Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка хост возбудитель ответы и эффективность вакцины в мышей

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58930

⸱

22 февраля 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем элегантный протокол для оценки в vivo вакцины эффективность и принимающих иммунных реакций. Этот протокол может быть адаптирована для модели вакцины, которые изучать вирусных, бактериальных, или паразитарные патогенов.

Аннотация

Вакцины являются 20го века медицинское чудо. Они значительно сократили заболеваемости и смертности, вызванных инфекционными заболеваниями и способствовала поразительное увеличение продолжительности жизни во всем мире. Тем не менее определения эффективности вакцины остается проблемой. Новые данные свидетельствуют о том, что текущий бесклеточной вакцины (aPV) для Bordetella коклюша (B. коклюша) индуцирует субоптимальные иммунитет. Таким образом одной из основных задач является разработка следующего поколения вакцина, которая побуждает защитного иммунитета без негативных побочных эффектов вакцины поклеточного (ДПВ). Здесь мы описываем протокол, который мы использовали для тестирования эффективности перспективных, Роман адъюванта, которая искажает иммунные реакции на защитный Th1/Th17 фенотип и способствует лучше Распродажа B. коклюша вызов из мышиных дыхательных путей. Эта статья описывает протокол для мыши иммунизации, Бактериальная вакцинация, ткани для сбора урожая и анализа иммунных реакций. С помощью этого метода, в рамках нашей модели, мы успешно раскрыты важнейших механизмов, вызвали перспектива, следующего поколения бесклеточной коклюшной вакцины. Этот метод может применяться для любой модели инфекционных заболеваний с целью определения эффективности вакцины.

Введение

Вакцины являются одним из величайших достижений XX века общественного здравоохранения, однако мы до сих пор не полностью понимаем механизмы, которыми успешно вакцины стимулируют защитные иммунитет. Определение молекулярной подписей (например., маркеры активации клеток, расширение клеточных подтипы и шаблонов экспрессией генов) индуцированных после вакцинации предоставляет множество информации для прогнозирования и создании эффективных иммунный ответ. Сложность хост возбудитель ответов не могут быть реплицированы адекватно с использованием в vitro клетки культуры системы1. В естественных условиях вакцины модели предназначены для сопутствующе обстоятельств оценить несколько типов иммунных клеток в пределах узла. Это обеспечивает преимущество при характеристике вакцины антигена обработки и презентации, дифференциальной цитокина секрецию и расширение иммунных клеток. Протокол, описанные здесь обеспечивает подробный метод для определения эффективности вакцины через оценки системных и местных иммунных реакций и количественной оценки бремени возбудителя в тканях интерес. Приведенный здесь пример проверяет эффективность экспериментальной вакцины для патогена Bordetella коклюша (B. коклюша).

B. коклюша является грамотрицательные бактерии, которая является этиологическим агентом респираторного заболевания коклюшем (коклюш)2,3. Тесный контакт с инфицированными лицами (симптомами или бессимптомно) приводит к передаче, колонизации и болезни. Несмотря на значительные вакцинами покрытие4коклюша считается вспышек болезни во многих странах мира и является основной причиной поддающихся профилактике детских смертей,5,6,,7, 8. в 2015 году, б. дифтерии и коклюша были включены в национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) новые список инфекционного возбудителя, подчеркнув необходимость развития лучше вакцины, что наделяет долгоживущих защитного иммунитета.

В настоящее время активная область расследования для контроля Возрождение коклюша является разработка следующего поколения бесклеточной коклюшной вакцины (aPV) с оптимальным сочетанием новых адъювантов и антигенов, чтобы имитировать иммунный ответ вызвал в целом-ячейке Коклюш вакцины (ДПВ)9. Используя протокол описал, мы недавно сообщили, что модификация текущей FDA утвержденных aPV путем добавления Роман адъюванта, Bordetella колонизации фактор A (BcfA), привело к более эффективного сокращения B. коклюша бактериальной нагрузки от мышь легких10,11. Это усиление защиты сопровождалось наклон квасцы индуцированной Th1/Th2 иммунного ответа в более защитных иммунных профиль Th1/Th1710. Этот протокол является подробный и всеобъемлющий характер, что позволяет следователю для получения максимальной информации через параллельные оценки хост и иммунной реакции на целый ряд патогенов.

Протокол, описанные здесь следует представитель вакцины, показано на рисунке 1, для обеспечения оптимальной хост иммунных реакций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты с живых животных были проведены после протоколом, утвержденным Огайо государственного университета IACUC IACUC руководящим принципам. Мышей C57Bl/6 использовались во всех прививок и инфекции. Как мужчины, так и женские мышей используются в каждой группе в соответствии с руководящими принципами NIH. Количество животных каждого группы определяется мощность расчеты, основанные на предсказал различия в результатах среди экспериментальных групп. Например, 8 мышей каждой группы дадут 80% мощности при α = 0,05 (2-сторонняя) для 2-Пример t- тест, чтобы обнаружить различия в результатах интерес 1.33 стандартных отклонений (SDs).

1. Иммунизация мышей

  1. Подготовка смесь мастер вакцины в стерильных физиологических буфера как физиологического раствора или DPS.
    Примечание: Общий объем в смеси должен включать 10% больше, чем, необходимых для иммунизации всей группы. Концентрации в состав вакцины описаны ниже в шагах 1.1.1 и 1.1.2. Транспорт элементов виварий на льду.
    1. B. коклюша исследования, включают в себя следующие группы вакцины: АПВ и АПВ, + BcfA. Кроме того используйте квасцов, только антигенов вакцины (FHA и Prn) и наивно-(прививки) мышах в качестве контрольных групп.
      Примечание: АПВ-1/5й человека доза FDA утвержденных АПВ, который состоит из столбняка, снижение дифтерии анатоксином, коклюша анатоксином (PT), нитчатые гемагглютинина (FHA) и pertactin (Prn) адсорбированные для солей алюминия. Одного человека доза текущего коклюша aPV-0,5 мл, поэтому, 1/5й доза 0,1 мл. Тома для aPV + BcfA являются 0,1 мл aPV (1/5й человека доза) + 0,046 мл BcfA (30 мкг) на мышь. Максимальный объем, которые могут быть благополучно доставлены в одной мышцы-0,1 мл. Потому что aPV + BcfA вакцины объем превышает 0,1 мл, вакцины должны быть доставлены в обоих плечах, поровну примерно, чтобы безопасно управляться.
    2. Подготовить экспериментальные вакцины, для одной дозы сочетают 1 мкг FHA и 0,5 мкг Prn с 50 мкг алюминия гидроксид геля в стерильных PBS. Разрешить экспериментальной aPV смеси на лабораторных ролик 15 мин при комнатной температуре (RT). После этого спина трубки на 18,000 g x 5 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и Ресуспензируйте содержание в 1 мл стерильного PBS.
  2. В виварий, настроить аппарат для анестезии (рис. 2).
    Примечание: Убедитесь, что надлежащий уровень кислорода и изофлюрановая в их соответствующих танках перед использованием. Весят канистру приспособления изофлюрановая и заменить, когда его вес увеличивается на 50 г.
  3. Тщательно очистите биологической безопасности кабинета (BSC) и поместите чистый индукции камеры внутри BSC. Подключение линии анестезии и приспособления от анестезия машины к палате индукции. Открыть кислородный бак через регулятор для обеспечения кислорода течет и установить уровень на 1,5-2 Л/мин.
  4. Место мыши нужного возраста (6-12 недель) в камеру всасывание. Включите изофлюрановая 2,5-3% для того, чтобы слегка анестезировать мышей. Мониторинг животных до тех пор, пока они не переходят в камере и их дыхание замедлилось.
  5. Проверьте уровень индукции, мыс щипать, наблюдая за любые возвратные движения. Если нет, то мышей готовы придать.
    Примечание: В этом эксперименте, вся клетка животных были под наркозом одновременно. Можно выбрать для анестезировать животные индивидуально для инъекций или придать животных без анестезии. Любой из этих методов является подходящим.
  6. Тем временем Подготовьте 1 мл инсулиновые шприцы (28G 1/2) с 0,1 мл вакцины каждый. Когда животные полностью наведены, удалите одно животное из камеры и вентрально заложить мышь на коврик полотенце или скамейку.
  7. Администрировать вакцина внутримышечно. Шприц под углом 45° и с наклонной вверх вставьте шприц ~ 5 мм в дельтовидной мышцы мыши и инъекционные вакцины.
    Примечание: Задние четверти/пашины может использоваться как места инъекции вместо дельтовидной мышцы.
  8. После инъекции Держите иглы, вставляется в мышцы для s ~ 5-10. После того, как объем доставляется, вращаться шприц на 180°, так что скоса сталкивается прочь для создания печати и предотвращения утечки вакцины. Затем медленно Вытащите иглу укола.
  9. Возвращает указатель мыши к клетке. Повторите процедуру со всеми животными в группе назначенных.
  10. Выключить изофлюрановая и промойте индукции камеру с кислородом перед обезболивающим следующей клетки мышей.
  11. Мониторинг животных до тех пор, пока они все оповещения и движущихся в клетке. Возвращение клетки к месту жилья.
  12. Монитор животных каждые 12 ч пост вакцинации, до 48 ч, для клинических симптомов заболеваемости как грубой/неопрятный пальто, медленно походка или трудился дыхание. Если симптомы сохраняются, посоветоваться с институциональной ветеринар и удалить мышей из исследования, при необходимости.
  13. Через четыре недели после первоначальной иммунизации, повысьте мышей, обезболивающим и управляющей внутримышечные инъекции мыши с же вакцины формулировку, которая была ранее предоставлена в правой дельтовидной мышцы.
  14. Опять же следить за животное для каких-либо клинических симптомов. Дом животных, еще 2 недели и затем приступить к инфекции.

2. рост штаммов B. коклюша и подготовка инфекции посевным материалом

  1. Из замороженных запасов [замораживают на-80 ° C в 15% глицерина, замороженные от планктонной роста Stainer-Хольте (СС) СМИ12] подряд, B. коклюша на борде-Gengou (BG) агар13 пластины дополнена 10% дефибринированной овец кровь и 100 мкг/мл стрептомицина (10% БГ + Sm) для выбора. Инкубируйте пластины при 37 ° C в течение 4 дней.
  2. Выбрать отдельные колонии ~ 8-10 strain(s) от плиты и прививать 3 мл СС СМИ с 22,8 мм L-цистеина, 3,6 мм Железный купорос, 3,3 мм ниацин, 48,8 мм глутатион, 227 мм аскорбиновой кислоты, heptakis 1 мг/мл и 100 мкг/мл стрептомицина. Растут культуры при 37 ° C в ролик барабан на 60 об/мин для 16-24 ч.
  3. Следующий день, разбавьте 1: 600 основной культуры, 1: 300, гражд 1: 60, 1:30 и 1:15 в 3 мл дополнениями СС средств массовой информации. Инкубируйте культуры при 37 ° C в барабан ролик на 60 об/мин для 16-24 ч.
  4. Выполнения измерений оптической плотности на 600 Нм (OD600) для бактериальных культур. С помощью Кюветки спектрофотометра, разбавляют культур 1:10, добавив 0,1 мл жидкого культур до 0,9 мл стерильного PBS.
  5. Выберите культуры с ≈600OD 0.8-1.2. Вычислите объем, необходимые для получения 1 OD (рис. 3). Уменьшается объем в 1,5 мл microcentrifuge трубки на 6000 x g 5 мин при 25 ° C. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле бактериальных клеток в 1 мл стерильного PBS для получения плотность OD 1/мл [1-3 х 109 колонии, образуя единиц (CFU) / мл].
  6. Подготовить посевным материалом ~ 5 x 105 до 1,5 х 106 CFUs/мышь в 40-50 мкл, вихрь и серийно разбавленных бактериальных решение (с шагом 2.5) 100 раз в 1 мл стерильного PBS для достижения ~ 1-3 x 107 CFUs/мл (рис. 4A). Транспортные посевным материалом для террариумных на льду.

3. мышиных интраназального инфекции модель

  1. В виварий установите кислорода и анестезии условия, как описано в шаге 1.3 и 1.4. Как описано в шаге 1.5, место в камере анестезировать мышей. Мониторинг животных до тех пор, пока наркоз вступает в силу.
  2. Когда наркоз мышей, удалите одно животное в то время из камеры для индукции. Подберите мышь шиворот спинной грудной клетки, позади лопатки и шеи. Положение мыши вертикально для доступа к носу.
  3. С помощью кончика пипетки 200 мкл, медленно обратиться 40-50 мкл бактериальной посевным материалом ноздри мыши (20-25 мкл в каждом НАРЭ). Удерживайте кнопку мыши до тех пор, пока весь посевным материалом был вдыхаемого животного. Если некоторые из посевным материалом пузыри вне, собирать пузырьки и вновь вселить в ноздри. Доставить равное количество бесплодных PBS в одной группе мышей, как отрицательный контроль.
  4. Как это сделано в шагах 1.10-1.12, возвращение привитых животных в их клетке и контролировать животных до тех пор, пока они являются предупреждение и движущихся. Возвращение клетка его оригинальный жилой площади на стойке. Потолочные камеры индукции с кислородом, чтобы удалить остаточные изофлюрановая перед обезболивающим следующий набор животных. Мониторинг животных для 48 ч после инфекции.
  5. В лаборатории плита серийных разведений посевным материалом, в стерильных PBS, чтобы проверить фактическое CFUs доставлены мышей. Пластины 0,1 мл разведений на 10% БГ + см пластины (рис. 4A). Поместите пластины в инкубаторе 37 ° C и расти в течение 4 дней. Граф и вычислить CFUs с посевным материалом, доставляется мыши (рис. 4B).

4. заготовка из тканей животных после инфицирования

  1. Подготовка к мыши диссекции и ткани урожая.
    1. Простерилизуйте все инструменты (ножницы для грубой и тонкой, изогнутые ножницы, тонкой щипцы, Пелле бабы и Разбрасыватели треугольник), необходимые для обработки тканей в автоклаве. Уплотнение инструменты в стерилизации чехлы. Заверните в фольгу гомогенизаторы dounce стекла и добавить автоклава ленту для обозначения стерильности.
    2. Подготовьте агар пластины 1 или 2 дней до урожая ткани для обеспечения пластины затвердевших до использования. Для B. коклюша, используйте 10% БГ + сантиметр Label пластины для перегородки носа, трахеи и легких для каждой мыши с желаемой разведений, определить эмпирически для каждого эксперимента.
    3. Заливки и этикетке трубки CFU разрежения. Добавьте 0,9 мл стерильного PBS для стерильных 1,5 мл microcentrifuge трубы на количество органов процессу и разведения в орган.
    4. Заливки и этикетке трубки для ткани коллекции:
      1. Носовой перегородки и трахеи: заполните пробки microcentrifuge стерильные 1,5 мл с 0,3 мл стерильного 1% казеина в PBS (Ca2 + и Mg2 +-бесплатно). Хранить при 4 ° C.
      2. Легкие: добавьте 2 мл стерильного 1% казеина в PBS в стерильных 15 мл Конические трубки и хранить при 4 ° C. Урожай легкие для гистологии, добавить 2 мл нейтрального буферизации формалина 10% (NBF) и хранить в рт.
      3. Селезенка: добавить 3 мл RPMI + 5% FBS в 15 мл Конические трубки. Хранить при 4 ° C.
      4. Кровь: метка два набора стерильных 1,5 мл microcentrifuge трубок, для цельной крови и сыворотки.
    5. Свежий 70% этанол должны быть готовы заполнить мензурки и спрей бутылки для рассечения.
  2. Все материалы для террариумных на корзину транспорта на в день сбора урожая. Очистить BSC и настроить аппарат для анестезии как шаги 1.3 и 1.4.
  3. Поместите мышь расчлененный в камере индукции и, с кислородом течет, включите изофлюрановая до 5% и подождите, пока животные находятся в области бессознательного. Удаление мышей один на один раз и cervically вывихнуть животное как дополнительный метод для обеспечения смерти. После шейки матки вывих эвтаназии должны быть подтверждены отсутствие дыхания и/или отсутствие вывода рефлекс (мыс щепотку тест).
  4. Положение мыши, вентральной стороной вверх, на плате диссекции и закрепить руки и ноги открытым. Спрей вниз тело мыши с 70% этиловом спирте.
  5. С помощью щипцов, застежка кожи ниже живота, в центре малого таза. С помощью острых ножниц, сделайте вертикальный разрез до нижней челюсти. Затем, вскрыть кожи от брюшной стены, нажав два слоя друг от друга, с использованием небольших движений с ножницами закрыт. Место кожи по бокам каркаса для создания свободного поля для стерильных орган урожая.
  6. Возьмите нетронутыми брюшины ниже грудной клетки на или вокруг печени и разрезали, переход к грудной клетке. Разоблачить нижней пищеварительного тракта и переместить двоеточие влево, раскрывая селезенки. С помощью Изогнутый пинцет, возьмите селезенки и вскрыть от соединительной ткани с ножницами. Место селезенки в 15 мл конические трубка, содержащая 3 мл RPMI + 5% FBS и место трубку на льду.
  7. Используйте щипцы для стабилизации грудной клетки на мечевидного отростка и разрезали диафрагмы. Легкие должны выкачать и относятся к корешку. Разрезать, грудная клетка по бокам, чтобы удалить пластину груди.
  8. Изолируйте и удалите Улучшенный доли правого легкого14, резка легочной артерии и Вены. Место доли в 15 мл конические трубка, содержащая 10% NBF и место трубки на RT для по крайней мере 24 часа для исправления ткани. Изолируйте оставшиеся доли правого легкого и левое легкое. Место лопастями в 15 мл конические трубка, содержащая 2 мл 1% казеина в PBS и поместите его на льду.
  9. После резки легочных вен и артерий вскрыть из легких, позволяют грудной полости для заполнения с кровью, как мыши exsanguinates. С помощью pipetman 1 мл с кончиком, собирают кровь и перенести его на пробки microcentrifuge предварительно помечены 1,5 мл. Место труб на льду.
  10. Затем от шеи, удалите мягких тканей (околоушные, подъязычные и подчелюстных желез и лимфатических узлов), который охватывает трахеи. Откройте и снимите защитные мембраны, окружающие трахею. Деликатно используя ножницы и тонкой щипцы, отделите трахеи от пищевода и любые другие соединительной ткани от верхней части ключицами к нижней части нижней челюсти.
  11. С помощью щипцов, держаться трахеи и вырезать трахеи в верхней части ключицы. Опустите трахеи максимальной эластичности и сократить трахеи в нижней части нижней челюсти прямо над гортани, изолируя как можно больше (~ 1 см). Место орган в предварительно помечены 1,5 мл microcentrifuge трубка с 0,3 мл 1% казеина в PBS и поместите его на льду.
  12. Открепить мыши и вентрально, заложить его с помощью мыши перед исследователем для свободного доступа к носу. Разбрызгивателем мыши с 70% этанола и, используя руки, захватить мышь непосредственно за черепа.
  13. С помощью ножниц, срезаем мякоть мордой, начиная с нижней части носа и перемещаясь вверх. Кроме того удалите из меха, кожи и усы вокруг носа. Затем с щипцами и изогнутые ножницы, вставьте советы ножницы в ноздри с кривыми указал наружу и разрезать носовой проход к глаза, создавая V-как формирования.
  14. С помощью тонкой щипцы, собирайте носовой перегородки и мягких тканей в пределах созданных образования. Место ткани в предварительно помечены 1,5 мл microcentrifuge трубка с 0,3 мл 1% казеина в PBS и поместите его на льду.
  15. Распоряжаться каркаса в мешке биологической опасности. Прежде чем разбор следующего животного, промыть инструменты деионизированной водой, а затем поместить в стакан, наполненный 70% этиловом спирте. Удаление инструменты, стряхните излишки этанола и затем приступить к следующему рассечение
  16. Вскрыть каждой мыши следующие шаги 4.3-4.14.
  17. Обработка тканей, как описано ниже.

5. обработка селезенки

  1. Чтобы отделить селезенки, место стрейнер ячейки 70 мкм в блюдо культуры ткани 60 мм. Налейте в фильтр, используя поршень шприца 3 мл селезенки и сопровождающих СМИ. Осторожно Маш органа до тех пор, пока он полностью отделить и процедить через сито клеток.
  2. Промойте фильтр с 3 мл RPMI + 5% FBS в тканевой культуры блюдо. Собирать суспензию клеток и поместите его в своей оригинальной 15 мл. Центрифуга для трубы на 450 g x 5 мин при 4 ° C для пеллет клетки.
  3. Аспирационная или сцеживаться супернатант и лизируют красных кровяных клеток, resuspending гранулы в 2 мл аммония хлорид калия (ACK) буфера (хлорид аммония 150 мм, 10 мм калия бикарбонат, ЭДТА натрия 0,1 мм). Инкубируйте 3 мин на RT (25 ° C).
  4. Заполнить трубы до 8 мл с RPMI + 5% FBS и центрифуги трубы на 450 g x 5 мин при 4° C. Аспирационная или сцеживаться супернатант. Ресуспензируйте клетки окатышей в 5 мл RPMI + 5% FBS и count splenocytes, используя Горяева и Микроскоп.
  5. Рассчитайте объем клеток, необходимых для стимулирования 2,5 х 106 клеток на хорошо. В 48-ну пластине семян клетки в 0,5 мл СМИ Т-клеток (RPMI 1640 + 10% FBS, гентамицин 10 мкг/мл и 50 мкм β-меркаптоэтанол) за хорошо.
  6. На основании выше вычисления, поместите необходимый объем суспензии клеток в свежий трубки и Пелле клетки на 450 g x 5 мин при 4 ° C.
  7. Ресуспензируйте гранулы в необходимый объем средств Т-клеток. Для модели B. коклюша инфекции, тест антиген специфические цитокинового ответа антигенов вакцины: pertactin (Prn) и нитевидные гемагглютинин адгезии (FHA). Таким образом, необходимы 3 процедуры: 1) без стимуляции (NS, как отрицательный контроль), 2) Prn и 3) FHA. Для assay 7,5 х 106 клеток в 1,5 мл Т-клеток СМИ является требуется (2,5 х 106 клеток / 0,5 мл).
  8. Аликвота 0,5 мл суспензии клеток в 48-ну плиту.
  9. Чтобы стимулировать клетки, смесь антигенов в 2 раза желаемой концентрации в средствах массовой информации Т-клеток. Окончательный концентрации Prn и FHA = 1 мкг/мл и 0,5 мкг/мл, соответственно. Таким образом Смешайте 2 мкг/мл Prn или 1 мкг/мл FHA в 0,5 мл. Затем, аликвота 0,5 мл стимуляции среды в каждой места хорошо, для разбавления лечения антиген 1 x в окончательный объем 1 мл в каждую лунку.
  10. Инкубируйте пластины при 37 ° C в 5% CO2. Соберите supernatants на 7 день и аликвота 0,5 мл supernatants в предварительно помечены microcentrifuge трубы. Храните образцы в-20 ° С до готовности для тестирования антиген специфические цитокинов, ELISA (рис. 6).

6. обработка легких

  1. Передача легких (в 2 мл 1% казеина в PBS) в стерильные, гомогенизатор dounce 15 мл. Используйте пестик для гомогенизации ткани. Отделить до тех пор, пока не большие частицы ткани остаются. Место гомогенизированные подвеска обратно в оригинальный 15 мл.
  2. Удаление 0,3 мл аликвота для покрытия CFUs и центрифуги огневки на 450 g x 5 мин при 4 ° C. Сбор и Алиготе супернатант в 0,5 мл аликвоты в предварительно помечены microcentrifuge трубки. Храните образцы в-20 ° C до анализа цитокинов, ELISA.
  3. Подготовьте выбранный разведений серийно разбавление 0,1 мл суспензии гомогенизированные легких в разведении трубки (0,9 мл стерильного PBS). Пластины 0,1 мл эмпирически выбранной разведений на предварительно помечены 10% БГ + Sm пластины и распространение с помощью стерильных треугольник разбрасывателя.
  4. Инкубируйте пластины при 37 ° C в воздух комнаты на 4 дня.
  5. Граф и рассчитать CFUs/легких (рис. 6). Кратко умножьте восстановленные CFU чисел, коэффициент разбавления пластины, затем также общий объем, в котором орган был обработан. КОЕ расчеты затем преобразованы в значения Log10 для каждого животного и графике.
    1. Пластины с 30-300 колоний учитываются легко и точно. Пластины с менее чем 6 колоний не следует использовать для расчетов, поскольку такие низкие колонии чисел представить ошибка15. Чтобы получить нижний предел обнаружения, общий объем, в котором орган был гомогенизированные делится на том используется для пятно на пластину из неразбавленные огневки (например., общий объем 2 мл разделены 0,1 мл неразбавленного огневки равняется нижний предел 20 CFUs обнаружить).

7. обработка носовой перегородки и трахеи

  1. Однородный ткани в 0,3 мл 1% PBS/казеина с Пелле пестиком Беспроводные мотор гомогенизаторы. Однородный ткани на 0,5-1 мин до тех пор, пока ткань во многом в отрыве. Бактерии должны пролить в подвеска.
  2. Подготовка выбранных 10 x разведений путем последовательного растворения 0,1 мл гомогенизированные подвески в разведениях пробирки, содержащие 0,9 мл стерильного PBS. Точка 0,1 мл каждого разведения на предварительно помечены 10% БГ + Sm плиты и распространение подвеска, используя треугольник разбрасыватель, которая была стерилизована умывальник 70% этанола и пламени.
  3. Инкубируйте пластины при 37 ° C в воздух комнаты на 4 дня.
  4. Граф и рассчитать CFUs/орган как шаг 6.5 (рис. 6). Чтобы получить нижний предел обнаружения, общий объем, в котором орган был гомогенизированные делится на объем используется точка на тарелку от неразбавленные огневки (например., общий объем 0,3 мл делится на 0,1 мл неразбавленного равно нижний предел 3 CFUs detecta BLE).

8. обработка крови

  1. Центрифуга пробирки, содержащие изолированных цельной крови на 18,000 x г за 30 мин при 4 ° C для пеллет красных кровяных клеток.
  2. Тщательно снять сыворотки супернатанта и пипетки в пробки microcentrifuge предварительно помечены сыворотки. Хранить трубы в-20 ° C до готовности для дальнейшего течению анализа (т.е., общий и конкретный Ig ELISA).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанная модель показывает метод для оценки эффективности вакцины и иммунные реакции во время взаимодействия хост возбудителя. Рисунок 1 изображает представитель вакцины для иммунизации и заразить мышей и урожай тканей для анализа. Рисунок 2 демонстрирует настройку системы анестезии, занятых побудить мышей, позволяя следователей поставить прививки и бактериальных Инокулянты. Рисунок 3 показывает при...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Всеобъемлющий протокол, описанную здесь, для изучения вакцины индуцированной иммунитет к B. коклюша инфекции также позволит оценки принимающей ответов на целый ряд других патогенов. Протокол рассматриваются методы доставить прививки, определить вакцины эффективность следующих возбудителя вызов и параллельно рассечение иммунной функции. В адаптации протокол для того, чтобы изучить другие патогены, несколько параметров должны быть изменены. Они включают, но не ограничиваются, режим животных анестезии, состав вакци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана 1R01AI125560-01 и запуск средства от университета штата Огайо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Индукционная камера 2 лVet Equip941444
FlurisoVet OneV1 501017подойдет любая марка
Bordet Gengou Agar BaseBD bioscience248200
КазеинSigmaC-7078
КазаминокислотыVWRJ851-500GСитечко Scholte (SS) медиакомпоненты
L-глутаминовая кислотаИсследовательская продукция IntG36020-500
L-пролинИсследовательская продукция IntP50200-500
Хлорид натрияFisherBP358-10
Фосфат калия одноосновнойFisherBP362-1
Хлорид калияFisherP217-500
Хлорид магния гексагидратFisherM2670-500G
Хлорид кальцияFisherC75-500
Трис основаниеFisherBP153-1
L-цистеин HClFisherBP376-100SS медиа добавки
Сульфат железа гептагидратSigmaF-7002
НиацинИсследовательские продукты IntN20080-100
ГлутатионИсследовательская продукция IntG22010-25
Аскорбиновая кислотаИсследовательская продукция IntA50040-500
RPMI 1640ThermoFisher Scientific11875093
FBSSigmaF2442-500mL  любой источник в США, неинактивированный при нагревании
гентамицинThermoFisher Scientific15710064
B-меркаптоэтанолFisher BP176-100
15mL тканевая шлифовальная машинаWheaton357544любой аналогичной марки подходит
Аккумуляторный ручной гомогенизаторKontes/Sigma Z359971-1ЕАлюбой аналогичной марки подходят
инструменты - ножницы, кривые ножницы, щипцы, тонкие щипцы, треугольные распределителилюбой марки подходят
шприцы3мл BD bioscience309657
конические трубки 15млFisher 
1,5 мл микрофуговые пробиркиDenvilleC2170
70 мкм клеточные фильтрыFisher 
60 мм планшетыThermoFisher Scientific130181
48-луночные планшеты для культивирования тканейThermoFisher Scientific08-772-1C
1 мл инсулиновый шприц 28G1/2Fisher Scientific/Excel Int.14-841-31
Мышь ИФН-гамма ИФА Ready-SET-Go! НаборInvitrogen / eBioscience50-173-21
Мышь IL-17 ELISA Ready-SET-Go! НаборInvitrogen / eBioscience50-173-77
Мышь IL-5 ELISA Ready-SET-Go! НаборInvitrogen / eBioscience50-172-09
33965122363548

Ссылки

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
  2. Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
  3. Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
  4. Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
  5. Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
  6. Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
  7. McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
  8. Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
  9. Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
  10. Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
  11. Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
  12. Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
  13. Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
  14. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
  15. Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
  16. Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
  17. Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
  18. Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
  19. Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
  20. Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
  21. Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
  22. Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
  23. Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178(2010).
  24. Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
  25. Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
  26. Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
  27. Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
  28. Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469(1988).
  29. Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
  30. Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
  31. Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264(2013).
  32. Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
  33. Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
  34. Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
  35. Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359(2012).
  36. Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
  37. Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
  38. Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
  39. Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
  40. Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
  41. Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
  42. Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
  43. Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
  44. Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Ответ хозяина на патогениммунизация мышейбактериальная инокуляциязабор тканейподсчет КОЕпроточная цитометрияанализ ELISpotBordetella Pertussisполяризация Th1 Th17
Оценка хост возбудитель ответы и эффективность вакцины в мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.