографией в пробирке

Предупреждение: радиоактивность. Работа в сертифицированной лаборатории согласно местным нормативам. Носите защитную одежду. Распоряжаться в соответствии с радиоактивного распада или аутсорсинг сертифицированной компании.

  1. Оттепель в разделах по крайней мере 30 минут при комнатной температуре (RT). Ярлык слайды с экспериментальных условий. Используйте карандаш, потому что слайды будет купались в этиловом спирте в течение последующего окрашивания.
  2. Место слайды по горизонтали в лотки.
    Примечание: Позиционирование слайды на повышенных платформа в лотки облегчает их обработки.
  3. Предварительно incubate разделы, установленный на слайды в assay buffer регулируется целевой вопрос (для используется протокол ГОМК, 50 мм KHPO4 буфера рН 6,0) тщательно применения соответствующего тома на слайд (700 мкл для грызунов коронковой части 3-4).
    Примечание: Убедитесь, что каждый раздел полностью покрыта жидкостью.
    1. Обложка пластиковые поддоны с крышкой, чтобы избежать испарения и предварительной инкубации при соответствующих температуре под постоянным нежный (20 мин) встряхивания на тарелку шейкер (для протокола ГОМК, предварительно incubate на 30 мин в RT).
    2. Для определения привязки неспецифической дополнение пробирного буфер с соответствующей концентрации комплекса немаркированных (для протокола ГОМК, 1 мм ГОМК).
      Примечание: Предварительной инкубации не может быть необходимым.
  4. Слейте жидкость предварительной инкубации из каждого слайда и передать пластиковый лоток слайды.
  5. Чтобы избежать обезвоживания, немедленно инкубировать секции с соответствующей концентрации лиганд в assay buffer желаемых условиях (для протокола ГОМК, 1 Нм [3H] HOCPCA за 1 час на RT), покрывая секций полностью с лиганд решение (700 мкл для грызунов коронковой части 3-4).
    1. Инкубируйте под под постоянным нежный (20 мин) пожимая пластиковых лотков с закрытой крышкой.
      Примечание: Концентрация лиганд может быть проверен путем подсчета Алиготе в жидких сцинтилляционный счетчик.
  6. Удаление решения инкубации, поливая жидкости и передавать слайды в стойку слайд микроскопа. Немедленно приступить к следующему шагу, чтобы избежать обезвоживания секции.
  7. Вымойте слайды. Для протокола ГОМК мыть с ледяной пробирного буфер дважды для 20 s и затем промойте дважды погружением слайд стойку в лотки с ледяной дистиллированной водой для удаления солей. Расположите слайды вертикально в стойки для воздушной сушки для по крайней мере 1 час на RT или сухой слайды для 5 мин с вентилятором значение холодной температуры.
    Примечание: Стиральная должны быть оптимизированы, например, обширные Стиральная может быть полезным для уменьшения неспецифической привязки.
  8. Передавать слайды фиксатором, содержащие порошок параформальдегида (PFA) для фиксации ночь с парами ПФА в RT для того, чтобы защитить целостность комплекса лиганд цели.
    Предупреждение: PFA является токсичным. Positionthe фиксатором в дыма капот и Избегайте контакта кожи глаз с PFA.
  9. Следующий день, передавать слайды в эксикатор окно, содержащее силикагель для 3 h на RT для ликвидации влаги.

3. воздействие фосфора изображений пластины и сканирование

  1. Поместите эти разделы в кассету излучения экранированный изображений пластины с ткани, обращенной вверх. Для последующих количественного определения привязки лиганд включают микромасштабной [3H] в каждую кассету. Случайным образом организовать разделы и разоблачить разделы для прямого сравнения в том же кассету.
  2. Стереть трития чувствительных светомассы изображений пластины непосредственно перед использованием для удаления накопленных сигналы от хранения и ликвидации фон сигналов. Таким образом загрузить пластину в люминофор изображения машины и подвергнуть его видимый/инфракрасный свет согласно инструкциям производителя.
  3. Снять пластину из люминофора изображений машины и сразу же поместить его на разделы в кассету. Убедитесь, что кассета закрыт полностью. Разоблачить разделы светомассы изображений пластины для 3 дней на RT, защищены от света.
  4. Потому что свет стирает сигнал от изображений знака, тщательно открыть кассету в темноте и немедленно передачи изображений пластины в темной коробке тепловизор фосфора или место тепловизор фосфора в темной комнате.
    Примечание: Убедитесь, что для обозначения пространственное расположение слайды во время экспозиции для выявления отдельных образцов на цифровое изображение после анализа. Таким образом фосфора изображений пластины также отображать один угол, сократить в собственный угол для того, чтобы определить правильную ориентацию пластину на цифровой фотографии.
  5. Сканировать пластину с высоким разрешением можно получить цифровое изображение.

4. Дополнительно: Количество кресил фиолетовое окрашивание участков ткани

  1. Приготовляют раствор 1% количество кресил фиолетовый путем смешивания 5 g количество кресил фиолетовый ацетата в 500 мл деонизированной воды (dH2O) пока растворится (около 2 ч). Фильтрация через фильтровальную бумагу, используя воронку в новая бутылка 500 мл. Отрегулируйте пэ-аш до 3,5-3,8.
  2. Положение слайд пятнать устанавливается под зонт. Подготовьте лотки с указанными ниже решениями в белые полипропиленовые лотки (за исключением ксилол):
    а. 50% ethanol/50% dH2O
    b. 70% ethanol/30% dH2O
    c. 100% этанола
    d. 100% этанола
    е. 100% dH2O
    f. 1% количество кресил фиолетовый
    g. 0,07% уксусной кислоты (мкл 175 уксусной кислоты 250 мл dH2O).
    h. 100% ксилола в зеленых растворителя устойчивые поддоны
    i. 100% ксилола в зеленых растворителя устойчивые поддоны
  3. Перенести слайды для Зонта и поместить их в шкаф слайд.
  4. Растворяются липиды путем увеличения градуированных серии этанола в dH2O в 100% этанола (лоток a-d), опуская слайды за 1 мин.
  5. Увлажняет образцов для dH2O по убыванию концентрации этанола (лоток a-d в обратном порядке, следуют e лоток), опуская слайды за 1 мин.
  6. Погружайте образцов в растворе количество кресил фиолетовый за 10 мин.
  7. Промывайте образцы в 0,07% уксусная кислота, подняв слайды вверх и вниз осторожно для 4-8 s. мыть слайды путем погружения в dH2O за 1 мин.
  8. Обезвоживает образцы путем погружения слайды для 30 s в порядке возрастания концентрации этанола (лоток a-d).
  9. Передача образцов через два лотка 100% ксилола (лоток h и i), чтобы утолить этанола.
  10. Увлажняет образцов для dH2O по убыванию концентрации этанола (лоток a-d в обратном порядке, следуют e лоток), опуская слайды за 1 мин.
  11. Удалите слайды из солевых пинцетом. Добавить несколько капель органического растворителя монтажа СМИ на слайд и добавить coverslip 24 x 60 мм сверху защищать образцов. Удаление пузырьков воздуха между образцом и coverslip, осторожно нажав на coverslip.
    Примечание: Держите остальные слайды в ксилоле во время монтажа для предотвращения высыхания.
  12. Сухой слайды на ночь в Зонта на RT.
  13. Получите изображение образца с микроскопом и 1,25 X цели.

5. денситометрических анализ цифровых изображений

  1. Измерить относительную оптических плотностей (стержни) каждой калибровки стандартных от микромасштабной [3H] с помощью программного обеспечения анализа изображения.
    1. Выберите область одинакового размера для каждой точки микромасштабной [3H], с помощью инструмента для создания региона от элемента меню региона решимость. Присвойте номер каждой выбранной области, нажав на номер пункта меню метки.
    2. Экспортировать ОД значения для каждой точки калибровки стандартных, нажав файл | E xport | 2D региона доклад. Передача значения стержня в электронную таблицу и нормализовать по размеру выбранной области. Линейной регрессии для получения калибровочной кривой для дальнейшего денситометрических анализа.
      Примечание: Убедитесь, что выбранные области маркированы с целью выявления соответствия значения стержня и образцы.
  2. Выполняют количественной оценки autoradiograms, используя собственные изображения программное обеспечение, выбрав региона интерес (ROI) с помощью инструмента региона создание в каждой секции и измерения его ОРВ. Выберите того же региона в каждом разделе, создав шаблон для региона интерес, который копируется и вручную скорректирована с незначительными изменениями в анатомии мозга для каждого autoradiogram. Идентифицировать Анатомия ROI сравнение autoradiograms с мозга Атлас18. При сравнении нескольких лечения, анализ ослепил и рандомизированных избежание предвзятым выбор ROIs.
  3. Экспорт стержень ценностей и размеров отдельных районов в электронную таблицу, нажав файл | E xport | 2D региона доклад.
  4. Разделите измеренных стержень выбранного ROI по своей площади для получения плотность в конкретной области.
  5. Измерить стержень фоне пластины и экспорта соответствующие значения стержня и размер области в электронную таблицу. Вычитание среднего фонового сигнала от каждого стержня значения каждого ROI.
  6. Среднем стержней технических реплицирует, т.е., раздел реплицирует, используя ткани от же животное.
  7. Использование стандартной кривой для преобразования стержней в единиц лиганд привязки, т.е., nCi/мг ткани эквиваленты (TE).
    Примечание: TE термин используется потому, что стандарты создаются с материалами, имитируя ткани.
  8. Экспресс привязки путем преобразования nCi/мг нмоль/мг TE согласно удельная активность лиганд (уравнение 1).
    Формула расчета связывания лиганда, уравнение, описывающее нмоль/мг TE, актуальное для биохимического исследования.(1)
  9. Для получения конкретной привязки значений, вычтите неспецифической привязки из всего привязки.
  10. Средняя привязки каждого биологического реплицировать с помощью среднего технического реплицирует каждого животного (полученное в шаге 5.6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью описанных протокола, анатомические распределение сайтов связывания ГОМК высокоспецифичные был визуализирован с радиоизотопами ГОМК аналог [3H] HOCPCA в мозг мыши, который был сокращен на корональных, сагиттальной и горизонтальные секции (рис. 3 ). Высокий уровень привязки наблюдались в гиппокампе и коры, Нижняя привязки в полосатом теле и не был обнаружен в мозжечке, соответствующих предыдущих моделей сообщил выражение высокоспецифичные Г...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Качество autoradiographic assay чаще всего определяется чувствительность лиганд. Важным фактором является выбранный радиоизотопных, которая дается путем наличия известных лигандами или осуществимость конкретных методов маркировки приносить лигандов с соответствующей удельной активностью (то есть, количество радиоактивности на единицу моль лиганд)23и с ограниченным количеством химической деградации. Большое количество radioligands известных лигандов помечены с тритием9

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа была поддержана Фондом компании «Лундбек» (Грант R133-A12270) и Ново Нордиск Foundation (Grant NNF0C0028664). Авторы благодарят доктор Aleš Marek на поставку лиганд [3H].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Абсолютный этанолMerck Millipore107017
уксусной кислотеSigma-AldrichA6283
BAS-TR2040 Imaging PlateGE Healthcare Life Science2895648120x40 см - Чувствительный к тритию
Крезил фиолетовый ацетатSigma-AldrichC5042-10G
DPX (неводный монтажный материал для микроскопии)Merck Millipore100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 млСакура4583Ткань-Тек
ПараформальдегидСигма-Олдрич16005-1KG-R
Superfrost Плюс слайдыVWR631-9483предметные стекла микроскопа
Тканя-Тек Ручной набор для окрашивания предметного стеклаСакура Finetek Дания ApS4451
Стандарт трития на глазахАмерикан Радиомаркированные Химикаты, Инк.ART 0123
Заменитель ксилолаSigma-AldrichA5597

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AutoradiographyRadioligand BindingTissue SectioningPhosphor ImagingProtein TargetsBrain TissueBinding AssaySignal To NoiseAnatomical DistributionPharmacological Analysis

Related Articles