Методическая статья

Индукционной системы для кластерных устьиц на лечение погружения раствора сахара в проростках Arabidopsis thaliana

DOI:

10.3791/58951

⸱

15 февраля 2019 г.

 , 
1Department of Integrated Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2International Research Organization for Advanced Science and Technology, Kumamoto University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации как побудить кластерных устьиц в семядоли Arabidopsis thaliana саженцев погружения лечение с раствором сахара содержащих средних и как соблюдать внутриклеточных структур, таких как хлоропласты и микротрубочек в кластерных гвардии ячейки, используя Конфокальная лазерная микроскопия.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Устьичного движение опосредует завод газового обмена, которая необходима для фотосинтеза и транспирации. Устьиц открытия и закрытия достигнуто значительное увеличение и уменьшение объема клетки гвардии, соответственно. Потому что трансфер транспорт ионов и воды происходит между гвардии клетки и крупных соседних клеток эпидермиса во время движения устьиц, расположенными распределение растений устьиц считается оптимальное распределение для устьичной движения. Экспериментальные системы нарушается расположенными шаблон устьиц полезно изучить шаблон интервалы значимости. Были определены несколько ключевых генов, связанных с расположенными устьичного распределением, и кластерный устьиц можно экспериментально вызванных изменения этих генов. В качестве альтернативы кластерных устьиц может быть также вызвана экзогенных лечения без генетических изменений. В этой статье мы описываем простой индукционной системы для кластерных устьиц в проростках Arabidopsis thaliana погружения лечение среднего раствором сахарозы содержащих. Наш метод легко и непосредственно применимо к трансгенных или мутантных линий. Хлоропластов больше представлены в качестве отличительной биологических клеток сахарозы индуцированной кластерных гвардии клеток. Кроме того представитель конфокальный микроскопических изображений корковых микротрубочек показано как пример внутриклеточных наблюдения кластерных гвардии клеток. В кластерных гвардии клетки как интервал гвардии клеток в условиях управления поддерживается радиальные ориентации корковых микротрубочек.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стома завод является важным органом для газового обмена для фотосинтеза и транспирации, и устьичного движение сопровождается значительные изменения в клетках гвардии через Ион driven поглощения и выпуска воды. Под микроскопом мы можем наблюдать расположенными распределение устьиц на поверхности листьев и стеблей. Считается, что этот интервал распределение устьиц помочь устьичного движение, которое регулируется обмен ионов и воды между гвардии клетки и соседних клеток эпидермиса1,2. Экспериментальный индукционной системы для кластерных устьиц полезны для расследования значение интервал распределения устьиц.

Сообщается, что пространственные кластеризации устьиц может быть вызвана генетической модификации ключевых генов для дифференциации клеток гвардии3,4 или лечение с химического соединения5. Мы также сообщали, что лечение погружения с раствором средних дополнена включая сахарозы, глюкозы, сахара и фруктоза устьичного кластеризации в семядоли Arabidopsis thaliana саженцы6. Снижение callose в новой стены клетки, разделение meristemoids и эпидермальных клеток наблюдалось в сахарозы лечение Семядоля эпидермиса, предполагая, что лечение погружения раствора сахарозы отрицательно сказывается на клеточной стенки, который предотвращает утечку и Внематочная действий ключевых генов продуктов для дифференцировки клеток гвардии (например , факторы транскрипции) направлении прилегающих эпидермальных клеток6. Аналогичный механизм было предложено от исследований по gsl8/Чор мутантов7,8. Наша экспериментальная система для воспроизводимых индукции кластерных устьиц, используя сахарозу содержащих средних решение довольно легко и дешево. Он может также использоваться для изучения внутриклеточных структур, таких как органеллы и Цитоскелет в кластерных гвардии клеток при применении к трансгенных линий, выражая флуоресцентные маркеры что лейбл внутриклеточных структур9, 10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка решение средних 1/2 фотосинтетическую Скуг сахарозы содержащие 3%

  1. Добавьте 1.1 g фотосинтетическую Скуг средних солей и 15 г сахарозы в стакан.
  2. Добавить 490 мл дистиллированной воды и перемешать хорошо с помощью бар stir.
  3. Отрегулируйте пэ-аш до 5,8, используя Кох.
  4. Разбавляют до 500 мл дистиллированной водой и передача решения в средних бутылку.
  5. Стерилизация автоклавированием (121 ° C, 20 мин) решение. Если не используется сразу, это решение может храниться при температуре 4 ° C после стерилизации.

2. индукция кластерных устьиц, содержащих сахарозу решение средних погружения лечение

  1. Стерилизуйте семена.
    1. Приготовляют раствор стерилизации, добавив 500 мкл 5% активного хлора раствора NaClO и 1 мкл 10% Тритон X-100 до 500 мкл стерильной водой.
    2. Место ОК. 50 трансгенных семян A. thaliana ношение флуоресцентные маркер например CT-GFP11 или GFP-TUB612 в 1,5 мл.
    3. Добавьте 1 мл 70% этанола раствор и перемешать хорошо, инвертирование пять раз. Оставьте на 1 мин.
    4. Семена будут опускаться на дно трубки. На лавочке чистой аккуратно удалить 70% этанол, с использованием микропипеткой и добавить 1 мл раствора стерилизации. Смесь хорошо, инвертирование пять раз и оставить на 5 мин.
    5. Вымойте семена. Все еще работает в асептических условиях на лавочке чистой, аккуратно удалить решения с помощью микропипеткой и добавить 1 мл стерильной воды. Повторите этот шаг пять раз.
  2. Добавьте 1,5 мл раствора стерилизованные 3% сахарозы содержащих 1/2 фотосинтетическую Скуг средних в каждой скважине 24-ну плиты на лавочке чистой.
  3. Добавьте два стерилизованные семена в каждой скважине. Лентой крышку на 24-ну пластину, используя два слоя парафина.
  4. Передать набор рост палата на 23,5 ° C 24-ну пластины с 12/12-ч цикла свето тени, используя 100 мкмоль m−2 s−1 белый свет и инкубировать в течение 14 дней.

3. микроскопические наблюдения кластерных устьиц

  1. Место 30 мкл 3% сахарозы содержащих 1/2 фотосинтетическую Скуг средних раствора из скважины пластину 24-Ну на центр на стеклянное скольжение (размер: 76 × 26 мм, толщина: 1,0-1,2 мм).
  2. Удаление Семядоля из 14-дневных Рассада рассечения ножницами. Поплавок Семядоля наблюдения стороной вверх на падение решения.
  3. Подготовка образца Семядоля согласно нашего предыдущего метода13. По сути, место 30 мкл раствора в центре крышки стекла (размер: 18 × 18 мм, толщина: 0.12-0,17 мм). Стекло покровное перевернуть вверх дном и поместите его на Семядоля осторожно. Вытрите избыток буфер с помощью безворсовой ткани.
  4. Установите образец на сцене конфокальный лазерный микроскоп и выберите кластерный гвардии клетки для наблюдения, используя яркие области освещения.
  5. Приобрести конфокальный изображения дневно помечены внутриклеточных структур согласно инструкциям производителя Микроскоп.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь был представлен протокол для простой способ заставить устьичного кластеризации раствором сахарозы содержащих средних в A. thaliana. Кластерный гвардии клетки, выращенных в решение средних содержащих сахарозу (рис. 1Б) имеют большие хлоропластов чем охранник клетки, выращенных в условиях свободной сахарозы управления (рис. 1А). Расширение хлоропластов было подтверждено с КТ-GFP

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представили протоколы для индукции кластерных устьиц в A. thaliana погружения лечение среднего раствором сахарозы содержащих. Как показано здесь, этот метод очень прост и не требует специальных навыков, но может эффективно стимулировать кластерных устьиц. Более 45% клеток гвардии, объединяются с 3% сахарозы содержащих решение средних (средние значения более чем 20 независимых наблюдений)6. Кроме того эта экспериментальная система может непосредственно применяться к трансгенных или мута...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны профессор Сеичиро Hasezawa за его любезную поддержку нашей работы. Эта работа была поддержана грантов от японского общества для поощрения науки (JSP) KAKENHgrant насчитывает 17K 19380 и 18 H 05492, от Sumitomo фонда на грант для основных исследовательских проектов науки номер 160146 и Canon фонд предоставить т.х. Эта экспериментальная система была разработана при финансовой поддержке от числа страниц JSP KAKENHgrant 26891006 к к. а. Мы благодарим Robbie Льюис, MSc, из группы Edanz (www.edanzediting.com/ac) для редактирования черновика рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-луночная пластинаSumitomo BakeliteMS-0824R
488 нм лазерFurukawa DenkoHPU-50101-PFS2
488 нм лазерOlympusSapphire488-20/O
510 нм длинночастотный фильтрOlympusBA510IF 524
- 546 нм полосовой фильтрSemrockFF01-535/22-25
530 нм короткий проход фильтрOlympusBA530RIF
561 нм лазерCVI Melles Griot85-YCA-025-040
604 - 644 нм полосовой фильтрSemrockFF01-624/40-25
Конфокальная лазерная сканирующая головкаYokogawaCSU10
Конфокальная лазерная сканирующая головкаOlympusFV300
Охлаждаемая ПЗС-камераФотометрияПрограммное обеспечение для получения изображений CoolSNAP HQ2
Молекулярные устройстваMetaMorph версии 7.8.2.0
Программное обеспечение для получения изображенийOlympusFLUOVIEW v5.0
Иммерсионное маслоOlympusImmersion Oil Type-Fne = 1.518 (23 градуса)
Инвертированный микроскопOlympusIX-70
Инвертированный микроскопOlympusIX-71
Смесь соли растений Мурасиге и СкугаFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation392-00591Мурасиге Т. и Скуг Ф. (1962) Модифицированная среда для быстрого роста и биоанализа с культурами табачных тканей. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Объективные линзы OlympusUPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35NA = 1.35
Объектив OlympusUPlanAPO 40x / 0.85 NANA = 0.85
СахарозаFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation196-00015

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
  2. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
  3. Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
  4. Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
  5. Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
  6. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456(2013).
  7. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
  8. Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
  9. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815(2018).
  10. Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
  11. Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
  12. Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
  13. Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи