Методическая статья

Сборка молекулярной челноков, руководствовался обратимо придает Kinesins

DOI:

10.3791/59068

⸱

26 января 2019 г.

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол для создания молекулярных челноки, где поверхность придерживается кинезин моторов белков продвинуть красителя, меченного микротрубочек. Слабого взаимодействия kinesins с поверхностью позволяет их реверсивные привязанность к нему. Это создает систему наноразмерных, которая exhibits динамической сборки и разборки его компонентов, сохраняя при этом свою функциональность.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает создание кинезин питание молекулярная челноки с насадкой слабых и реверсивные kinesins к поверхности. В отличие от предыдущих протоколов, в этой системе микротрубочки набирать кинезин моторов белков из раствора и разместить их на поверхность. Kinesins, в свою очередь, облегчит скольжения микротрубочек вдоль поверхности перед десорбирующиеся обратно в основной раствор, таким образом, для вновь набранных. Этот непрерывный монтаж и демонтаж приводит к поразительным динамического поведения в системе, таких как формирование временных кинезин тропы путем скольжения микротрубочек.

На протяжении всего этого эксперимента будут описаны несколько экспериментальных методов: UV-Vis спектрофотометрии будет использоваться для определения концентрации запасов растворов реагентов, coverslips сначала будет озона и ультрафиолетового (УФ) лечение, а затем silanized Прежде чем монтируется в поток клетки и полного внутреннего отражения флуоресценции микроскопии (TIRF) будет использоваться для одновременно изображения кинезин двигатели и микротрубочек нитей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взаимодействия, регулирующие поведение активных наносистем всегда были характерны долгоживущих, почти необратимого облигаций1,2,3,4,5,6 ,,78. Хорошо изучена примером этого является система микротрубочек кинезин, где скольжения микротрубочек propelled необратимо поверхности прыгните кинезин двигатели1,2,3,4, 5. Системы, в которых компоненты обратимо связаны друг с другом были теоретически изучал9,10 и достигнутые на macroscale11,12, но масштабирование этих систем вниз наноразмерных был сложным. Одна из главных причин для этого что ломать и реформирование связей между компонентами часто требует большого изменения условий окружающей среды. Даже несмотря на то, что такие изменения были осуществлены в последние13,14,15, они будут полагаться на изменения самой системы, а не его адаптации к окружающей среде. Проектирование систем молекулярном уровне, в которых компоненты постоянно собирать и реорганизовать в структуры, не нарушая общей окружающей среды, в которых происходят эксперименты откроет дверь к исследованию широкий спектр динамического поведения 16 , 17.

Здесь мы описываем и продемонстрировать подробный протокол для создания динамически монтаж и демонтаж системы функционирования на наноуровне. Системы и ее общее поведение был введен ранее18: микротрубочек нитей propelled треков обратимо поверхности прыгните кинезин-1 двигатели. Эти моторные белки кинезин набираются из раствора, чтобы помочь продвинуть вперед, микротрубочки перед десорбирующиеся снова вскоре после этого. После того, как обратно в растворе, они могут быть набраны снова чтобы продвинуть новые микротрубочек. В последние13,14,15, разорвать и реформирования облигаций требуется экологических изменений; в отличие от окружающей среды нашего потока ячейки остается неизменным, в то время как кинезин двигатели взаимодействовать с поверхностью.

Этот протокол поможет заинтересованным исследователям (1) визуализировать все действия протокола, и (2) помочь при устранении неполадок такого рода анализа. Она была получена из процедур, описанных в Говард et al. 1993 года19.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. решение подготовка

Предупреждение: Три реактивы, используемые в настоящем Протоколе (толуол, диметилдихлорсилана и Дитиотреитол) являются высоко токсичен. Обратитесь листы данных соответствующей безопасности материала (MSDS) перед использованием. Кроме того части настоящего Протокола должны выполняться под более высокий уровень защиты, носить защитные очки и два комплекта защитные перчатки, как указано. Если не рекомендовано, эксперименты могут выполняться на стенды лаборатории используя все надлежащие средства личной защиты (очки, перчатки, лаборатории пальто, полная длина штаны и закрыты носок обуви).

Примечание: Концентрации ATP, Кинезин и микротрубочек, используемые в настоящем Протоколе может быть изменен с учетом потребностей каждого эксперимента. Однако если изменения, пожалуйста, убедитесь, что окончательный концентрации других реагентов остаются теми же, как указано ниже. Все эксперименты проводились при комнатной температуре (~ 25 ° C).

  1. Подготовка запасов решений
    Примечание: Подготовьте и аликвота следующие решения заранее. Все аликвоты может быть подготовлен при комнатной температуре (~ 25 ° C).
    1. BRB80 буфера
      Примечание: Буфер для большинства решений, используемые в настоящем Протоколе — BRB80. BRB80 могут быть подготовлены в больших количествах и храниться в морозильной камере-20 ° С.
      1. Распустить 24.2 g пиперазина N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (трубы) и 3,1 г гидроксида калия (KOH) в 800 мл в деионизированной воде сделать 800 мл труб 100 мм. Добавьте 100 мл хлорида магния 10 мм (MgCl2) и 100 мл 10 мм этиленгликоля tetraacetic кислоты (EGTA), чтобы получить окончательный объем 1 л повышение pH 8 с гидроксидом калия (KOH) может помочь в растворении труб и EGTA.
        Примечание: Окончательный концентрации химических веществ в буфере BRB80 являются трубы 80 мм, 1 мм MgCl2и 1 мм EGTA.
      2. Отрегулируйте пэ-аш буфера 6.9 использование Кох и соляной кислоты (HCl).
    2. ATP
      1. Приготовляют раствор 1 мл 100 мм АТФ в ультрачистая вода. Накапайте раствор в 10 мкл аликвоты. Храните в морозильной камере-80 ° C аликвоты.
    3. GTP
      1. Подготовка 500 мкл раствора 25 мм GTP в ультрачистая вода. Накапайте раствор в 5 мкл аликвоты. Храните в морозильной камере-80 ° C аликвоты.
    4. 2 MgCl
      1. Приготовляют раствор 1 мл 100 мм2 MgCl в ультрачистая вода. Накапайте раствор в 10 мкл аликвоты. Храните в морозильной камере-20 ° C аликвоты.
    5. Казеин
      1. Весят 1 г сухого казеина и перенести его на 50 мл конические пластиковых пробирок. Добавьте 35 мл BRB80 буфера трубка для растворения порошка казеина.
      2. Поместите раствор в стакан в холодной комнате распустить на ночь. На данный момент решение будет выглядеть густой и вязкой.
      3. Оставьте трубу вертикально в холодильнике 4 ° C для любого большого нерастворенных сгустки урегулировать. Супернатант передать новой трубки.
      4. Вращайте трубу в центрифуге на 1000 x g для пеллет из больше осадков. Еще раз передать супернатант новой трубки.
      5. Неоднократно фильтр решения с помощью 0,2 мкм (7 бар максимальное давление) фильтры. Решение, толстые, многие фильтры будет засоряться, поэтому Повторяйте этот шаг до тех пор, пока фильтр не ясно и unclogged.
      6. Определите концентрацию казеина в результате решения с помощью спектрофотометрии УФ-вид, используя коэффициент вымирания казеина в 19 мм-1∙cm-1 280 Нм20. Предполагая, молекулярный вес 23 кДа казеина, разбавьте раствор к концентрации 20 mg∙mL-1 в BRB80.
      7. Накапайте раствор в 20 мкл аликвоты и хранить в холодильнике-20 ° C аликвоты.
    6. D-глюкоза
      1. Приготовляют раствор 1 мл 2 M D-глюкозы в ультрачистая вода. Накапайте раствор в 10 мкл аликвоты. Храните в морозильной камере-20 ° C аликвоты.
    7. Глюкозооксидаза
      1. Приготовляют раствор 1 мл 20 глюкозооксидаза-1 mg∙mL в BRB80. Накапайте раствор в 10 мкл аликвоты. Храните в морозильной камере-20 ° C аликвоты.
    8. Каталаза
      1. Приготовляют раствор 1 мл 0,8-1 каталазы mg∙mL в BRB80. Накапайте раствор в 10 мкл аликвоты. Храните в морозильной камере-20 ° C аликвоты.
    9. Дитиотреитол (DTT)
      Примечание: Поскольку DTT, слегка летучих токсичных, пожалуйста, выполните следующие действия под вытяжного шкафа.
      1. Приготовляют раствор 1 мл 1 м DTT, разбавленный ультрачистая вода. Накапайте раствор в 10 мкл аликвоты. Храните в морозильной камере-20 ° C аликвоты.
    10. Паклитаксел
      1. Приготовляют раствор 1 мл 1 мм паклитаксела разводят в ДМСО. Накапайте раствор в 10 мкл аликвоты. Храните в морозильной камере-20 ° C аликвоты.
    11. Диметилсульфоксид (ДМСО)
      Примечание: ДМСО, используемые в этих экспериментах чисто.
      1. Накапайте 1 мл чистого ДМСО в 10 мкл аликвоты. Храните в морозильной камере-20 ° C аликвоты.
    12. Креатин Фосфат
      1. Приготовляют раствор 1 мл 0,2 М креатин фосфата в ультрачистая вода. Накапайте раствор в 10 мкл аликвоты. Храните в морозильной камере-20 ° C аликвоты.
    13. Креатин КК
      1. Подготовить раствор 1 мл 200 units· L-1 применение креатина в ультрачистая вода. Накапайте раствор в 10 мкл аликвоты. Храните в морозильной камере-20 ° C аликвоты.
    14. Никель (II) сульфат
      1. Подготовка 500 мл раствора сульфата никеля (II) 50 мм в ультрачистая вода. Хранят раствор при комнатной температуре (~ 25 ° C).
    15. Poly(Ethylene GLYCOL) блок poly(propylene glycol) блок poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) решение
      1. Весят, 2 мг PEG-PPG-ПЭГ (Среднечисловая молекулярная масса: 14 600 g∙mol-1)-НТА порошка на взвешивание бумаги. ПЭГ-PPG-PEG-НТА является сополимер триблок, функционализированных с группой Нитрилотриуксусная кислота (НТА). Обратитесь к Таблице материалы для более подробной информации о PEG-PPG-PEG-НТА.
      2. Передача порошка в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Добавьте 1 mL Стоковый раствор сульфата никеля (II) на трубу. Вихревой до тех пор, пока порошок растворяется и не видна сгустки остаются.
      3. Магазин на срок до одного месяца при комнатной температуре.
  2. Перед началом эксперимента
    1. Заполните ведро со льдом.
    2. Возьмите один Алиготе от каждого из 13 реагентов, описанные в разделах 1.1.1 к 1.1.13 выше и добавить их в ведро, таким образом сохраняя их на льду. Оттепель каждый из реагентов перед использованием.
  3. Подготовка микротрубочек
    Примечание: Микротрубочек были полимеризуется от 20 мкг Алиготе краситель меченых лиофилизированные тубулина. Длина волны возбуждения краситель, 647 Нм.
    1. Подготовка буфера рост микротрубочки
      1. Накапайте 21,8 мкл буфера BRB80 в малых (0,6 мл) microcentrifuge трубки. Добавьте 1 мкл MgCl2 Стоковый раствор, 1 мкл GTP Стоковый раствор и 1.2 мкл ДМСО Стоковый раствор.
        Примечание: Таким образом, окончательный концентрации реагентов в буфере BRB80, 4 мм MgCl2, 1 мм ГТФ и 5% (v/v) диметилсульфоксида.
    2. Микротрубочки полимеризации
      1. Добавьте 6,25 мкл микротрубочек роста буфера непосредственно в 20 мкг Алиготе помечены лиофилизированные тубулина. Вихревой Алиготе 5 s на 30 rps.
      2. Прохладный Алиготе на льду за 5 мин до инкубации при 37 ° C 45 мин и перейдите к раздел 1.3.3.
    3. Микротрубочки стабилизации
      1. Добавьте 5 мкл раствора aliquoted паклитаксел 490 мкл буфера BRB80. Вихревой решение для 10 s на 30 rps.
      2. После 45 минут инкубации для микротрубочек вверх, добавьте 5 мкл раствора полимеризованной микротрубочек в BRB80/паклитаксел решение.
        Примечание: Это 100-кратного разбавленным, стабилизированный, микротрубочки решение будет далее именоваться МТ100. Он может использоваться для до 5 дней, и он может быть разбавлен до получения желаемого микротрубочек плотности для каждого эксперимента.
  4. Подвижности раствора
    1. Ферментативный antifade, АТФ, восстанавливающий системы и ATP
      1. Добавьте 9.0 мкл раствора aliquoted казеина в 291 мкл буфера BRB80.
      2. Если желаемой концентрации ATP для эксперимента меньше чем 1 мм, накапайте 83 мкл раствора BRB80/казеина в новые пробки microcentrifuge 0,6 мл. В противном случае, накапайте 85 мкл этого решения в новые пробки microcentrifuge 0,6 мл.
      3. Добавьте 1 мкл D-глюкоза, 1 мкл глюкозооксидаза, 1 мкл каталазы и 1 мкл DTT в этой трубки.
        Примечание: Эти химические вещества представляют ферментные antifade коктейль21 , что сократит Фотообесцвечивание, удаления растворенного кислорода и закалки химически активных радикалов. Это уменьшает Фотообесцвечивание и микротрубочек дезинтеграции, вызванные возбуждением освещения во время визуализации22,23флуоресценции.
      4. Для экспериментов, в которых концентрации ATP выбирается значительно ниже, чем 1 мм, добавьте следующие реагентов в решение для создания системы регенерации АТФ: 1 мкл раствора aliquoted Креатин Фосфат и 1 мкл aliquoted креатин применение раствора.
      5. Добавьте 1 мкл раствора запасов АТФ в подвижности раствора. Флик или вихревого Алиготе содержанием однородно распространять химических веществ.
        Примечание: Таким образом, конечная концентрация химических веществ в растворе, 10 мкм паклитаксел, 0.5 mg·mL−1 казеина, 20 мм D-глюкоза, 200 μg·mL−1 глюкозооксидаза, 8 μg·mL−1 каталазы, Дитиотреитол 10 мм, 2 мм креатин фосфат (если добавлены), 2 Units· L−1 креатин КК (если добавлены) и 1 мм СПС. Это решение будет далее именоваться подвижности раствора.
    2. Кинезин
      Примечание: Фондовый кинезин решение, используемое в этих экспериментах подготовленный G. Bachand в центре комплексных нанотехнологий в национальной лаборатории Сандия и предоставлены в соответствии с соглашением пользователя (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). буфер, используемый здесь состоит из 40 мм имидазола, 300 мм NaCl, 0,76 g· L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 ЭДТА, 50 g· L-1 сахарозы, 0,2 мм TCEP и 50 мкм мг-СПС. Для этой серии экспериментов была использована конструкция кинезин rkin430eGFP. Это кинезин, состоящий из первых 430 аминокислот крыса тяжелые цепи кинезин сливается с eGFP и C-терминала его тег на хвост домена24. Она была выражена в Escherichia coli и очищается с помощью столбца Ni−NTA. Концентрация раствора GFP-кинезин запасов был 1.8 ± 0,3 мкм определяется спектрофотометрия УФ-вид, используя коэффициент вымирания для GFP 55 мм-1·cm-1 489 Нм25, и принимая во внимание что кинезин димер.
      1. Определите нужный кинезин концентрации или поверхности плотность для эксперимента. Для типичных анализов, эта концентрация составляет 20 Нм. Если концентрация кинезин необходимо разбавлять более чем перспективнее, развести его в растворе BRB80, который содержит mg·mL 0,5-1 казеина.
      2. Добавить 1 мкл раствора кинезин моторики решение для того чтобы получить окончательный концентрации приблизительно 20 Нм.
    3. Микротрубочки
      1. Добавьте 10 мкл MT100 раствор, приготовленный в разделе 1.3 подвижности раствора.
        Примечание: Это решение подвижности может использоваться до 3 часов. После этого времени antifade система теряет свою эффективность, поскольку глюкозы в решении истощении ферментативной реакции.

2. сборка потока клетки

  1. Мойка coverslips
    1. Для потока ячеек, используйте большие coverslip (размер: 60 x 25 мм) и один маленький (размеры: 22 x 22 мм)19.
    2. Промойте все coverslips дважды с этанолом и дважды ультрачистая вода. Sonicate coverslips в ультрачистая вода для 5 минут высушить их в духовке при температуре 50 – 75 ° C.
    3. Пылесос с помощью УФ/озона (см. Таблицу материалы и инструкции производителя), лечить одну сторону каждого coverslip на 15 мин выполнить этот шаг может при комнатной температуре (~ 25 ° C) и в обычных атмосферных условиях (давления 1 атм).
    4. Осторожно поверните каждый coverslip его другую сторону (с помощью пинцета) и УФ/озон относиться к этой стороне.
    5. Sonicate coverslips в ультрачистая вода снова за 5 мин до сушки их снова в духовке при температуре 50 – 75 ° C.
  2. Лечение coverslips для включения PEG-PPG-PEG покрытие
    Примечание: Диметилдихлорсилана и толуол, используемые в этой части протокола, будучи весьма токсичны, выполните следующие действия под вытяжного шкафа, принимая следующие меры предосторожности: носить два набора защитные перчатки и рубашку с длинными рукавами под их лаборатории шерсть. Прижмите края перчатки внутри рукава рубашки, таким образом, чтобы не кожи от предплечья непосредственно подвергаются воздействию химических веществ в случае разлива. Носите защитные очки.
    1. Разбавьте 25 мл чистого диметилдихлорсилана 475 мл толуола. Погрузите каждый coverslip в растворе диметилдихлорсилана и толуол на 15 секунд.
    2. Мыть coverslips дважды в толуоле и три раза в метаноле. Сухой coverslips с использованием под давлением азота.
  3. Сборка coverslips в клетки потока
    1. После того, как сухой coverslips, нарежьте 2 см x 2,5 см кусок двухсторонний скотч вертикально полосы две 1 x 2,5 см.
    2. Положите большой coverslip на деликатную задачу стеклоочистителя и придерживаться ленты полосы вдоль по краям coverslip для создания области 1 см x 2,5 см между кусочки ленты.
    3. Палка небольшой coverslip поверх ленты полосы для завершения потока cell Ассамблеи.

3. течь решения в ячейку потока

  1. Потока приблизительно 20 мкл раствора ПЭГ-PPG-КОЛЫШЕК в собранном виде потока клетку. Тома, который летал в клетке должна быть достаточно большой, чтобы заполнить камеры. В следующих шагах используйте тот же объем при обмене решения.
  2. Разрешить для PEG-PPG-PEG решение осваивать на поверхности на 5 минут. Обмен PEG-PPG-PEG решение с буфером BRB80 3 раза течет буфера в. Поток подвижности раствора в ячейку потока.
  3. Уплотнение края ячейки потока смазкой для предотвращения испарения, если запланированные эксперимент больше, чем за час.
    Примечание: Поток ячейка теперь готова к записи образа.

4. imaging ячейку потока

  1. Выполнение визуализации с помощью установки флуоресцирования (TIRF) цель тип полного внутреннего отражения для микротрубочек и кинезин двигатели (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Здесь, мы использовали микроскопа с 100 x / 1,49 числовая апертура объектива, с помощью двух лазеров, один с длиной волны 642 Нм и максимальной мощностью 140 МВт, а другой с волны 488 нм и максимальной мощностью 150 МВт.
  2. Поместите каплю масла погружения на цель.
  3. Место ячейку потока на платформе микроскоп и довести цели до контакта между нефти на цели и поток клеток.
  4. Используйте Микроскоп Блокировка крышки системы для блокирования всех лазерный свет от побега.
  5. Включите лазер и сосредоточиться на нижней поверхности клетки потока. Микротрубочки дневно замаркированы и возбужденных на длине волны 647 Нм. Они будут отражаться с использованием 642 Нм лазер, а 488 нм лазер используется для GFP-кинезин двигатели.
  6. Запись изображений или видео интерес. Как правило, мощность лазера составляет около 30 МВт и время воздействия 50 мс для обоих лазерные каналы. Изображения могут быть записаны для до тех пор, как есть подвижности в ячейке потока.
    Примечание: Лазерной подсветки вредно для невооруженным глазом и может нанести непоправимый ущерб. Пожалуйста, убедитесь, что освещенная область полностью покрыта непрозрачной крышкой.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этих экспериментах, мы использовали 1000 раз разрежения микротрубочек, подготовленный в разделе 1.3.2. Кинезин концентрация составила 20 Нм и концентрация СПС был 1 мм. Визуализация была выполнена с помощью микроскопии TIRF. Скольжения микротрубочек были отражаться отдельно от кинезин motors: микротрубочек были видны после возбуждения с 647 Нм лазер (рис. 1, красный), и GFP-кинезин был виден, когда возбужденные с 488 нм лазер (рис. 1, зеленый). Время между возбуждения с красный и зеленый свет было меньше, чем 1 s. Время между кадрами было 10 s. микротрубочек отображается стабильной планеризма. Средняя микротрубочек, скользя скорость была около 800 нм/с. Поверхностная плотность микротрубочек было 400 мм-2. Треки кинезин (зеленый), как представляется, выходят за рамки задний конец микротрубочек (красный) для нескольких микрометров.

figure-results-1
Рисунок 1: скольжения микротрубочек propelled слабо поверхности прыгните кинезин Моторс. Как микротрубочек двигаться вперед, они накапливаются кинезин двигатели от решения. Эти двигатели чередуются между двумя государствами: Одноместный граница микротрубочек и двойной привязкой микротрубочек и поверхности. При двойной привязанного двигатель достигает конца микротрубочек, двигатель остался позади и медленно desorbs от поверхности с выкл скоростью приблизительно 0,1 s-1. В результате тропы кинезин двигателей остаются позади микротрубочек. Верхний ряд: красный (микротрубочек) канал. Средний ряд: зеленый (кинезин) канала. Нижняя строка: комбинированный красный (микротрубочек) и зеленый (GFP-кинезин) канал. Линейки: 20 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе мы представляем систему активного наноразмерных, который самостоятельно собирает слабо привязки строительных блоков, чтобы построить свой собственный трек. Как показано на рисунке 1, скольжения микротрубочек накапливать кинезин двигатели от решения и внести их на поверхности. Кинезин двигатели остаются в результате микротрубочек для короткого периода времени, прежде чем вернуться к решению. Таким образом в этом эксперименте, кинезин техника альтернативной между 3 гласит:

(1) государство привязкой к одной микротрубочек: это когда кинезин сначала связывается с микротрубочек. Он существует в равновесии с государством (2).

(2) государство привязкой к двойной: в этом случае кинезин сингл прыгните микротрубочек также связывается с поверхности через его его тег. Это состояние двойной привязкой позволяет для движения микротрубочек.

(3) одно государство привязкой к поверхности: двойной привязкой кинезин, который шел от конца микротрубочек и не имеет пока десорбированного из поверхности находится в этом состоянии. Эти двигатели могут наблюдаться в Рисунок 1 (комбинированных и зеленый каналы): они расширить за хвост микротрубочек для нескольких микрометров и формируют его уменьшение тропа.

Наиболее важным этапом этого протокола является формирование гидрофобной поверхности на слайде. Не только это использовать опасных химических веществ, но он также позволяет PEG-PPG-PEG функционализированных с группой НТА для покрытия поверхности, которая затем позволяет кинезин обратимо связываться с поверхности. Еще один важный шаг герметизация ячейку потока с жиром. Это позволяет длительное изображений без жидкости в поток клеток испарения.

Основная изменения к этой технике состоят из изменения концентрации микротрубочек, кинезин концентрации и концентрацию АТФ. Изменение концентрации микротрубочек изменит количество микротрубочек, скользя по поверхности. Изменение концентрации кинезин изменит количество кинезин молекул, которые можно привязать к микротрубочек. Однако увеличение концентрации кинезин выше сумм, уже определены в этом эксперименте может увеличить флуоресценции фон, что делает его более трудным увидеть кинезин тропы, оставили позади скольжения микротрубочек. Тем временем снижение концентрации ATP ниже 10 мкм значительно снизить скорость скольжения микротрубочек. Если этот эффект, необходимо использовать СПС регенерирующаяся система, состоящая из креатин фосфатазы и применение.

Возможным ограничением этой методики является, что из-за содержания большого активного кинезин системы, СПС может быть быстро потребляется, и экспериментов может длиться меньше, чем за час в определенных условиях. Например, это будет случай если используется двойная высокую концентрацию Кинезин и пять раз выше концентрации микротрубочек чем то, что представлено в настоящем Протоколе.

В нашей предыдущей работы18, мы изучили пространственное распределение кинезин двигатели вдоль микротрубочек, доказав, что скольжения микротрубочек накапливать кинезин двигатели от решения, приводит к увеличению плотности двигателей по длине микротрубочки. Мы также обнаружили, что стабильность скольжения микротрубочек продемонстрировал нелинейная зависимость скорости концентрации и микротрубочек кинезин решения.

Представленные протокол прокладывает путь для более эффективного использования моторов белков в наноразмерных инженерных систем и для дальнейшего расследования в разработке активных наносистем, которые находятся в динамическом равновесии. Кроме того динамичный характер этой системы позволяет ему служить в качестве модели системы для изучения самовосстановления и динамической замены молекулярных компонентов, закрывая часть разрыва между инженерных и естественных структур.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы с благодарностью признаем финансовой поддержки в рамках гранта NSF NSF-DMR 1807514. Авторы благодарят за предоставление белка GFP-кинезин G. Bachand и V. Vandelinder. Эта работа была выполнена, в частности, в центре комплексных нанотехнологий, механизма управления науки пользователей работали для нас Департамент энергетики (DOE) управление науки, Лос-Аламосской национальной лаборатории (контракт нет. DE-AC52-06NA25396) и национальной лаборатории Сандия (кон тракта № 97 де-AC04-94AL85000). Авторы благодарят д-р Дженнифер Neff и сосудистых AllVivo за их дар PEG-PPG-PEG функционализированных с ЗТК.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Лазер 488 нмOmicron LaserageLuxX 488-150
642 нм лазерOmicron LaserageLuxX  642
КазеинSigmaC7078-500G
Каталаза из печени крупного рогатого скотаSigmaC40-500MG
КреатинфосфатSigmaP-7936
КреатинфосфокиназаSigmaC3755-500UN
D-глюкозаSigmaG2133-50KU
Раствор дихлордиметилсилана Sigma40140-25MLТоксичный
диметилсульфоксидSigma34869-100ML
ДитиотреитолSigmaD0632-5GToxic
Eclipse TINikon Instruments
eGFP rkin430Предоставлено Джорджем Бахандом
EGTASigmaE4378-25G
Falcon 50 мл Конические центрифужные пробиркиFisher Scientific14-959-49A
ГлюкозооксидазаSigmaG0543-10KU
ГуанозинтрифосфатSigmaG8877-10MG
Kimwipes Delicate Task WipersSigmaPharmaceuticals 8089
Хлорид магнияSigmaM1028-100ML
МетанолFisher ChemicalA412токсичный
Система очистки воды Milli-QMillipore Corporation
Сульфат никеляSigma656895-50G
ПаклитакселSigmaT1912-5MG
PIPESSigmaP-6757
Pluronic F108-NTAПредоставлено Дженнифер Нефф и AllVivo VascularPEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic; F-108Sigma542342-250GPEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Защелкивающаяся крышка Микроцентрифужные пробирки с низким удержаниемFisher Scientific21-403-190
ТолуолFisher ChemicalT324Токсичный
тубулин, HiLyte647-меченыйCytoskeleton, Inc.TL670M
УФ-озоновый проочистительBioForce NanosciencesPC440
Whatman  Puradisc шприцевые фильтрыSigmaWHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS CameraAndor TechnologysCMOS 4.2

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
  2. Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
  3. Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
  4. Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603(2010).
  5. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
  6. Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
  7. Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
  8. Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
  9. England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919(2015).
  10. Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
  11. Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
  12. Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
  13. Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
  14. Ghosh, S. K. Self-Healing Materials. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).
  15. Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
  16. Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
  17. Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
  18. Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
  19. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
  20. Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. Proteins in Food Processing (Second Edition). Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).
  21. Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
  22. Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
  23. Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
  24. Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
  25. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFP

Похожие статьи