Method Article

Идентификация Роман CK2 киназы субстратов, используя универсальный подход биохимические

DOI:

10.3791/59037

⸱

February 21st, 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель настоящего Протокола заключается в этикетке, обогатить и идентифицировать субстратов протеинкиназы CK2 от сложный биологический образец например lysate клетки или ткани огневки. Этот метод использует уникальные аспекты CK2 биологии для этой цели.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение отношения киназы субстрат имеет важное значение для полного понимания функций этих ферментов и их вниз по течению целей в физиологических и патологических государствах. CK2 является эволюционно сохранены Серин/треонин киназу с растущим списком сотен субстратов, участвующих в нескольких клеточных процессах. Благодаря своим свойствам плейотропный выявления и классификации всеобъемлющий набор CK2 субстратов был особенно сложным и остается препятствием в изучении этой важной фермента. Для решения этой проблемы, мы разработали универсальный экспериментальной стратегии, которая позволяет целевых обогащения и идентификации предполагаемого CK2 субстратов. Этот протокол использует уникальный двойной Сопредседатель субстратная специфичность по CK2 позволяя для конкретных thiophosphorylation его субстратов в клетки или ткани lysate. Эти белки субстрата, впоследствии алкилированные, immunoprecipitated и выявленные жидкостной хроматографии/тандемные масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Ранее мы использовали этот подход успешно определить CK2 субстратов из яичников дрозофилы и здесь мы распространить применение настоящего протокола для клеток глиобластомы человека, иллюстрирующие адаптации этого метода для расследования биологической роли этой киназы в различных модельных организмов и экспериментальных систем.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеинкиназы являются ключевыми компонентами трансдукции сигнала каскады. Фосфорилирование белков субстрата этими ферментами выпытывают биологических реакций, которые регулируют критические события контролируя деление клеток, обмен веществ и дифференциации, среди других. CK2 является повсеместно выражаются, ацидофильной Серин/треонин киназу, сохраняется из дрожжей для людей и который играет важную роль во многих клеточных процессах, начиная от регуляцию клеточного цикла прогрессии к апоптозу1 ,2,3. Фермент является heterotetramer, состоящий из двух каталитических α (или α') субблоков и два регулирующих β субблоков4. В дополнение к весьма плейотропный, CK2 экспонатов два других необычные характеристики усложняют его анализа, а именно учредительные деятельности5 и двойной Сопредседатель субстрата специфика6. Это последний свойство наделяет CK2 с возможностью использования гтп, а также АТФ для фосфорилирование белков субстрата.

Генетическая удаление катализатора или регулирования подразделений CK2 мышей приводит к эмбриональной летальность, указав, что он играет решающую роль во время разработки и Органогенез7,8. CK2 также оверэкспрессировали в нескольких типов рака и таким образом представляет собой многообещающие терапевтические задачи9,10,11. Действительно специфичные ингибиторы что целевой CK2 киназы деятельность в настоящее время проводится расследование для этой цели по12,,1314. В то время как ингибирование CK2 является жизнеспособным вариантом, учитывая его плейотропный характер, альтернативу, и возможно более рациональный подход для критических подложек CK2, которые лежат в основе прогрессирования некоторых видов рака. Таким образом всеобъемлющее определение и характеристика CK2 субстрата белков бы значительные выгоды для выяснения конкретных функцией(ями) этой киназы в пределах определенного типа ткани или опухоли.

Здесь мы описываем универсальный биохимическим методом для выявления CK2 подложек из сложных биологических образцов такие клетки или ткани lysate. Этот протокол использует двойной Сопредседатель субстратная специфичность CK2 использованием GTP аналог GTPγS (гуанозина 5'-[γ-thio]triphosphate), что нельзя использовать другие эндогенные киназы. Это позволяет эффективно киназы «маркировать» его субстратов в этом образце для последующего изоляции и идентификации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Убедитесь, что необходимые материалы доступны и должным образом подготовленных (см. Таблицу материалы).

1. Подготовка

  1. Механически лизируйте образцы тканей (1-2 мг ткани в 100 мкл буфера lysis, Таблица 1) или культивируемых клеток (плита 10 см, 80-90% притока в 350 мкл буфера lysis), с целью собрать в общей сложности 900 мкл пример для эксперимента. Обратите внимание, что этот объем в незначительное превышение то, что требуется для эксперимента, описанных ниже.
  2. Спин вниз образцы центрифугированием на 17500 x g 3 минут при 4 ° C. По завершении передачи 270 мкл супернатант каждому из трех новых microcentrifuge 1,7 мл пробирок. Там будет примерно 90 мкл оставшихся. Удаление 40 мкл использоваться как «входной контроль» и место в новой трубки. Поместите все образцы на льду.

2. киназы пробирного: thiophosphorylation и алкилирования

  1. Обозначить три пробирки, содержащие 270 мкл следующим образом: «киназы rxn», «GTPγS только», и «PNBM (p-nitrobezyl мезилата) только». Подготовьте реакции киназы.
    1. Для «киназы rxn» трубки мкл 2.7 (эквивалент 1350 U) CK2, затем 2.7 мкл 2,5 мм GTPγS.
    2. «GTPγS только» трубы 2.7 мкл 2,5 мм GTPγS, а затем добавьте 2.7 мкл буфера lysis.
    3. «PNBM только» трубы 5.4 мкл буфера lysis. Флик все трубы смешать и затем немедленно разместить на льду.
  2. Инкубируйте все три трубы за 1 мин на водяной бане 30 ° С. После инкубации мкл 13,5 12 мг/мл PNBM для всех трех труб. Инвертировать смешивать образцов. Инкубируйте эти образцы при комнатной температуре в течение 1 ч.
  3. После запуска инкубации в шаге 2.2, подготовьте опреснительной столбцы как можно скорее как процесс занимает около 45 минут.

3. Подготовка обессоливания столбцы

  1. Первоначально Подготовьте столбцы (3 для этого примера эксперимента), инвертирование каждый столбец несколько раз, чтобы вновь приостановить торфов G-25 смолы в буфере для хранения. Разрешить смолы урегулировать путем присоединения каждого столбца зажим стенда и позволить ему сидеть спокойно на примерно 5 мин.
  2. После урегулирования торфов G-25 смолы, снимите крышки с верхней и нижней части столбца чтобы буфер хранения для слива самотеком и иметь трубу, расположенную ниже нижней открытия для сбора потока через для отмены.
  3. Как только буфер пуст, добавьте приблизительно 2,7 мл буфера lysis для того, чтобы сбалансировать столбцы. Собирать потока через и отбросить. Повторите 3 раза. После окончательного уравновешивания столбцы готовы к шаг 4.1.

4. Удаление PNBM

  1. После завершения 1 ч инкубации (шаг 2.2) и подготовка (шаг 3) столбец, применять образцы к столбцам. Этикетке каждого столбца следующим образом: «киназы rxn», «Только GTPγS» и «Только PNBM». Загрузите все каждого образца на соответствующий столбец. Собирать и отбросить потока через.
  2. Стирать образцы, добавив 420 мкл буфера lysis для каждого столбца. Разрешить литического буфера для фильтрации через колонку и собирать потока через для отмены. После этого шага мыть место трубы в положение для сбора проб.
  3. Элюировать образцы, добавив 500 мкл буфера lysis для каждого столбца. Соберите проточный, которая теперь содержит thiophosphorylated и алкилированные CK2 субстратов.

5. иммунопреципитации: Часть I

  1. Подготовьте образцы для иммунопреципитации, первое удаление 80 мкл пример «элюции входного контроля» от каждого из соответствующих смывах («киназы rxn», «Только GTPγS» и «PNBM только») собраны в шаге 4.3. После удаления 80 мкл от каждого образца будет приблизительно 420 мкл, оставаясь на сэмпл.
    1. Каждый образец разделен на 2 пробирки, содержащие 200 мкл. Этикетке каждой соответствующей трубы: «киназы rxn анти тиофосфат Эстер», «киназы rxn IgG», «GTPγS анти тиофосфат Эстер», «GTPγS IgG», «PNBM анти тиофосфат Эстер» и «PNBM IgG».
  2. Добавление 2,8 мкг анти тиофосфат Эстер антитела к каждой из трубок Эстер помечены анти тиофосфат и 2,8 мкг isotype антитела управления каждой из трубок IgG меченых. Место труб на вращателе на 4 ° C на 2 ч.
  3. Начните подготовку протеина A/G шарик в течение последних 15 мин 2 h инкубации в шаге 5.2.

6. белок A/G агарозы шарик подготовка

  1. Кратко вихревой хранения трубки для обеспечения бусины полностью вновь приостановлено. Отрезать конца Р200 пипеткой наконечник с использованием чистого лезвия бритвы для того чтобы увеличить калибровочных размер. Накапайте 100 мкл суспензии шарик в иммунопреципитации в новые пробки microcentrifuge 1,7 мл. Для этого примера необходимо в общей сложности 6 трубок.
  2. Центрифуга для трубы на 17500 x g 1 мин при 4 ° C. Супернатант снимите и выбросьте. Вновь приостановите бисер в 200 мкл буфера lysis, и кратко вихря. Повторите спин и мыть шаги 3 раза.
  3. После окончательного мыть место бисер на льду до инкубации в шаге 5.2 завершения.

7. иммунопреципитации: Часть II

  1. После 2 ч инкубации из шага 5.2 спина вниз образцов 17500 x g 3 мин при 4 ° C. После центрифугирования добавьте 200 мкл от каждого образца трубки промывают бисером. Место труб на вращателе на 4 ° C на 1 час.
  2. После инкубации 1 h центрифуга трубы на 17500 x g 1 мин при 4 ° C. Далее удалите 40 мкл супернатант из каждого образца и сохраните как элемент «истощения» (всего 6 трубок). Удалите оставшуюся часть супернатант и отменить. Заботиться, чтобы не мешать шарики.
  3. Стирать образцы, добавив 200 мкл буфера lysis и vortexing кратко. Затем центрифуги на 17500 x g 1 мин при 4 ° C. Супернатант снимите и выбросьте. Повторите мыть и спина шаги 3 раза. Заботиться, чтобы не мешать шарики во время этих шагов.
  4. После завершения шагов мыть, 50 мкл 2 x буфер образца для каждого образца, содержащего бусины. Для всех других образцов, мкл 8 6 x буфер образца: «входной контроль», «элюции ввода» и «истощение элементы управления».
  5. Как только буфер добавляется к трубкам, накапайте вверх и вниз, чтобы смешать и нагреть все образцы на 95 ° C за 5 мин до разбирательства с SDS-PAGE.

8. анализ и проверка результатов

  1. Проверка успешной CK2-зависимой thiophosphorylation и алкилирования.
    1. Чтобы определить эффективность CK2-опосредованной thiophosphorylation шаге 2.2, выполняют SDS-PAGE и Западный blotting, запустив 15-20 мкл «Элюирующий элементы управления вводом» собраны в шаге 5.1 на 12,5% полиакриламидном геле.
    2. Зонд мембраны с следующих антител: анти тиофосфат Эстер, анти CK2α и анти GAPDH (или другой элемент управления, соответствующий загрузки). Если этот шаг был успешным, сигнал Эстер расширенной анти тиофосфат должно быть очевидным в полосу «киназы rxn», по сравнению с другими две полосы (рис. 2).
  2. Визуализировать обогащенного предполагаемого субстратов CK2 и идентификации белков.
    1. Чтобы оценить если иммунопреципитации шаги выполнены успешно, выполните 25-30 мкл образцов этого eluted из бисера на шаге 7,4 на отдельном геля полиакриламида 12,5%. Убедитесь, что все оборудование является чистым и надевайте перчатки во все времена во время этого шага для сведения к минимуму загрязнения.
    2. Пятно гель с Кумасси синий визуализировать обогащенного белки из различных стадиях экспериментальный протокол (рис. 3). С помощью новых razorblades, тщательно акцизных уникальный полосы в полосу «киназы rxn анти тиофосфат Эстер IP», отмечая их приблизительное молекулярным весом.
    3. Отправьте эти полосы для идентификации белков, жидкостной хроматографии/тандемные масс-спектрометрии (LC-MS/MS) (Рисунок 4). Если имеются антитела, направленные против определенных белков, подтверждают результаты масс-спектрометрии, SDS-PAGE и immunoblotting из ввода, истощены, и IP фракций, собранных в ходе протокола (рис. 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема экспериментальной процедуры представлена на рисунке 1. В основе техники лежит необычные способности CK2 использовать GTP для передачи группы фосфорила. Добавление внешних CK2 Холофермент наряду с GTP аналог, GTPγS, lysate клетки приводит к thiophosphorylation эндогенных CK2 субстратов. Последующее лечение lysate с алкилирующим мезилат реагент p- nitrobenzyl (PNBM) создает тиофосфат Эстер остаток этих белков конкретного субстрата, которые затем ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем относительно простой биохимическим методом для выявления субстратов протеинкиназы CK2 от сложных биологических образцов. Важнейшие шаги настоящего Протокола основаны на необычные ферментативных свойств CK2 и включают CK2-зависимой thiophosphorylation конкретного субстрата белков с помощью GTPγS и их последующее иммунопреципитации и идентификации. С учетом этих результатов мы продемонстрировали полезность и универсальность этого подхода как сейчас, мы применили эту стратегию в клетки человека г...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа частично поддержали Содружества универсальный исследования повышение грант от Пенсильвании Департамента здравоохранения для T.I.S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 мг/мл PNBMAbcamab13891040,5 &; L
2,5 мМ ГТФ и гамма; SSigma-AldrichG8634-1MG5.4 &; L
Anti-CK2α (E-7) мышиное моноклональное антителоSanta Cruz Biotechnologysc-3738941:1000 для вестерн-блоттинга
Анти-GAPDH (6C5) мышиное моноклональное антителоSanta Cruz Biotechnologysc-322331:1000 для вестерн-блоттинга
Антинуклеолин кролика поликлональное антителоAbcamab227581:1000 для вестерн-блоттинга
Анти-тиофосфатный эфир [51-8] кроличье моноклональное антителоAbcamab92570Варьируется (конечная концентрация 2,8 &; g для каждого образца)
Центрифуга предварительно настроена на 4º CThermoScientificSorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 
cOmplete Mini EDTA-Free Protillness InhibitorRoche11836170001
Lysis BufferСмотрите рецепт нижеСмотрите рецепт ниже30 мл
Нормальное антитело IgG кролика (контроль изотипа)Технология клеточной сигнализации2729S Варьируется (конечная концентрация 2,8 & микро; г для каждого образца)
PD MiniTrap КолонкаGE Healthcare28-9180-103 колонки
Белок A/G плюс агарозные бусиныSanta Cruz Biotechnologysc-2003600 &m; L
Рекомбинантный человеческий CK2 голоэнзимNew England BiolabsP6010S2.7 & микро; L
RotatorLabnet: Mini LabrollerMini Labroller SKU# H5500
T98G клетки глиобластомы человекаATCCCRL-1690
Водяная баня предварительно установлена на 30º CShel LabH20 Серия ванных Модель# SWB15

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
  2. Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
  3. Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
  4. Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
  5. Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
  6. Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
  7. Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
  8. Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
  9. Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
  10. Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
  11. Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
  12. Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
  13. Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70(2015).
  14. Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
  15. Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858(2014).
  16. Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
  17. Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
  18. McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
  19. Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
  20. Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97(2017).
  21. Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460(2013).
  22. Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
  23. Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CK2 SubstratesKinase AssayThiophosphorylationLC MS MSImmunoprecipitationGTPgammaS LabelingSephadex G 25Anti Thiophosphate EsterProtein IdentificationWestern Blot

Related Articles