Методическая статья

Биоэнергетика расследование Candida albicans с помощью реального времени внеклеточного потока анализа

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58913

⸱

19 марта 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Biochemistry and Molecular Genetics, New Jersey Medical School, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Public Health Research Institute, Rutgers, The State University of New Jersey

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем поэтапного протокол митохондриальное дыхание и гликолитических функции в Candida Albicans расследовать с помощью анализатора дополнительный поток.

Аннотация

Митохондрии являются основные органеллы для клеточного метаболизма и выживания. Целый ряд ключевых событий происходят в митохондрии, например клеточного дыхания, окислительного метаболизма, сигнала и апоптоз. Следовательно митохондриальной дисфункции, как сообщается, играть важную роль в противогрибковый препарат терпимости и вирулентности патогенных грибов. Последние данные также привели к признанию важности митохондрий как важный вклад грибковых патогенеза. Несмотря на важное значение митохондрий в грибковых биологии стандартизированные методы, чтобы понять ее функции развиты плохо. Здесь мы представляем процедуру для изучения базальной кислорода расхода (OCR), мера митохондриальное дыхание и внеклеточной подкисления ставок (ECAR), мера гликолитических функции штаммов C. albicans . Метод, описанный здесь может применяться к любой Candidaspp. штаммы без необходимости очистки митохондрий от нетронутыми грибковых клеток. Кроме того, этот протокол также может быть настроен на экран ингибиторов митохондриальных функции штаммов C. albicans .

Введение

Инвазивные грибковые инфекции убить более 1,5 миллиона человек в год во всем мире. Этот номер находится на подъеме благодаря увеличению числа людей, живущих с нарушенной иммунитет, в том числе пожилых, недоношенных младенцев, пересадка получателей и раковых больных1. C. albicans является оппортунистических человека грибкового патогена, которая является частью человеческого микрофлоры. Он также обитает слизистой поверхности и желудочно-кишечного тракта как синантропных организм. C. albicans производит серьезное системное заболевание у людей, которые имеют иммунные недостатки, которые подверглись операции, или которые были обработаны с длиной курсы антибиотиков. Ранг видов Candida среди топ три-четыре причин внутрибольничных инфекционных заболеваний (NID) в люди2,3,4,5,6,7. Ежегодные глобальные количество Candida инфекций кровотока оценивается в ~ 400 000 случаев, с связанные смертности 46-75%1. Ежегодная смертность вследствие кандидоз — примерно 10 000 в одних только Соединенных Штатах. Степень NID, вызванные грибками отражена также в астрономические расходы пациента5. В Соединенных Штатах ежегодные расходы для лечения инвазивных грибковых инфекций превышает $2 млрд, добавляя огромную нагрузку на уже перегруженные системы здравоохранения. В настоящее время доступны стандартные противогрибковой терапии ограничены из-за токсичности, все более широкое распространение лекарственной устойчивости и наркотиков лекарственных взаимодействий. Таким образом существует настоятельная необходимость определить новые цели противогрибковый препарат, которые приведут к более вариантов лечения для пациентов высокого риска. Однако открытие новых препаратов, действующих на грибковые целей является сложным, потому что грибы являются эукариотами. Это значительно ограничивает количество наркотиков грибковых конкретных целей.

Недавние исследования показали, что Митохондрии являются критический вклад грибковых вирулентности и терпимости к противогрибковых препаратов, поскольку митохондрии имеют важное значение для клеточного дыхания, окислительного метаболизма, сигнала и апоптоза8 ,9,10,11. Метаболизм гликолитических и не гликолитических имеют важное значение для выживания C. albicans в млекопитающих принимающей12,13,14,,1516. Кроме того несколько мутантов C. albicans , хватает митохондриальных протеинов, таких как Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 и т.д. было показано неисправен в филаментацию, является важным вирулентности фактором C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Кроме того, эти мутанты были также продемонстрированы быть ослаблены для вирулентности в модели мыши распространение кандидоз17,18,19,20,21 ,22. Таким образом грибковых митохондрий представляют привлекательной мишенью для обнаружения наркотиков. Однако изучение митохондриальной функции в C. albicans является сложной задачей, потому что маленькая негативные23, что означает, что она не может выжить без митохондриального генома C. albicans .

Здесь мы описываем протокол, который может использоваться для изучения функции митохондрий и гликолитических в C. albicans без необходимости очистки митохондрий. Этот метод также может быть оптимизирован для исследовать влияние генетических манипуляций или химические модуляторы на митохондриальной и гликолитических путей в C. albicans.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Ниже приводится подробный поэтапный протокол assay, и схема протокол показано на рисунке 1.

1. штаммы C. albicans и условия роста

  1. Растут штаммов C. albicans в жидкой среде дрожжевой экстракт-Пептон-декстрозы (YPD) при 30 °C в шейкер инкубатор на ночь.
    Примечание: Поддерживать штаммов Candida как замороженные запасы и растут на YPD агар (экстракт дрожжей 1%, 2% Пептон, 2% декстрозы и 2% агар).

2. Подготовка реагентов

  1. Средство анализа готовят следующим образом:
    1. Для assay митохондрий Растворите 1,04 г Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 порошка и 2 г глюкозы (2%) в 90 мл стерильной воды и теплый СМИ до 37 ° C. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4, используя 5 M NaOH и составляют объем 100 мл стерильной водой.
    2. Для assay гликолитических стресс распустить 1,04 г порошка RPMI 1640 только в 90 мл стерильной воды, теплый СМИ до 37 ° C и скорректировать рН 7,4. Составляют объем 100 мл стерильной водой. RPMI 1640 порошок имеет не бикарбонат, который имеет решающее значение для мониторинга изменений рН как мера гликолиза в assay.
  2. Инъекции соединений.
    1. Подготовка запасов глюкозы 1 М в стерильной водой и хранить при температуре от-20 ° C.
    2. Подготовка 100 мм oligomycin складе диметилсульфоксида (ДМСО), аликвота в небольших объемах и хранить при температуре от-20 ° C.
    3. Подготовка 100 мм antimycin A фондовая в ДМСО, аликвота в небольших объемах и хранить при температуре от-20 ° C.
    4. Подготовьте 100 мм Шам (salicylhydroxamic кислота) акций в этанол в день анализа.
    5. Подготовка 1 M KCN в стерильной воде в день анализа.

3. покрытие пробирного пластины с поли-D-Лизин (PDL)

Примечание: Выполнить все следующие шаги в ламинарных капюшоном.

  1. Растворите поли-D лизина в культуре ткани класса воде сделать 50 мкг/мл конечная концентрация. Смешайте это хорошо и аликвота в 1,5 мл пробирок microcentrifuge и хранить при температуре от-20 ° C в долгосрочной перспективе.
    Примечание: 50 мкл на также необходим, и для 24 скважин, требуется 1,2 мл. Таким образом Алиготе по меньшей мере 1,3 мл на пробки microcentrifuge.
  2. Добавьте 50 мкл на колодец и инкубации при комнатной температуре с крышкой, покрытые для 1-2 ч.
  3. Аспирационная решение и промойте один раз 500 мкл стерильные культуры ткани класса водой.
  4. Откройте крышку и дайте высохнуть скважин для воздуха. Используйте пластину на тот же день или хранить при 4 ° C для максимум 2-3 дней.

4. гидратации датчик картриджа

Примечание: Этот шаг выполните за один день до эксперимента.

  1. Открыть дополнительный поток Assay Kit и удалять содержимое. Поместите датчик картридж вверх ногами рядом с утилита пластины (рис. 2).
  2. Заполните каждый хорошо Утилита пластины с 1 мл раствора calibrant и поместите датчик картридж обратно. Убедитесь, что датчики, которые содержат флуорофоров (для измерения кислорода и рН) погруженный в calibrant.
  3. Инкубировать датчик картридж на ночь в инкубатор-CO2 при 37 ° C.

5. рост и заполнения ячеек в PDL-покрытием пластин

  1. Прививок C. albicans в YPD бульон и расти на ночь при 30 ° C в шейкере на 200 об/мин.
    Примечание: На основе анализа дизайн и интерес, C. albicans также может быть выращен в YPG или минимальный средний.
  2. В день анализа разбавляют соответствующее количество клеток в среде пробирного произвести окончательный концентрации 100000 клеток на 100 мкл.
  3. Добавьте 100 мкл разбавленного клеток в каждой скважине пробирного плиты за исключением скважин А1, B4, C3 и D6, в котором только 100 мкл пробирного среды для коррекция фона (рис. 3).
  4. Передача пластину в инкубатор-CO2 при 37 ° C и проинкубируйте 60 мин, который позволит придерживаться поверхности клетки.

6. Протокол assay

Примечание: Протокол, изложенные здесь является для 24-ну формат документа. Тома должны быть скорректированы, если используется другой формат.

  1. Анализ митохондриальной функции
    1. Подготовка соединений
      1. Подготовить соединений на 10 x концентрации для assay митохондриальной функции: подготовить 20 мм Шам, 100 мкм Oligomycin, 100 мм KCN и 20 мкм Antimycin A в средстве соответствующего анализа.
      2. Добавьте 50 мкл Шам в порт A, 55 мкл Oligomycin в порт Б, 62 мкл KCN в порт C и 68 мкл Antimycin A в порт D (рис. 4).
  2. Пробирного гликолитических стресс
    1. Подготовка соединений
      1. Подготовьте соединений на 10 x концентрации для assay гликолитических стресс. Подготовка 100 мм глюкозы, 100 мкм Oligomycin, 500 мм 2-Deoxy глюкозы (2 ГД) и 20 мкм Antimycin в среде соответствующего анализа.
      2. Добавьте 50 мкл глюкозы в порт A, 55 мкл Oligomycin в порт Б, 62 2 мкл-DG в порт C и 68 Antimycin мкл в порт D.
  3. Использовать дополнительный поток анализатор, который измеряет скорость потребления кислорода (OCR) и скорость (ECAR) внеклеточной подкисления живых клеток в формате 24-ну пластины. Настройте протокол assay заранее.
  4. Откройте анализатор дополнительный поток и настроить пробирного шаблон, используя вкладку пробирного мастера и следуйте шаг за шагом инструкции, чтобы заполнить всю информацию, которая выскакивает во время установки. Создайте макет группы как похож на показанный на рисунке 5. Настройте протокол, как показано в таблице 1. Установите эти макеты хорошо впереди перед пробирного и сохранить на компьютере. Во время анализа восстановите сохраненный протокол, открыв соответствующий файл в параметре Открыть файл в закладке пробирного мастера (Рисунок 5).
  5. Загрузить 10 x соединений в соответствующих портах гидратированных датчик картриджа, содержащие calibrant и загружать в лоток перевозчик анализатор дополнительный поток. Старт калибровки, нажав кнопку « Пуск » на экране.
  6. Мкл 350 пробирного среднего нежно к пластине клетки вдоль стороны скважин для сведения к минимуму нарушения клеток довести окончательный объем до 450 мкл.
  7. Замените пластину Утилита, содержащий calibrant с пластиной пробирного и продолжить.
  8. Удалите картридж датчик и пластину по завершении анализа. Сохраните файл в папке соответствующего назначения.

7. анализ данных

  1. Используйте площадь под кривой - дисперсионный анализ (AUC-ANOVA) вкладку анализ программного обеспечения для расчета значимой разницы между группами, выбрав соответствующие параметры (OCR или ECAR), как показано на рисунке 6.
  2. Выберите группы, которые нужно сравнить.
  3. Добавить группы анализа ANOVA и нажмите кнопку ОК.
    Примечание: Этот анализ AUC ANOVA добавит новый лист в файл, в котором рассчитывается для каждой группы и сравнении между ними ANOVA АУК. Это даст таблицу значений p чтобы показать значимость.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В центре внимания настоящего Протокола заключается в определении биоэнергетический функции C. albicans оценку анализатором дополнительный поток. C. albicans мутант хватает митохондриальных белок Mam33 входит также вместе с его дополнением штамм, mam33Δ/Δ::MAM33 для изучения последствий удаления митохондриальных белок OCR и ECAR. MAM33 кодирует для предполагаемого митохондриальной кислой матрица белка и его функция в Candida не известен.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Биоэнергетика дополнительный поток пробирного служит прекрасным инструментом для чтения из митохондрий путем измерения Оксидативное фосфорилирование (OXPHOS)-потребление зависит от кислорода в режиме реального времени. Кроме того гликолитических функция, которая измеряется как показатель внеклеточного подкисления (изменения внеклеточного pH) также могут расследоваться в то же время в режиме реального времени анализа.

Успешный плакировка C. albicans в пластину пробирного является одним...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Исследования в лаборатории НК поддерживается национальных институтов здравоохранения (НИЗ) Грант R01AI24499 и Грант фонда здравоохранения Нью-Джерси (NJHF), #PC40-18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RPMI 1640CorningMT50020PB
антимицин АSigmaA8674
KCN
Mito стресс-наборAgilent103015-100
ОлигомицинCalbiochem495455
pH-метрAccumetAR20
Фенол красныйSigmaP5530
Poly-D лизинSigmaP6407
RotenoneSanta cruz203242
Seahorse XF24 FluxPakAgilent100850-001
SHAM
Sodium ChlorideAmresco 241
Гранулы гидроксии натрияJ.T Baker3722
Культура тканей водасорта Gibco1523-0147
XF Калибровочный раствор Agilent100840-000
Дрожжевой экстракт Пептон ДекстрозаФишер научный,BP2469
Дрожжевой экстракт Пептон ДекстрозаАгар СигмаА1296
Экстракт дрожжей Пептон ГлицеринSigmaG2025

Ссылки

  1. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
  4. Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
  5. Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
  6. Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
  7. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
  8. Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
  9. Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
  10. Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
  11. Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
  12. Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
  13. Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
  14. Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
  15. Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
  16. Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
  17. Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
  18. Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
  19. Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
  20. Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
  21. Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555(2017).
  22. Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
  23. Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
  24. Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
  25. Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
  26. de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи