Методическая статья

Анализ скорости потребления кислорода в неонатальной кардиомиоцитов культивировали мыши с помощью анализатора внеклеточного потока

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59052

⸱

13 февраля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Pharmacology, University of California San Diego, 3Cardiology Section, Department of Medicine, Veterans Administration Healthcare, San Diego

В этой статье

Краткое содержание

Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы проиллюстрировать использование мыши неонатальной cardiomyocytes как модель системы для изучения, как различные факторы могут изменить потребление кислорода в самом сердце.

Аннотация

Митохондрии и окислительного метаболизма являются критическими для поддержания функции сердечной мышцы. Исследования показали, что митохондриальной дисфункции является важным фактором для нарушения функции сердца, в сердечной недостаточности. Контрастом восстановление дефектных митохондриальной функции может иметь благоприятные последствия для улучшения сердечной функции, в противном случае сердце. Таким образом изучая механизмы регулирования и выявления роман регуляторы для функции митохондрий может обеспечить понимание, которые могут быть использованы для разработки новых терапевтических целей для лечения болезни сердца. Здесь сердечной myocyte митохондриальное дыхание анализируется с использованием системы культуры уникальный клеток. Во-первых протокол был оптимизирован для быстро изолировать и культура высокой жизнеспособности новорожденного мыши кардиомиоцитов. Затем анализатор внеклеточного поток 96-луночных формат используется для оценки норма расхода кислорода этих кардиомиоцитов. Для этого протокола мы оптимизирована посева условий и продемонстрировал, что темпы потребления кислорода кардиомиоцитов неонатальной мыши можно легко оценивать внеклеточного потока анализатора. Наконец мы отмечаем, что наш протокол может быть применен к большим размером культуры и другие исследования, такие как внутриклеточной сигнализации и сократительной функции анализа.

Введение

Для поддержания непрерывной сократительной функции сердца, кардиомиоцитов должны поддерживать постоянную поставку клеточной энергии в виде АТФ1. В самом центре около 95% АТФ генерируется митохондрий, главным образом через окислительное фосфорилирование, показаны, что митохондрии играть решающую роль биоэнергетический в сердечной функции2,3. Поддерживая это понятие, что dysregulation митохондриальной функции может привести к сердечной недостаточности и кардиомиопатия4,5. И наоборот, восстановление функции митохондрий было показано для улучшения сердечной функции неисправного сердце6,7. Таким образом изучая механизм митохондриальной биоэнергетики и выявления роман регуляторы митохондриальной функции в cardiomyocytes будет не только выявить механистический идеи производства сердечной энергии, но также может обеспечить понимание того, что приведет для развития новых терапевтических целей для лечения заболеваний сердца6,8.

По сравнению с всем сердцем, который содержит смесь миоцитов и не миоцитах9, cardiomyocyte культур очень чистый, с минимальным загрязнением не миоцитах от сердца, таких как фибробластов и эндотелиальных клеток10. Кроме того изоляция кардиомиоцитов из новорожденных щенков позволяет культивирование большое количество клеток в небольшом количестве времени, по сравнению с переключательным клетки от взрослых сердец10,11. Самое главное культивированный взрослых мыши кардиомиоцитов имеют короткие выживания раз (например, 24 ч) и на длительное время точек де продифференцируйте. Cardiomyocytes новорожденных мыши может выжить и манипулировать для свыше 7 дней в культуре, что делает их идеальными для тестирования воздействия наркотиков соединений и генные манипуляции на функцию митохондрий в cardiomyocytes10. Конечно Существуют значительные биологические различия между клетками взрослых и новорожденных, но дольше продолжительность культуре клеток новорожденных делает их подходящими для различных типов исследований, в том числе митохондриальной функции.

На сегодняшний день основной культурный новорожденных крыс и мышей кардиомиоцитов используются в качестве модели для изучения сердца Биоэнергетика12,13. В последние годы исследования используется анализатор внеклеточного потока для измерения скорости потребления кислорода (OCR) и оценки окислительного потенциала в мышь и крыса неонатальной кардиомиоцитов14,15. Хотя по сравнению с крысами, жизнеспособность клеток новорожденных кардиомиоцитов мыши ниже и имеет большую изменчивость16. Кроме того возможность изучать клетки генетически модифицированные мыши модели делает ячеечная модель мыши очень важно. Учитывая, что OCR исследования настолько чувствительны к ячейке количество и плотность посева, необходима разработка воспроизводимых, надежной и простой протокол для достижения последовательного клеток урожайность и жизнеспособности.

Здесь мы приводим оптимизированный протокол, который был разработан, который использует культивировали мыши неонатальной кардиомиоцитов наряду с 96-хорошо формат внеклеточного потока анализатор для анализа OCR. Этот протокол значительно увеличивает воспроизводимость анализа. Кроме того протокол не только обеспечивает Роман и воспроизводимый метод для анализа OCR, но также могут быть адаптированы к культуре большего размера для других экспериментальных целей, например, которые могут быть необходимы для изучения миофибрилл функций и внутриклеточной сигнальные пути.

В частности этот протокол описывает один день процедура изоляции и культуры кардиомиоцитов неонатальной мыши в пластине культуры 96-луночных клеток. Кроме того он описывает процедуру для измерения потребления кислорода с помощью анализатора внеклеточного потока. Все решения, используемые в стерильную или стерильной фильтрации. Все инструменты стерилизуются, 75% этанола. Мы предоставляем Таблицу материалов для различных частей процедуры. Для культивирования кардиомиоцитов, все процедуры и шаги выполняются в капюшоне культуры стандартной ячейки. Этот протокол разработан для изоляции сердца новорожденных мыши из одного помета (примерно 8-10 щенков). Однако протокол также может быть адаптирована для изоляции кардиомиоцитов из нескольких пометов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Для работы с новорожденных мышей пожалуйста, обратитесь к набору руководящих принципов местного университета/института вперед программами ухода за животными и придерживаться своих институциональных и других соответствующих правил. Все методы, описанные в настоящем протоколе были одобрены UC Сан-Диего институциональных животное уход и использование Комитет (IACUC) и придерживаться правил федеральных и государственных.

1. Подготовка реагентов

  1. Подготовка 25 мл раствора предварительно пищеварения: HBSS (без Ca2 + и Mg2 +) дополнены трипсина (0.5 мг/мл). Стерилизовать решения с помощью фильтра 0.22 мкм и держать на льду до использования. Сделайте предварительный пищеварение решение в день эксперимента.
    Примечание: Очень важно использовать HBSS без Ca2 + и Mg2 +, как Ca2 + и Mg2 + вызовет сокращение myocyte и последующие клеточной гибели во время изоляции.
  2. Подготовка 30 мл коллагеназы пищеварениебуфера: коллагеназа (0,8 мг/мл, примерно 350 ед/мл) растворяют в HBSS (без Ca2 + и Mg2 +) буфера. Стерилизовать решения с помощью фильтра 0.22 мкм и держать на льду до использования. Сделайте коллагеназы пищеварение решение в день эксперимента.
  3. Подготовка 500 мл cardiomyocyte культуры массовой информации (рост): Mix DMEM 375 мл, 125 мл M-199, 25 мл сыворотки лошади и 12,5 мл FBS. Дополнение с 1% пенициллина и стрептомицина 1% раствор.
  4. Подготовка среднего митохондриальной стресс-тест: сделать 200 мл DMEM на основе среднего стресс-тест (DMEM без NaHCO3, см. Таблицу материалы) дополнены пируват натрия 1 мм, 2 мм L-глютамином и глюкоза 10 мм и 2 мм Hepes.
    Примечание: Сделайте 1 Л с DMEM среды без пируват натрия, L-глютамин, глюкозы и Hepes, фильтром стерильные и хранить в 4 ° C. Подготовка среднего стресс-тест в день assay путем добавления других реагентов. С помощью DMEM среднего без NaHCO3 имеет решающее значение.
  5. Отрегулируйте пэ-аш митохондриальной стресс-тест СМИ до 7,4 в день использования. Теплый СМИ до 37 ° C перед использованием.
  6. Подготовка oligomycin: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
  7. Подготовка FCCP: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
  8. Подготовка antimycin A: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
  9. Подготовить ротенон: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
    Примечание: В таблице 1перечислены все реагенты и решения, используемые в настоящем Протоколе.

2. Заготовка и предварительно пищеварение сердец от новорожденных мышей (1 день)

  1. Автоклав ножницы, щипцы и ложкой Мории стерилизовать.
  2. Выполните все шаги в капот культуры клеток для бесплодия.
  3. Аликвота 5 мл HBSS (без Ca2 +, мг2 +) для каждой скважины 6-ну клетки культуры плиты; место на льду. Аликвота 10 мл HBSS в блюдо культуры клеток 10 см.
  4. Подготовка 20 мл раствора предварительно Пищеварение трипсина в 50 мл стерильного Конические трубки. Держите все решения на льду.
  5. Быстро окуните новорожденных (день 0) мышах в 70% этанола раствор для стерилизации.
  6. Обезглавить щенков, используя стерильные ножницы (прямой) без наркоза, а затем открыть сундук вдоль грудины, чтобы разрешить доступ к грудной полости и сердце. (Рис. 1A)
    Примечание: 1) очень важно использовать P0 новорожденных мышей для достижения жизнеспособности высокой клеток. 2) Этот метод эвтаназия разрешена для новорожденных в соответствии с руководящими принципами низ и американской ветеринарной медицинской ассоциации 17.
  7. Извлечение сердца из тела с тонкой ножницы и передачи непосредственно в стерильных клетки культуры блюдо, содержащие HBSS (без Ca2 +, мг2 +) (рис. 1B).
  8. Удалите любые остаточные легочной ткани, более крупных судов и т.д. (и атриумов, при необходимости). Помыть сердца в HBSS решения с помощью нежный агитации.
  9. 8 нарезать каждое сердце с тонкой ножницы и передавать все ткани сердца с щипцами в одну скважину 6-ну клетки культуры плиты с HBSS (Рисунок 1 c и 1 D).
  10. Помыть сердца путем передачи сердца от скважины в пластину 6-хорошо наполненный HBSS, используя ложку Мории (рис. 1 d).
    Примечание: Передача сердца от скважины является достаточно промыть крови. Поскольку кровь вмешивается ферментативного пищеварения важно помыть сердца с HBSS и удалить кровь.
  11. Передача сердца ложкой Мориа в коническую пробирку, содержащую 20 мл трипсина (0.5 мг/мл) и инкубировать с нежным агитации на 4° C для 4 h (Рисунок 1E).

3. Подготовьте тарелку 96-луночных культуры (день 1)

  1. Подготовить 5 мл раствора покрытие: PBS, содержащие желатин (автоклав перед использованием) 0,5% и 1% раствор фибронектин. (например, 5 мл раствора желатина плюс 50 мкл раствора фибронектин)
  2. Раствор для нанесения покрытия в каждой скважине пластину культуры клеток 96-луночных аликвота 50 мкл (см. Таблицу материалы). Если присутствуют пузырьки, удалите их с помощью пипетки 20 мкл сосать пузыри вне.
    Примечание: Важно охватить все площади поверхности каждой скважины с раствор для нанесения покрытия.
  3. Инкубируйте пластину в инкубатор культуры клеток 37 ° C за 1 ч или больше, чтобы позволить сушки покрытия матрицы.
  4. Аспирационная любое решение остаточного покрытия перед посевом кардиомиоцитов.

4. ферментативный пищеварения и обшивка клеток (1 день)

  1. Предварительно теплой коллагеназы пищеварение раствор в ванну воды 37 ° C.
    Примечание: Этот шаг является важным для достижения эффективной ферментативного пищеварения.
  2. Переместите конические трубка, содержащая сердца и предварительно пищеварение решение от 4 ° C капот культуры клеток. (Рисунок 1F)
  3. Пусть сердца опускаться на дно трубки и удалить предварительно пищеварение решение с помощью Пипетки серологические 10 мл (1-2 мл среды изоляции может оставаться в трубе).
  4. Добавьте 10 мл HBSS в трубу. Вновь приостановить сердца с HBSS 2 - 3 раза промыть трипсина, используя Серологические Пипетки 10 мл. Аспирационная HBSS (1-2 мл может оставаться в трубе).
  5. Добавьте 10 мл раствора подогретым коллагеназы пищеварение в пробирку с сердечками. (Рис. 1 g)
  6. Инкубировать трубки с сердечками на водяной бане 10 минут без агитации 37 ° C (1 пищеварение).
  7. После 1-й пищеварение переместите трубку на капот культуры клеток. Аккуратно нарезанных сердца путем повторного приостановления сердца внутри трубки, нежно 10 раз с помощью Пипетки серологические 10 мл. Это позволит клетки выйдет из ткани сердца и сердца разойтись. (Рис. 1 H)
    Примечание: Так как кардиомиоцитов хрупки, нежный Тритурация имеет важное значение для достижения высокой жизнеспособности.
  8. Пусть непереваренных ткани раковина, передачи переваривается раствор обогащенный кардиомиоцитов (примерно 9-10 мл) для новой Конические трубки и сразу же добавить равное количество клеток культуры СМИ прекратить коллагеназы пищеварение.
  9. Добавьте 10 мл раствора коллагеназы пищеварение в пробирку, содержащую оставшиеся непереваренных сердечной ткани.
  10. Инкубировать трубку с ткани сердца в водяной бане 10 минут 37 ° C (2-й пищеварение).
  11. Повторите процедуру 4.7 и 4.8.
    Примечание: Если есть еще много непереваренных ткани, повторите пищеварение еще один раз. Однако в большинстве случаев, две пищеварения являются достаточно, чтобы разогнать большинства клеток из ткани сердца.
  12. Место стерильным клеток сито (100 мкм нейлоновая сетка) в новый стерильный 50 мл Конические трубки. Предварительно Влажные клетки ситечко с 2-3 мл клетки культуры средств массовой информации и передайте клетки через клетки ситечко. Промойте клетки ситечко с 2-3 мл клетки культуры средств массовой информации. (Рисунок 1I)
  13. Центрифуга конические трубка, содержащая кардиомиоцитов за 5 мин при 180 x g (Рисунок 1J). Аспирационная супернатант (рис. 1 K), который будет содержать клетки ткани мусор и вновь приостановить Пелле клеток в 10 мл СМИ культуры клеток (рис. 1 Л).
  14. Нежно ресуспензируйте клетки и клетки пластины на культуры клеток 10 см блюдо (пластик без любой тип покрытия) и инкубировать 1 час в инкубатор культуры клеток (1 предварительного покрытия) (рис. 1 M). Этот шаг перед покрытием позволяет non кардиомиоцитов, например фибробластов и эндотелиальных клеток, придерживаться блюдо немелованной культуры клеток.
    Примечание: На данный момент кардиомиоцитов обычно круглой формы и появляются блестящие под микроскопом. (Рисунок 1N).
  15. После инкубации 1 h аккуратно агитировать плиты, мыть не сторонник клетки (обогащенный кардиомиоцитов) от 10 см культуры блюдо и вновь приостановить клетки, неоднократно закупорить клетки культуры среднего за блюдо с помощью Пипетки серологические 10 мл. Затем не сторонник клетки (обогащенный кардиомиоцитов) перехода в новое блюдо культуры клеток 10 см (пластик без каких-либо покрытия) и проинкубируйте еще 1 ч в инкубатор культуры клеток (2 предварительного покрытия).
    Примечание: Клетки, которые придают пластину-покрытием являются преимущественно не кардиомиоцитов: фибробластов и эндотелиальных клеток, которые могут быть визуализированы под микроскопом (Рисунок 1O).
  16. После 2 Предварительная обшивка, осторожно агитировать плиты, мыть не сторонник клетки (кардиомиоцитов) от 10 см культуры блюдо, а затем перевести кардиомиоцитов в новой 50 мл Конические трубки.

5. Подсчет клеток и гальванических клеток в культуре плиту 96-луночных клеток (1 день)

  1. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
  2. Пластина клетки в 96-луночных клетки культуры пластины внеклеточного матрикса покрытием на плотности между 10-30 x 103 клеток/колодец с помощью многоканальных дозаторов в окончательном объеме 200 мкл (рис. 1 P). Использование скважин А1, A12, H1 и H12 для фона: 200 мкл питательной среды как другие скважины в этих скважинах (без клетки). Инкубируйте пластины в инкубатор культуры клеток 37 ° C.
    Примечание: В этом исследовании потребление кислорода был протестирован с помощью различных клеток плотности или 10 x 103, 20 x 103, 30 x 103 клеток/хорошо. (Рис. 2A). Кроме того, как указано выше кардиомиоцитов сразу после изоляции обычно круглой формы и появляются блестящие под микроскопом. В течение 16-24 ч культуры будет расплющить жизнеспособных клеток.

6. кислорода Assay потребления с помощью анализатора внеклеточного Flux 96-хорошо формат (день 2)

Примечание: Пробирного потребление кислорода может осуществляться через один день после покрытия клетки или более поздней версии. Неонатальный кардиомиоцитов культивированный используя этот протокол может продержаться до 7 дней пост изоляции.

  1. Гидрат картридж датчик анализатор потока (см. Таблицу материалы) для по крайней мере 3 часа, но в идеале на полный рабочий день, до assay. Добавить 200 мкл раствора Calibrant (см. Таблицу материалы) в каждой скважины пластину Утилита, поместить датчик картридж обратно на пластину утилита и инкубировать в инкубаторе 37 ° C без CO2 или O2 добавок.
  2. Изменить ячейки культуры средств массовой информации на митохондрии стресс тест средний один час до assay. Cardiomyocytes являются хрупкими. Таким образом аккуратно извлеките носитель культуры клеток с помощью многоканальных дозаторов и вымыть клетки с 200 мкл подогретым митохондриальной стресс-тест СМИ дважды. После второй мыть 175 мкл подогретым митохондрий стресс тест СМИ и культура клетки в инкубаторе 37 ° C без CO2 или O2 добавок.
  3. Подготовьте концентрированной испытаний соединений. Для стресс-теста митохондрий Подготовьте 3,0 мл 16 мкм oligomycin, 9 мкм FCCP и смесь из 20 мкм ротенон и 20 мкм antimycin A, все в среде митохондриальной стресс-тест.
    Примечание: Каждое соединение на концентрации, в описанный был протестирован. Однако необходима титрования концентрации каждого соединения в собственной лаборатории.
  4. Загрузите 25 мкл каждого соединения в порты инжектор датчик картриджа с помощью многоканальных дозаторов (Рисунок 1 квартал). Объем и конечная концентрация, описаны в таблице 2.
  5. Настройте протокол assay внеклеточного потока. Программа описана в Таблица 3.
  6. Запустите программу. Во-первых Вставьте картридж датчик в машину для калибровки (Рисунок 1R). Замените calibrant на пластину пробирного после калибровки шаг делается.
    Примечание: С помощью программного обеспечения, предоставленного изготовителем, указывают группы скважин и каждое соединение и порт.
  7. При желании, после анализа, тщательно удалить все пробирного среднего с помощью многоканальных дозаторов и хранить микроплиты культуры клеток при-20 ° C для нормализации будущих клеток, используя assay протеина.
  8. Измерить содержание белка. Добавьте 50 мкл стандартного раствора лизис клетки RIPA (см. Таблицу материалы). Инкубируйте пластину на льду на 30 минут, чтобы полностью Лизируйте клетки. Передать все материалы нового ясно плоская 96 хорошо пробирного днище.
  9. Измерить концентрацию белка BCA пробирного согласно протоколу от производителя.
    Примечание: Покрытие также с внеклеточного матрикса приводит к высоким содержанием белка концентрацию в каждой скважине. Таким образом вычтите количество фон well(s) (без клетки) чтобы получить фактические ячейки концентрацию белка. Концентрация белка, полученные из клеток низка в плиту 96-луночных культуры. Кроме того концентрация белка может варьироваться от скважины из-за покрытия внеклеточного матрикса. Таким образом предлагается использование мобильный номер для нормализации OCR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С помощью протокола описаны, сердца были изолированы от день 0 новорожденных щенков. 5 x 105 клеток/щенка были получены, и кардиомиоцитов были осеменены на плотности 10 x 103, 20 x 103или 30 x 103 клеток/Ну, в 96 хорошо пластины (рис. 2A). После ночи культуры, были найдены кардиомиоцитов хорошо прилагаемый к поверхности покрытые пластиковые и там было очень мало неприсоединенной клетки (неприсоединенной клетки будут...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы создали простой протокол для изоляции и культивирования мыши неонатальной кардиомиоцитов. Используя эти кардиомиоцитов, мы также оптимизировали условий для измерения скорости потребления кислорода с помощью системы анализатора внеклеточного потока. Протокол позволяет использовать мышь неонатальной cardiomyocytes как модель системы рассмотреть, как различные факторы могут изменить потребление кислорода в основной рабочей клетки сердца, сродни что будет измеряться в органе, нетронутыми. Наш протокол ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить всех Росс лаборатории и лаборатории членов Мерфи. Эта работа поддерживается американской ассоциации сердца (14SDG17790005) клуба NIH (HL115933, HL127806) и заслуги ва (BX003260) для R.S.R.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антимицин АSIGMAA8674Ингибирует комплекс III митохондриального
клеточного фильтра 100 μ m порыFALCON352360Для захвата непереваренной ткани
Коллагеназа типа IIWorthingtonLS004176Для получения раствора для расщепления коллагеназы
D-глюкозаSIGMA75351Для изготовления митоходнриальной среды для стресс-тестов
DMEM с высоким содержанием глюкозыLife technologies11965-092Для изготовления среды
для культивирования клетокDMEM без NaHCO3, глюкозы, пирувата, глюманина и HepesSIGMAD5030-10X1LДля изготовления митоходнриальной среды для стресс-тестов
FCCP (карбонилцианид 4-(трифторметокси)фенилгидразона)SIGMAC2920Разъединение митохондриального дыхания
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life technologies26140-079Для изготовления среды для культивирования клеток
фибронектин из Плазма крупного рогатого скотаSIGMAF1141-5MGДля изготовления покрытия для тарелок для тканевых культур
Тонкие ножницыFine Sciences Tools14060-10Для препарирования сердец
Желатин из кожи свиньиSIGMAG-1890Для приготовления покрывающего раствора для тканевых культуральных планшетов
HBSS (сбалансированный раствор соли Хэнка, без Ca2+, Mg2+)Cellgro21-022-CVДля промывания сердец и приготовления раствора для предварительного переваривания и разложения коллагназы
HEPES (1M)Fisher scientific15630080Для изготовления митоходнриальной стресс-тестовой среды
Лошадиная сывороткаLife technologies26050-088Для изготовления питательной среды для клеточных культур
L-глутаминSIGMAG-3126Для изготовления митоходнриальной стресс-тестовой среды
M-199Cellgro10-060-CVДля изготовления среды для клеточных культур
ложка Moria FisherscientificNC9190356Для мытья сердец...
ОлигомицинSIGMA75351-5MGИнгибирует митохондриальную АТФ-синтазу
RIPA буферFisher scientific89900Для лизирования клеток для анализа белка
РотенонSIGMAR8875Ингибирует комплекс I митохондрий
Морской конек XFe96 Анализатор внеклеточного потока
AgilentУстройство, используемое для анализа скорости
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102601-100Упаковка планшетов для анализа влажности культуральных планшетов, сенсорных картриджей и калибра
Пируват натрияSIGMAP2256Для изготовления митоходнриальной среды для стресс-тестов
Прямые ножницыFine Sciences Tools91401-12Для вскрытия сердец
Шприц-фильтр 0,2 мкм; m размерДля стерильной фильтрации сбраживаемой среды
TrypsinUSB Corporation22715 25GMДля приготовления раствора предварительного сбраживания
потребления кислорода

Ссылки

  1. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
  2. Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
  3. Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
  4. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
  5. Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116(2015).
  6. Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
  7. Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).
  8. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
  9. Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
  10. Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
  11. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
  12. Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
  13. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).
  14. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
  15. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
  16. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
  17. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  18. Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
  19. Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
  20. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  21. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  22. Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
  23. Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
  24. Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
  25. Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
  26. Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
  27. Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
  28. Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
  29. Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
  30. Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
  31. Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
  32. Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

96FCCP

Похожие статьи