Мыши модель для оценки врожденный иммунный ответ инфекции стафилококк

Золотистый стафилококк (S. aureus) приходится большинство инфекции кожи и мягких тканей (ИКМТ) в Соединенных Штатах¹. Распространенность метициллин резистентный S. aureus (MRSA) за последние два десятилетия², мотивации изучения механизмов сохранения и открытия новых стратегий лечения инфекций неуклонно растет. Стандарт медицинской помощи для MRSA инфекций является системной антибактериальной терапии, но MRSA становится все более устойчивыми к антибиотикам за время³ и эти препараты могут уменьшить пользу микрофлора хозяина, вызывая негативных последствий для здоровья, особенно в ⁴детей. Доклинические исследования изучили альтернативные стратегии для лечения MRSA инфекции⁵, но перевод этих подходов к клинике оказался сложным из-за появления факторов вирулентности, которые сорвать хост иммунных ответов⁶. Анализировать динамику хост возбудитель диска S. aureus ИКМТ, мы сочетаем неинвазивной и продольных индикация числа нейтрофилов набранных на раны кровать с кинетической мер бактериальной изобилия и ранение области.

Нейтрофилы являются наиболее распространенными циркулирующих лейкоцитов в организме человека и первый responders бактериальной инфекции⁷. Нейтрофилы являются необходимым компонентом для эффективного пребывания ответ против инфекции S. aureus вследствие их бактерицидные механизмов, включая производство реактивнооксигенных видов, протеаз, антимикробных пептидов и функциональных реакций включая фагоцитоза и нейтрофилов внеклеточного ловушку производства^8,9. Человека пациентов с генетическими дефектами в нейтрофильные функции, такие как хроническая гранулематозная болезнь и Синдром Чедиака-Хигаси, показывают, повышенной восприимчивости к инфекции S. aureus . Кроме того, пациенты с генетическими (например врожденные нейтропении) и приобретенные (например, нейтропения, видели в химиотерапии больных) дефекты в нейтрофильные чисел также очень восприимчивы к инфекции S. aureus ¹⁰. Учитывая важность нейтрофилов в очистке инфекции S. aureus , укрепления их иммунной или настройки их число в пределах S. aureus поражения может оказаться эффективной стратегии в решении инфекции.

За последнее десятилетие трансгенных мышей с флуоресцентным нейтрофилов журналистами были разработаны для изучения их людьми^11,12. Сочетая нейтрофилов репортер мышей с целом животных методы визуализации позволяет пространственно-временных анализ нейтрофилов в органах и тканях. При сочетании с биолюминесцентных штаммов S. aureus, это позволяет отслеживать накопление нейтрофилов в ответ на S. aureus изобилия и упорство в контексте бактериальной вирулентности факторов, которые прямо и косвенно возмущают нейтрофилов чисел в пораженной ткани^13,14,,1516.

Мышей менее подвержены механизмов уклонения вирулентности и иммунной S. aureus , чем люди. Таким образом, мышах одичал типа не может быть идеальной моделью животных для изучения эффективности с учетом терапевтического лечения хронических S. aureus инфекции. MyD88-недостаточным мышей (т.е., MyD88^{- / -} мышей), ослабленным мыши штамм, который не хватает функциональной интерлейкина-1 рецепторов (IL-1R) и Толл подобный рецептор (TLR) сигнализации, шоу подверженности заражению S. aureus , по сравнению с мышах одичал тип¹⁷ и ухудшение оборота нейтрофилов к сайту S. aureus инфекции кожи¹⁸. Разработка мыши штамм, который обладает репортером флуоресцентный нейтрофилов в MyD88^{- / -} мышей предоставляет альтернативную модель для исследования эффективности терапии для лечения инфекции S. aureus , по сравнению с текущей нейтрофилов Репортер мышей.

В этом протоколе мы характеризуют инфекции Стафилококк золотистый в ослабленным мышей^{- / -} × MyD88 LysM-EGFP и сравнить время курс и резолюции инфекции с LysM-EGFP мышей. LysM-EGFP × MyD88 мышей^{- / -} развитие хронической инфекции, которые не удалось решить, и 75% поддаваться инфекции после 8 дней. Значительный дефект в первоначальном наборе нейтрофилов происходит более 72 ч воспалительной стадии инфекции, и 50% меньшее количество нейтрофилов набирать на последней стадии инфекции. Повышенная восприимчивость × LysM-EGFP, MyD88^{- / -} мышей делает это особое напряжение строгий доклинических модель для оценки эффективности новых терапевтических методов таргетинга инфекции S. aureus , по сравнению с текущей модели Используйте мышь одичал типа, особенно техники, стремясь повысить врожденный иммунный ответ против инфекции.

Все мыши исследования были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом на UC Дэвис и были выполнены в соответствии с руководящими принципами закона расширение исследований здоровья и Закон о благосостоянии животных. Убедитесь в том использовать стерильные перчатки при работе с животными.

1. мышь источник и жилищного строительства

1. Производные LysM-eGFP мышей на фоне генетических C57BL/6J как описано ранее¹². Производные LysM-EGFP × MyD88^{- / -} мышей путем скрещивания LysM-EGFP мышей с MyD88^{- / -} мышей на фоне C57BL/6J.
2. Дом мышей в виварий. Для этих исследований животные были размещены в университете Калифорнии, Дэвис в группах до одного размещены следующие хирургии и хирургии. Используйте мышь в возрасте 10-16 недель.

2. бактериальные подготовка и количественная оценка

1. Удаление биолюминесцентных штамма S. aureus интереса от-80 ° C для хранения таять на льду. Полоска на плите говядины крови агар 5%. Инкубируйте прожилками пластины в увлажненные инкубатора при 37 ° C ночь (16 ч).
   Примечание: В настоящем Протоколе, был использован штамм ALC2906 SH1000. Этот штамм содержит плазмиду pSK236 Трансфер с промоутером пенициллин связывая протеин 2, сливается с кассеты репортер luxABCDE от Photohabdus luminescens¹⁸.
2. Подготовка tryptic соевый бульон (TSB) путем смешивания 0,03 г порошка TSB мл чистой воды и автоклав TSB стерилизовать. Когда остынет, добавьте любые необходимые антибиотики, используя стерильную методику. В этом протоколе добавьте 10 мкг/мл хлорамфеникол¹⁸ TSB выбрать для выражения плазмида pSK236 трансфер, который содержит кассеты luxABCDE биолюминесценции.
3. Выберите 3-4 отдельными колониями от S. aureus пластины в БСЭ с 10 мкг/мл хлорамфеникол начать ночь культуры. Инкубируйте бактерий на инкубирования шейкер при 37 ° C ночь (16 ч).
4. Начало новой бактериальной культуры от ночи культуры путем разбавления образца 1:50 в БСЭ с хлорамфеникола 10 мкг/мл. Культура в инкубирования шейкер на 200 об/мин и 37 ° C.
5. Два часа после разделения S. aureus, контроля оптической плотности на 600 Нм (OD₆₀₀) на спектрофотометре. Наблюдать за ОД₆₀₀ против время найти середине логарифмической фазы роста. Для ALC2906 SH1000 штамма ОД₆₀₀ 0.5 середине логарифмических и соответствует концентрации 1 x 10⁸ кое/мл (рис. 1).
6. Когда ОД₆₀₀ 0,5, промойте бактерий 1:1 с ледяной DPBS. Центрифуга для бактерий для 10 мин на 3000 x g и 4 ° C. Тщательно сцеживаться супернатант и добавить дополнительные охлажденной DPBS и вихревой тщательно. Центрифуга еще раз за 10 мин на 3000 x g и 4 ° C.
7. Осторожно декантируют супернатант. Ресуспензируйте бактериальных Пелле в нужной концентрации. Для этих исследований сбор 3 мл ALC2906 SH1000 и Ресуспензируйте в 1,5 мл PBS, соотнося к концентрации бактерий около 2 x 10⁸ кое/мл. Держите бактерии на льду до использования.
8. Чтобы проверить концентрация бактерий, разбавляют 100 мкл мэм бактериальных образца и картирование в PBS. Тарелка 20 мкл аликвоты на плите агар. Инкубировать при 37 ° C в увлажненные инкубатор для 16 h. количество CFUs валовой экзамен и рассчитать бактериальных концентратов следующий день.

3. эксцизионная кожи Wounding и прививка с S. aureus

1. Управлять 100 мкл бупренорфина гидрохлорида 0,03 мг/мл (~0.2 мг/кг) для каждой мыши через внутрибрюшинной инъекции.
2. Двадцать минут после инъекции, место 2-4 мышей в камере с 2-3 л кислорода с 2-4% изофлюрановая. Как только мышей полностью наркоз, передача мышей, один момент для носовой конус подключены к 2-3 л кислорода с 2-4% изофлюрановая. Убедитесь, что мышь полностью под наркозом, твердо щипать каждый задние лапы между большим и указательным пальцами. Если животное не реагирует на крайнем случае перейдите к следующему шагу.
3. Бритье 1 дюйм секцией 2 дюйма на задней части мыши с Электрические ножницы и очистить область меха вырезки с помощью чистых протрите или марлей. Избегайте использования депиляционный крем, потому что это может вызвать избыточное воспаление.
4. Очистите от задней части мыши сначала с 10% повидон йод смоченную марлю и затем с 70% этанол смоченной марлей. Чистота области в спирали, перемещение наружу от центра области хирургического. Подождите примерно 1 мин для хирургического области высохнуть до операции.
5. Держите бритая сзади мыши свободно между двумя пальцами и твердо нажмите биопсии удар стерильным 6 мм в центре области подготовленных хирургического. Не тяните кожу подтянутой.
   1. Твист удар биопсии для создания круговой контур на коже, полностью проходит через кожу в по крайней мере один раздел набросков. Будьте осторожны, чтобы не нарезать базовой фасции или ткани.
   2. Используйте стерильные ножницы, щипцы для прорезать эпидермиса и дермы круговой схеме, запечатленный удар биопсии.

4. S. стафилококк прививка

1. Заполните 28 G инсулина шприц с желаемой биолюминесцентных бактериальных отливках. В этом исследовании, применять в концентрации 1 x 10⁸ кое/мл (50 мкл). Не управлять более чем 100 мкл тома.
2. Придать 50 мкл отливках между фасции и ткани в центре раны на задней части мыши. Убедитесь, что модификатор образует пузырь в центре раны с минимальной утечки или рассеяния.
   1. Вытяните дермы в сторону, возьмите шприц почти параллельно в ткани и медленно толкать шприц в ткани, пока не почувствовал резкое снижение сопротивления, который указывает пирсинг фасции. Тщательно вести шприц в центре раны и обойтись отливках медленно. Медленно снимите шприц из животного.
3. Придать такой же объем стерильных PBS в раны неинфицированных животных, как описано выше.
4. Вернуть животное к своей клетке. Поместить клетку под тепла лампы или поверх грелку и контролировать животное до выздоровления от анестезии.

5. в Vivo BLI и FLI

1. Инициализируйте весь животных томографа через инструмент программного обеспечения. Анестезировать мышей в камере получать 2-3 л кислорода с 2-4% изофлюрановая. Доставить анестезии nosecones внутри томографа.
2. Поместите мышь раненых и инфицированных в томографа. Поместите указатель мыши таким образом, что раны как плоский как можно скорее. Используйте следующие настройки последовательности изображений мышей.
   1. Выберите режим визуализации люминесценции и сфотографировать . Выдержка — 1 мин на небольших биннинга и F/stop 1 (люминесценции) и F/стоп 8 (фотография). Фильтр выбросов является открытым. Нажмите кнопку получить для записи образа.
   2. Выберите режим визуализации флуоресценции и сфотографировать . Время экспозиции-1 s на небольших биннинга и F/stop 1 (флуоресценции) и F/стоп 8 (фотография) Длина волны возбуждения 465/30 Нм и длиной волны 520/20 Нм выбросов с Лампа высокая интенсивность. Нажмите кнопку получить для записи образа.
3. Вернуть животное его клетке и монитор до выздоровления от анестезии.
4. Изображения мышей ежедневно, как описано выше.

6. анализ

1. Открытые изображения поддаются количественной оценке.
2. Место большой круговой области интереса (ROI) над районом всю рану, включая окружающие кожи для каждой мыши на изображении. Нейтрофилов в естественных условиях FLI EGFP сигналов и сигналов в естественных условиях BLI S. aureus выходят за пределы края раны после нескольких дней и были включены в эти исследования (рис. 2A и 2B). Нажмите кнопку Мера ROI и записи значения для средней потока для каждой мыши. Участок средний поток времени против каждого сигнала (p/s).
3. Если абсолютное число нейтрофилов или Стафилококк золотистый в рану, выполните следующие эксперименты.
   1. Соотнести нейтрофилов чисел в естественных условиях сигналы FLI EGFP, ранение мышей C57BL/6J как описано выше и передавать широкий спектр костного мозга, полученных нейтрофилов (5 x 10⁵ до 1 x 10-⁷) LysM-EGFP или LysM-EGFPxMyD88^{- / -} доноров непосредственно на вершине различные раны. Изображение как описано выше и соотносятся в естественных условиях EGFP FLI сигналов на известное количество нейтрофилов.
   2. Чтобы сопоставить S. aureus кое в естественных условиях BLI сигналы, раны и заразить мышей, как описано выше. На 1 день после инфекции записи в естественных условиях BLI сигналы от мышей и немедленно усыпить и холод туши. Акцизный рану, гомогенизировать ткани и тарелка бактериальных разведений на агар для ночи инкубации. На следующий день, количество колоний для определения кое на рану.
4. Для измерения раны исцеления подходят круговой ROI над краем раны и мера области раны (²см) и сюжет дробных переход от базовых против времени (рис. 2 c).

7. Статистика

Примечание: Все данные представлены как средние ±SEM. считались статистически значимыми p < 0,05

1. Определить различия между двумя группами на один день с использованием метода Holm-Sidak, альфа = 0,05 и анализировать каждый момент индивидуально, не предполагая последовательно SD.
2. Сравните различия между несколькими группами в тот же день, односторонний дисперсионный анализ с нескольких сравнений posttest Тьюки. Выживание между экспериментальной группами была проанализирована методом Mantel-Кокс.

LysM-EGFP × MyD88- / - мышей более восприимчивы к инфекции S. aureus , чем LysM-EGFP мышей

Штамма S. aureus , используемые в данном исследовании, ALC290618, был построен с плазмида, содержащий люкс конструкцию, которая производит биолюминесцентных сигналы от живой и активно метаболизма бактерий. Когда прививку в мышей, в естественных условиях биолюминесценции (BLI) методы визуализации может использоваться для продольно измерения бремени бактерий внутри инфицированная рана. LysM-EGFP × MyD88- / - мышей и LysM-EGFP мышей были ранены и инфицированных 1 x 107 кое S. aureus в рану, чтобы сравнить их восприимчивость к инфекции S. aureus . LysM-EGFP × MyD88- / - мышей показало большую восприимчивость к инфекции, чем LysM-EGFP мышей продемонстрировано 80% летальность LysM-EGFP × MyD88- / - мышей за первые 8 дней по сравнению с 0% летальность LysM-EGFP мышей в течение инфекции всего 15-дневная продолжительность эксперимента (рис. 3A). Обе штаммов мышей потерял ~ 5% массы тела после инфицирования, но LysM-EGFP мышей восстановленные оригинальные вес 2 день, в то время как LysM-EGFP × MyD88- / - мышей не восстановить потеряли вес (рис. 3B). Закрытие раны при наличии инфекции S. aureus не отличается между двумя штаммами; Однако среду раненых LysM-EGFP × MyD88- / - имел значительный дефект в заживлении ран, по сравнению с LysM-EGFP мышей (рис. 3 c), как сообщалось ранее,19. Всего изображений животных был использован для измерения бактериальных бремя ежедневно, и уже в день 1, LysM-EGFP × MyD88- / - раны были выше бактериальных бремя, чем LysM-EGFP раны. LysM-EGFP мышей управляемые инфекции и уменьшилось в естественных условиях BLI сигналов в рану, а LysM-EGFP × MyD88- / - мышей выставлены увеличение бактериальных бремя, что перестала расти на 4 день до смерти животного (Рисунок 3D,E). Вместе эти данные свидетельствуют о повышенной восприимчивости LysM-EGFP × MyD88- / - мышей заражению S. aureus , по сравнению с LysM-EGFP мышей.

Нейтрофильные людьми с нарушениями зрения в S. aureus инфицированных мышей- / - LysM-EGFP × MyD88, по сравнению с LysM-EGFP мышей

LysM-EGFP мыши производит Зеленый флуоресцентный нейтрофилов благодаря EGFP белков закодированы течению лизоцима М промоутер12. Эта мышь была использована для изучения продольной в естественных условиях нейтрофилов торговли в ответ на кожный S. aureus инфекции13,14,20,21,22. Для сравнения нейтрофилов кинетика раны, производится на LysM-EGFP × MyD88- / - мышей и LysM-EGFP, раны кожи полная толщина 6 мм осуществляется на спинке, и мышей были образы ежедневно. 40% снижение оборота нейтрофилов раны наблюдалась в LysM-EGFP × MyD88- / - по сравнению с LysM-EGFP мышей (рис. 4A, C). Когда сразу после ранения был введен 1 x 107 кое S. aureus , нейтрофильные людьми было ослаблять в обоих штаммов мышей, но LysM-EGFP × MyD88- / - мышей были более чувствительны к инфекции S. aureus с что касается нейтрофилов набора. Инфекции, вызванной 50% уменьшение первоначальной нейтрофилов, людьми LysM-EGFP × MyD88- / - раны по сравнению с 15%, отмеченное в LysM-EGFP раны (Рисунок 4B). LysM-EGFP мышей также набраны значительно больше нейтрофилов в рану на более поздних стадиях инфекции (рис. 4A,C), по сравнению с LysM-EGFP × MyD88- / - мышей, которые не смогли увеличить число нейтрофилов даже в наличие постоянной бактериальной нагрузки. Вместе эти данные показывают, что LysM-EGFP × MyD88- / - мышей имеют дефект в нейтрофильные набора, который согласуется с их повышенной восприимчивости к инфекции S. aureus .

Рисунок 1: Корреляция между ОД600 и КФУ подсчитывает для ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 колонии были выбрали из агар пластины и переведены в БСЭ с 10 мкг/мл хлорамфеникол ночь культуры. На следующий день, подвеска была разделить 1:50 на TSB с 10 мкг/мл хлорамфеникола и культивировали. Оптическая плотность при 600 Нм (600OD) был измерен в регулярные промежутки времени после 2 часов, используя спектрофотометр. При каждом измерении бактерий был разбавленным картирование в ледяной PBS и aliquoted на агаре пластину для ночи инкубации. CFUs были подсчитаны следующий день для расчета начальной концентрации и коррелирует с ОД600. N = 3 с 4 различных измерений600 ОД в эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: представитель область интересов (ROI) для анализа данных. Для анализа в естественных условиях BLI и в естественных условиях FLI сигналов, большие, эквивалентного размера трансформирования были сосредоточены на рану и измерялась всего потока (фотоны в секунду). Чтобы измерить закрытия РАН, ROI был подходят для края раны и была измерена площадь (2см). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: LysM-EGFP × MyD88 мышей- / - более восприимчивы к инфекции S. aureus , по сравнению с LysM-EGFP мышей. LysM-EGFP и LysM-EGFP × MyD88- / - мышей были ведении 6 мм намотанной на спинке и инфицированы 1 x 107 кое биолюминесцентных S. aureus или стерильного физиологического раствора. Животные были контролироваться ежедневно и выживания (A) и (B) вес были записаны. Животные были образы ежедневно на размер раны мера (C) и (D) бактериальной люминесценции. (E) представитель биолюминесцентных образы изображены от зараженных LysM-EGFP и LysM-EGFP × MyD88- / - мышей. Шкалы бар = 3 мм. данные представляют собой 7-16 мышей на группу для A, C, и D и 3 мышей за группы B и выражаются как среднее ±SEM. * p = 0,05, ** p = 0,01, ***p = 0,001, *p < 0,0001 между инфицированных (A, B, < / C18 > и D) или (C) групп неинфицированных. Статистическая значимость определялась с помощью теста Mantel-Кокс (A) и метод Holm-Sidak (B-D), альфа = 0,05 и каждый раз точка была проанализирована индивидуально, не предполагая последовательно SD. пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть больше версия этой фигуры.

Рисунок 4: LysM-EGFP × MyD88- / - мышей имеют дефектного нейтрофилов набора для инфицированных ран.
LysM-EGFP и LysM-EGFP × MyD88- / - мышей были ведении 6 мм намотанной на спинке и инфицированы 1 x 107 кое биолюминесцентных S. aureus или стерильного физиологического раствора. Животные были образы ежедневно измерять содержание нейтрофилов (A, B). (C) представитель флуоресцентного изображения изображены от инфицированных и неинфицированных LysM-EGFP и LysM-EGFP × MyD88- / - мышей. Шкалы бар = 5 мм. данные представляют собой 8-16 мыши на группу и выражаются как среднее ±SEM. * p < 0,05, ** p < 0.01, и *** p < 0,001 между инфицированных группы и # p < 0.01 между неинфицированных групп (A) или как изображенные на графике (B). Статистическая значимость был определен с помощью метода Holm-Sidak (A), альфа = 0,05 и каждый раз точка была проанализирована индивидуально, не предполагая последовательно SD и односторонний дисперсионный анализ (B), с несколькими Тьюки-сравнения После тестирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Ллойд S. Миллер получил грантовую поддержку от визуальной, Pfizer, Regeneron, Чан Сун-Шионг Nanthealth фонд и консалтинговые услуги от применения инновационных технологий биотерапевтических Noveome и Чан Сун-Шионг Nanthealth фонд, которые не имеют отношения к работе в этой статье. Другие авторы имеют ничего не разглашать.