Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение активности протеаз, флуоресцентный пептид Зимография

13K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58938

⸱

20 января 2019 г.

 ,  , 
1Comprehensive Cancer Center, James Cancer Hospital and Solove Research Center, Ohio State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Ohio State University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем подробный протокол для модифицированных zymographic техники, в котором флуоресцентные пептиды используются как разложению субстрат вместо родной белков. Электрофорез биологических образцов в флуоресцентные пептидные zymograms позволяет выявлять широкий спектр протеаз, чем предыдущие методы zymographic.

Аннотация

Этот метод предназначен для измерения протеолитической активности сложных биологических образцов. Образцы разделены молекулярный вес с помощью электрофореза через разрешая гель, встроенных с разложению субстрата. Этот метод отличается от традиционных гель Зимография закаленном fluorogenic пептид ковалентно включены в разрешая гель вместо полной длины белков, таких как желатин или казеина. Использование fluorogenic пептидов позволяет прямое обнаружение протеолитической активности без дополнительных шагов окрашивание. Ферменты в биологических образцах расщеплять пептид закаленном fluorogenic, что привело к увеличению в флуоресцировании. Флуоресцентный сигнал в гелях затем образы с сканера стандартные флуоресцентные гель и количественно с помощью денситометрия. Использование пептидов как разложению субстрат существенно расширяет возможных протеаз обнаружению с zymographic методами.

Введение

Гель Зимография — биологические метод, используемый для измерения протеолитической активности в биологических образцах, например жидкости организма или клетки культуры СМИ1,2,3. Образцы разделены их молекулярным весом с электрофорезом через гель полиакриламида, встроенный с разложению субстрата. Общие разложению субстратов включают желатина, казеин, коллагена и эластина, которые были использованы для измерения активности матрицы металлопротеиназ (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 и -11, в дополнение к разнообразным катепсинов1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. после электрофореза, ферменты renatured и деградировать белок в гель. В традиционных гель Зимография гель запачкается с белком красителя, например Кумасси синий, и протеазы деятельность определяется как потери сигнала, т.е. белые полосы (деградации белка) на синем фоне.

Здесь мы описываем протокол для альтернативного метода Зимография геля, в котором разложению субстрата является короткий, fluorogenic пептид ковалентно включены в геле полиакриламида (рис. 1). Замена синтетических пептидов как разложению субстратов позволяет выявлять широкий спектр протеаз по сравнению с традиционными гель Зимография с родной белки9. Ковалентная связь fluorogenic пептид предотвращает пептид диффузии и миграции во время электрофорез с предыдущие методы9,10. Кроме того использование подложке fluorogenic позволяет прямое обнаружение активности протеаз без дополнительных окрашивания и исключения окрашивания шаги. Общая цель этого метода является обнаружение активности протеаз в биологических образцах через ковалентных включение fluorogenic пептидов в зимограммы гели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка разрешая слой геля

  1. Подготовка 10% полиакриламида, решения гелем решения согласно таблице 1. Добавьте Tetramethylethylenediamine (TEMED) и Аммония пероксодисульфат (APS) непосредственно перед заливкой геля, как их дополнение инициирует реакции полимеризации.
  2. Заполните пустой 1,5 мм мини-гель кассеты половину пути (5 мл) с 10% раствором разрешая гель.
  3. Добавьте тонкий слой изопропиловый спирт (~ 500 мкл) в верхней части геля полиакриламида производить уровня геля и предотвратить пузыри. Используйте решение оставшихся полиакриламида отслеживать прогресс реакции полимеризации. Когда полностью затвердевшим Полиакриламид в трубе, реакция является полным (~ 40 мин.).

2. Подготовка молекулы компоновщика Azido-PEG3-maleimide

  1. В то время как первый слой разрешая гель полимеризации, получить комплект azido-PEG3-maleimide из хранения от-20 ° C и позволяют использовать компоненты до комнатной температуры. Есть два компонента в каждом комплекте. 1 флакон содержит Эстер maleimide-NHS, кремовый, серый сплошной. Флакон 2 содержит azido-PEG3-Амин, слегка желтоватый нефти.
    Примечание: Авторы предлагают с помощью комплекта azido-PEG3-maleimide 25 мг, как он может храниться только для коротких периодов времени (1-2 часа) при-20 ° C после готовятся, прежде чем он начинает ухудшаться. 25 мг достаточно для производства 10 пептид гели. Использование гелей в течение 3 недель подготовки.
  2. Распустить компоненты 2 флакона в производителя рекомендуется объем диметилсульфоксида (ДМСО) и вихрь 30 s для обеспечения жидкости смешались хорошо.
  3. Перенесите содержимое 1 флакона в колбу раунд дно чистой, сухой 100 мл, содержащие бар stir.
    Примечание: Ополосните колбу с ацетоном и полностью высушите перед использованием, чтобы предотвратить влаги от вмешательства с реакцией.
  4. Сразу вставьте резиновой пробкой перегородки с диафрагмой, которая может прокола со шприцем в горловину колбы. Работайте быстро, чтобы предотвратить проникновение колбу влаги.
  5. Вставить два 18 калибровочных шприц иглы в диафрагму и подключите один танк инертного газа (например , аргоном). Разрешить инертного газа для заполнения Фляга для 3 мин смесь компонентов флаконы 1 и 2 в атмосфере инертного газа для предотвращения продуктов нежелательные реакции.
    Предупреждение: Вторая игла шприца – предоставить отверстие, тем самым позволяя атмосферного воздуха, содержащихся в колбу течь из колбы, как он заполняет с инертным газом. Не забудьте включить отверстие иглы!
  6. Выключить инертного газа и отсоединить его от иглы. С помощью шприца, внедрить полное содержимое флакона 2 в колбу.
  7. Удаление игл и шприцев и позволяют использовать компоненты смешать 30 мин при комнатной температуре помешивая.
  8. Снимите резиновую пробку перегородки и передать содержание чистого 5 мл пластиковых пробирок. Azido-PEG3-maleimide раствор необходимо использовать в течение 1 часа при комнатной температуре.

3. Подготовка пептид, урегулировании слой геля

  1. После того, как первый слой разрешая Гель полимеризуется, слить слой изопропиловый спирт. Промыть в верхней части геля дозирования 1 мл деионизованной воды на вершине гель и затем слейте воду.
  2. Извлечение тиоловых функционализированных флуоресцентные пептид от-80 ° C для хранения и позволяют разморозить при комнатной температуре.
    Примечание: Тиоловых функционализированных пептид может быть подготовлен как описано ранее,11,12. Коммерчески доступные пептиды могут также использоваться, но требуют сложения остатков цистеина терминала для включения maleimide тиоловых нажмите реакции. Распустить пептид запасов концентрацию 10 мм и хранить его на-80 ° C в малых (30 uL) аликвоты ограничить циклов повторных замораживания оттаивания.
  3. Подготовка 10% разрешении гель раствор, содержащий azido-PEG3-maleimide компоновщика молекулы и флуоресцентные пептид согласно таблице 1. Добавьте APS и TEMED непосредственно перед заливкой геля, как их дополнение инициирует реакции полимеризации.
  4. Заполните половину из оставшейся части гель кассеты (3 мл) с пептида, решении решения гелем.
    Примечание: Многослойная разрешая гель подход уменьшает количество пептида и компоновщик, необходимых для каждого геля. Размер слоя разрешая гель пептид может корректироваться чтобы вместить больший диапазон молекулярным весом, при необходимости.
  5. Пипетка тонкий слой изопропиловый спирт (~ 500 мкл) в верхней части геля полиакриламида производить уровня геля и предотвратить пузыри. Используйте решение оставшихся полиакриламида отслеживать прогресс реакции полимеризации. Когда полностью затвердевшим Полиакриламид в трубе, реакция является полным (~ 40 мин.).
    Примечание: Флуоресцентные пептида является светочувствительный. Держите гели, покрытые алюминиевой фольги для предотвращения Фотообесцвечивание во время подготовки геля, электрофорез, стирки и развития.
  6. Слить слой изопропанол и промойте в верхней части решения гелем с дейонизированной водой как шаг 3.1 пептида.
  7. Если использовать гели немедленно, перейдите к шагу 4, иначе, погружайте подготовленный гели в 100 мл 1 x фосфатный буфер (PBS) при 4 ° C в пластиковой коробке, чтобы предотвратить Гели от высыхания. Заверните в алюминиевую фольгу для предотвращения Фотообесцвечивание поле. Гели могут храниться в PBS до 3 недель до использования.

4. Подготовка штабелируя гель

  1. Приготовляют раствор укладка гель 5% согласно таблице 1. Добавьте APS и TEMED непосредственно перед заливкой геля, как их дополнение инициирует реакции полимеризации.
  2. Заполните оставшиеся пустую часть кассеты гель (~ 2 мл) с укладки решения гелем.
  3. Быстро вставить гребень гель 1.5 мм в наложения слоя геля, убедившись, что нет пузырьков остаются ловушке под колодцы. Используйте решение оставшихся полиакриламида отслеживать прогресс реакции полимеризации. Когда полностью затвердевшим Полиакриламид в трубе, реакция является полным (~ 10 мин).
  4. Аккуратно снимите расческу и ленты из задней части кассеты геля.

5. Подготовка биологических образцов для электрофореза

  1. Подготовьте кондиционером ячейки СМИ, lysates клетки, ткани гомогенатах и ММП стандартов как описано в других разделах под-сокращение условий2. Не разогревайте образцы.
  2. К примеру готовят кондиционером ячейки СМИ следующим образом:
    1. Пластина 40 000 клеток/см2 клетки в 6-ну пластины в культуре средств массовой информации 10% плода бычьим сывороточным (ФБС). Инкубации клеток в камере увлажненные (5% CO2 при 37 ° C) для 24 часов и дать им возможность достичь слияния 70-80%.
      Примечание: Если клетки не достигли желаемого confluency после 24 часов, позволяют им расти в культуре средств массовой информации 10% FBS на дополнительные 24 часа.
    2. Вымыть клетки дважды с PBS и добавить 2 мл сыворотки свободной культуры средств массовой информации. Инкубации клеток в камере увлажненные (5% CO2 при 37 ° C) для еще 24 часа.
    3. С помощью Пипетки серологические, соберите кондиционером СМИ от каждой скважины. Центрифуга для средств массовой информации на 1200 об/мин за 3 минуты, чтобы удалить любой ячейки мусор. Возьмите супернатант и сосредоточиться с использованием 15 мл, 10 кДа молекулярный вес центробежный фильтр отсечки единицы. Центрифуга фильтр единиц на 4000 x g 15 мин в размахивая ротора ведро или 5000 g x 15 мин в фиксированный угол ротора.
      Примечание: Этот шаг является необязательным, но может повысить интенсивность протеолитических полос в гелях Зимография пептида.
    4. Передать свежие 1,5 мл пластиковых пробирок концентрированной фильтрата. Алиготе и хранить образцы на-80 ° C до трех циклов замораживания оттаивания.
  3. Количественно содержание белка, используя assay количественной оценки стандартных протеина (например BCA, Assay Брадфорд, и т.д.).

6. электрофорез биологических образцов в пептидной Зимография гели

  1. Распустить образцов в буфере выборки обычных Зимография (62,5 мм трис-HCl, pH 6.8, 25% глицерина, 4% SDS, 0,01% бромфеноловый синий). Для образцов клеток и тканей, рекомендуется ~ 30 мкг общего белка в колодец и 50-100 нг белка для СПП стандартов.
  2. Добавить 400 мл 1 x трис-глицин SDS работает буфер аппарат гель. Нагрузка до 35 мкл пример за хорошо. Выполнение примеров на 120 V на 4 ° C на 1,5 часа или до тех пор, пока молекулярный вес стандартов показывают, что протеаз интерес внутри пептид, урегулировании слой геля (который имеет видимый оранжевого цвета).
    Примечание: Большинство равенству и их варианты попадают в диапазон 35-100 кДа. Когда стандартов молекулярный вес указывают, что этих весов находятся в пределах пептид, урегулировании слой геля, электрофореза может быть остановлена. Же принцип может быть применен к другим классам протеаз с известным молекулярным весом. Если есть интерес в обнаружении нескольких протеаз над более широкого круга молекулярным весом, уменьшить размер разрешения слой геля и увеличить размер слоя разрешая гель пептида.
  3. После электрофореза удалите гели из пластиковых кассет и мыть гели три раза за 10 мин при комнатной температуре под нежным агитации в renaturing буфер, содержащий 2,5% Тритон X-100, 1 мкм ZnCl2и 5 мм CaCl2 в 50 мм Трис-HCl, pH 7.5.
  4. Передача гели для развивающихся буферного раствора, содержащего 1% тритон X-100, 1 мкм ZnCl2 и 5 мм CaCl2 в 50 мм трис-HCl, рН 7,5 на 15 мин заменить с свежие разработки буферного раствора и инкубировать гели при 37 ° C под нежным агитации за 24 часа , убедившись, что гели полностью submersed в решении.

7. изображения пептида Зимография гели

  1. После 24 часов гели изображения с помощью флуоресцентных гель сканер/формирователь изображений, используя соответствующие фильтры возбуждения и выбросов. К примеру, пептид гели, показано в результатах представительных проспряганное с Fluorescein и были образы с помощью фильтра возбуждения 488 нм и фильтр выбросов 521 Нм. Используя соответствующие фильтры для вашего Флюорофор будет максимально обнаружение протеолитической активности.
    Примечание: Изображения также могут быть приняты с гель Тепловизор с УФ transilluminator, часто используется для визуализации гелей ДНК, окрашенных бромидом ethidium. Изображение с помощью transilluminator УФ гели (365 Нм) параметр и фильтр выбросов 590 нм.
  2. Проведение денситометрических оценки группа интенсивности с использованием ImageJ, как описано в других разделах13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя метод, описанный здесь, две люминесцентные протеаз разложению пептиды были включены в полиакриламидных гелей: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (сокращенно QGIW на протяжении всего текста и цифр) и GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (сокращенно LACW на протяжении всего текста и фигур). ↓ Указывает на сайте расщепления. QGIW является коллаген-я полученные последовательности, предназначен для обнаружения клеточных коллагеназ14. LACW — это последова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Современные zymographic методы полагаются на включение родной субстратов в полиакриламидных гелей для обнаружения протеолиза. Хотя эти методы имеют получил широкое применение, они по-прежнему ограничены в количество протеаз, которые они могут обнаружить. Здесь протокол был описан, в которых флуоресцентные, протеаз разложению пептиды включены в разрешении геля полиакриламида. Ковалентного соединения с помощью молекула azido-PEG3-maleimide компоновщика позволяет разделение и обнаружение более широкий спектр протеаз, чем в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Финансирование предоставлено Огайо государственного университета инженерного колледжа, биомедицинская инженерия и всеобъемлющем онкологический центр - Артур G. Джеймс рака больницы и Ричард J. Solove научно-исследовательский институт.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мм Пустые гелевые кассетыThermoFisher ScientificNC2015
1,5 мм, 10 лунок Пустые гелевые кассетные расческиThermoFisherScientific NC3510
1x Фосфат буферизованный физиологический растворFisher Scientific10-010-049
20% SDS РастворAmbionAM9820
3x Zymography Sample BufferBio-Rad1610764
40% (по объему) Акриламид/Бис (19:1)AmbionAM9022
6-луночные планшеты для культивирования тканейThermoFisher Scientific087721B
Центробежный фильтрующий блок Amicon Ultra-2 (10 кДа MWCO)Sigma-AldrichUFC201024
персульфат аммунияSigma-AldrichA3678
Azido-PEG3-Maleimide KitClick Chemistry ИнструментыAZ107
Хлорид кальцияThermoFisher ScientificBP510100
ДиметилсульфоксидFisher ScientificBP231
ИзопропанолFisher ScientificA416P
Micro BCA Protein AnalysisKit ThermoFisher Scientific23235
N N N' N'-Тетраметилэтилендиамин (TEMED)Sigma-AldrichT9281
PowerPac Базовый блок питанияBio-Rad1645050
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
PrecisionGlide Иглы для подкожных инъекцийFisher Scientific14-826
Круглодонная колба (100 мл)Fisher Scientific50-873-144
Резиновая пробка для перегородкиFisher Scientific50-872-546
Стерильный шприц с скользящим наконечником (1 мл)Fisher Scientific14-823-434
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Trizma hydrochlroideSigma-AldrichT5941
Typhoon 9410 Молекулярный имиджерGE Amersham8149-30-9410
Хлорид цинкаSigma-Aldrich
208086

Ссылки

  1. Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
  2. Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
  3. Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
  4. Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
  5. Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
  6. Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
  7. van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
  8. Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
  9. Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
  10. Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
  11. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  12. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  13. Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
  14. Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
  15. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  16. Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
  17. Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
  18. Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Определение протеазной активностипептидный разделяющий гельсравнительный анализ желатиназовым зимографированиемфлуоресцентный гель-сканеринкубация в проявительном буфереобработка ингибитором ММПдизайн пептидного субстратаанализ деградации биоматериалаверификация методом вестерн-блоттинга
Обнаружение активности протеаз, флуоресцентный пептид Зимография
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.