Цель настоящего Протокола заключается в этикетке, обогатить и идентифицировать субстратов протеинкиназы CK2 от сложный биологический образец например lysate клетки или ткани огневки. Этот метод использует уникальные аспекты CK2 биологии для этой цели.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Идентификация Роман CK2 киназы субстратов, используя универсальный подход биохимические
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изучение отношения киназы субстрат имеет важное значение для полного понимания функций этих ферментов и их вниз по течению целей в физиологических и патологических государствах. CK2 является эволюционно сохранены Серин/треонин киназу с растущим списком сотен субстратов, участвующих в нескольких клеточных процессах. Благодаря своим свойствам плейотропный выявления и классификации всеобъемлющий набор CK2 субстратов был особенно сложным и остается препятствием в изучении этой важной фермента. Для решения этой проблемы, мы разработали универсальный экспериментальной стратегии, которая позволяет целевых обогащения и идентификации предполагаемого CK2 субстратов. Этот протокол использует уникальный двойной Сопредседатель субстратная специфичность по CK2 позволяя для конкретных thiophosphorylation его субстратов в клетки или ткани lysate. Эти белки субстрата, впоследствии алкилированные, immunoprecipitated и выявленные жидкостной хроматографии/тандемные масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Ранее мы использовали этот подход успешно определить CK2 субстратов из яичников дрозофилы и здесь мы распространить применение настоящего протокола для клеток глиобластомы человека, иллюстрирующие адаптации этого метода для расследования биологической роли этой киназы в различных модельных организмов и экспериментальных систем.
Введение
Протеинкиназы являются ключевыми компонентами трансдукции сигнала каскады. Фосфорилирование белков субстрата этими ферментами выпытывают биологических реакций, которые регулируют критические события контролируя деление клеток, обмен веществ и дифференциации, среди других. CK2 является повсеместно выражаются, ацидофильной Серин/треонин киназу, сохраняется из дрожжей для людей и который играет важную роль во многих клеточных процессах, начиная от регуляцию клеточного цикла прогрессии к апоптозу1 ,2,3. Фермент является heterotetramer, состоящий из двух каталитических α (или α')....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Убедитесь, что необходимые материалы доступны и должным образом подготовленных (см. Таблицу материалы).
1. Подготовка
- Механически лизируйте образцы тканей (1-2 мг ткани в 100 мкл буфера lysis, Таблица 1) или культивируемых клеток (плита 10 см, 80-90% притока в 350 мкл буфера lysis), с целью собрать в общей сложности 900 мкл пример для эксперимента. Обратите внимание, что этот объем в незначительное превышение то, что требуется для эксперимента, описанных ниже.
- Спин вниз образцы центрифугированием на 17500 x g 3 минут при 4 ° C. По завершении передачи 270 мкл супернат....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Схема экспериментальной процедуры представлена на рисунке 1. В основе техники лежит необычные способности CK2 использовать GTP для передачи группы фосфорила. Добавление внешних CK2 Холофермент наряду с GTP аналог, GTPγS, lysate клетки приводит к thiophosphorylation эндогенных CK2 субстратов. Последующее лечение lysate с алкилирующим мезилат реагент p- nitrobenzyl (PNBM) создает тиофосфат Эстер остаток этих белков конкретного субстрата, которые затем .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем относительно простой биохимическим методом для выявления субстратов протеинкиназы CK2 от сложных биологических образцов. Важнейшие шаги настоящего Протокола основаны на необычные ферментативных свойств CK2 и включают CK2-зависимой thiophosphorylation конкретного субстрата белков с помощью GTPγS и их последующее иммунопреципитации и идентификации. С учетом этих результатов мы продемонстрировали полезность и универсальность этого подхода как сейчас, мы применили эту стратегию в клетки человека г.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа частично поддержали Содружества универсальный исследования повышение грант от Пенсильвании Департамента здравоохранения для T.I.S.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 12 мг/мл PNBM | Abcam | ab138910 | 40,5 &; L |
| 2,5 мМ ГТФ и гамма; S | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 &; L |
| Anti-CK2α (E-7) мышиное моноклональное антитело | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 для вестерн-блоттинга |
| Анти-GAPDH (6C5) мышиное моноклональное антитело | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 для вестерн-блоттинга |
| Антинуклеолин кролика поликлональное антитело | Abcam | ab22758 | 1:1000 для вестерн-блоттинга |
| Анти-тиофосфатный эфир [51-8] кроличье моноклональное антитело | Abcam | ab92570 | Варьируется (конечная концентрация 2,8 &; g для каждого образца) |
| Центрифуга предварительно настроена на 4º C | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protillness Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | Смотрите рецепт ниже | Смотрите рецепт ниже | 30 мл |
| Нормальное антитело IgG кролика (контроль изотипа) | Технология клеточной сигнализации | 2729S | Варьируется (конечная концентрация 2,8 & микро; г для каждого образца) |
| PD MiniTrap Колонка | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 колонки |
| Белок A/G плюс агарозные бусины | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 &m; L |
| Рекомбинантный человеческий CK2 голоэнзим | New England Biolabs | P6010S | 2.7 & микро; L |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G клетки глиобластомы человека | ATCC | CRL-1690 | |
| Водяная баня предварительно установлена на 30º C | Shel Lab | H20 Серия ванных Модель# SWB15 |
Ссылки
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
