Описанные здесь — это метод для анализа экспрессии генов бактерий в животных тканях на клеточном уровне. Этот метод предоставляет ресурс для изучения фенотипического разнообразия, происходящих в пределах бактериальная популяция в ответ на ткани окружающей среды во время инфекции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Для изучения бактериальный ген регулирование в инфицированных тканях метод, основанный на флуоресцирования
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Генов вирулентности бактерий, часто регулируются на уровне транскрипционный анализ многочисленных факторов, которые реагируют на различные экологические сигналы. Некоторые факторы действуют непосредственно на генов вирулентности; другие управления патогенеза, регулируя выражение течению регуляторов или накопление сигналов, которые влияют на активность регулятор. В то время как регулирование широко изучен во время роста в пробирке , относительно мало известно о как выражение гена корректируется во время инфекции. Такая информация имеет важное значение, когда продукт определенного гена является кандидатом для терапевтического вмешательства. Транскрипционный анализ подходов, как количественных, реальном времени RT-PCR и РНК-Seq мощных способов изучения экспрессии генов на глобальном уровне, но страдают от многих технических проблем, включая низкий обилие бактериальной РНК, по сравнению с принимающей РНК и пример деградация, полиадениновый. Оценки регулирования с использованием флуоресцентных Репортеры сравнительно легко и может быть мультиплексированием с флуоресцентных белков с уникальными спектральных свойств. Метод позволяет для одной ячейки, пространственно-временных анализ экспрессии генов в тканях, которые демонстрируют сложные трехмерные архитектуры и физико градиенты, которые влияют на бактериальных регулирования сети. Такая информация теряется, когда данные усредняются над населением оптом. Здесь мы описываем метод количественной оценки экспрессии генов в бактериальных патогенов в situ. Метод основан на обработке простой ткани и прямого наблюдения флуоресценции белков репортер. Мы продемонстрировать полезность этой системы путем изучения выражение стафилококк thermonuclease (КНУ), чей продукт гена необходим для иммунной уклонения и полное вирулентности ex vivo и in vivo. Мы покажем, что nuc-gfp сильно выражена в почечной абсцессов и частично разглашать гетерогенных ген выражение из-за очевидной пространственных регулирования деятельности промоутер КНУ в гнойнички, полностью занимается иммунного ответа. Этот метод может применяться к любой бактерии с манипулируемой генетическую систему и модель любой инфекции, предоставляя ценную информацию для доклинических исследований и разработки лекарств.
Введение
Бактерии реагировать на меняющиеся физиологические условия и изменения в состоянии питания их окружающей среды дифференциально выражением генов, необходимых для адаптации и выживания. К примеру оппортунистических патогенов колонизировать тела поверхностей при относительно низкой плотности и зачастую безвредны. Однако после бактерии проникли физические и химические барьеры, он должен бороться с принимающей иммунных клеток борьбе с оборону и ограниченного наличия питательных веществ1. Например золотистый стафилококк колонизирует приблизительно одну треть населения бессимптомно, но также является причиной разрушительных кожи и инфекций мя....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Джорджтаунского университета.
1. поколение штамма флуоресцентные репортер
- Дайджест генома интегративной pRB4 вектор последовательно с EcoRI и ссии энзимов ограничения. После производителя протокол, создана ночь пищеварение с ссии, используя 1 мкг pRB4 при 25 ° C и затем продолжите второй пищеварение за 1 ч при 37 ° C, добавив EcoRI в реакционной смеси. Инактивации ферментов, инкубации при 65 ° C для 20 мин.
- PCR усиливает нормативной области интереса от геномной ДНК (в данном случае, ~ 350 пар ДНК фрагмент, содержа....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы разработали плазмида, производный от pMAD32 , который может доставить любой репортер сплавливания построить в хромосоме, двойной кроссовер гомологичная рекомбинация (рис. 1). Эта конструкция позволяет для количественного анализа любого регулирования региона, которая поддерживает производство белка GFP и флуоресцентного сигнала выше фона. Плазмида наделяет ампициллин сопротивления (rAp) для обслуживания и распространения в.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Бактериальных инфекционных заболеваний являются растущей проблемой здравоохранения во всем мире за счет приобретения антибиотикорезистентности детерминанты46. Потому, что адаптация к принимающей среде имеет важное значение для роста и выживания во время инфекции, стратегии, ориентированные программы выражение гена повышающие возбудителя фитнес может оказаться полезным терапевтически. Одна из таких программ является набор генов, контролируемых SaeR/S два компонента системы (TCS), играть важную роль.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим Александра Horswill за дар PsarAP1- tdTomato fusion и Карен Кресвелл за помощь с cytometry анализ потока. Мы также благодарим Alyssa короля за консультацией по статистического анализа. Эта работа частично финансируется NIH награду разведочных/развития исследований (Грант AI123708) и факультет запуска средства SRB. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и толкование или решение представить работу для публикации.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5% овечьей крови | Hardy Diagnostics (Санта-Мария, Калифорния) | A10 | |
| 5-бром-4-хлор-3-индолил-&бета;-D-галактопиранозид (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
| Ампициллин | Фишер Scientific | BP1760-25 | |
| C57Bl/6 мышей | Charles River | NA | |
| Хлорамфеникол | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
| конфокальный лазерный сканирующий микроскоп | Zeiss | NA | |
| криостатный микротом | Thermo Scientific | NA | |
| Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
| D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Коралвилль, Айова) | NA | |
| DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Эритромицин | Sigma-Aldrich | E5389 | |
| Анализатор потока | Becton Dickinson | NA | |
| стеклянные бусины | Sigma | Z273627 | |
| Miniprep, плазмида | Promega | A1220 | |
| орбитальная встряхивающая водяная баня | New Brunswick Innova | NA | |
| ПЦР очистка | QIagen | 28106 | |
| Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) | Считыватель планшетов Cellgrow | 46-013-CM | |
| Tecan | NA | ||
| Precellys 24 гомогенизатор | Bertin Laboratories | NA | |
| pUC57-Kan | GenScript (Пискатауэй, Нью-Джерси) | NA | |
| Q5 Taq ДНК-полимераза | New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс) | M0491S | |
| Ферменты рестрикции | Новинка England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
| Обратная транскриптаза | New England BioLabs | E6300L | |
| Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
| Sub Xero прозрачная тканевая замораживающая среда | Mercedes Medical | MER5000 | |
| Superfrost Plus предметные стекла для микроскопа | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
| Шприц, фильтр | VWR International | 28145-481 | |
| Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Мембранный перминированный краситель нуклеиновых кислот |
| Тетрациклин | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Триптический соевый бульон | VWR | 90000-376 | |
| УФ-видимый спектрофотометр | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
| Vectashield Antifade Монтажная среда с DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
Ссылки
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-5....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
