Method Article

Метод микроэлектрода Impalement для записи Мембраны Потенциал из канналедированной средней мозговой артерии

DOI:

10.3791/59072

⸱

July 2nd, 2019

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Mississippi Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основная цель этой статьи заключается в предоставлении подробной информации о том, как записывать мембранный потенциал (Vм) из средней мозговой артерии с помощью метода микроэлектрода impalement. Каннулированная средняя мозговая артерия уравновешивают, чтобы получить миогенный тон, и стенка сосуда пронзили с помощью микроэлектродов высокого сопротивления.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мембранныйпотенциал (V м) сосудистых гладких мышечных клеток определяет тонус сосудов и, таким образом, приток крови к органу. Изменения в экспрессии и функции ионных каналов и электрогенных насосов, которые регулируют Vм в условиях заболевания потенциально может изменить Vм,сосудистый тон, и кровоток. Таким образом, необходимо базовое понимание электрофизиологии и методов, необходимых для точной записи Vм в здоровых и больных состояниях. Этот метод позволит модулировать Vm с помощью различных фармакологических агентов для восстановления Vм. Хотя Есть несколько методов, каждый со своими преимуществами и недостатками, эта статья предоставляет протоколы для записи Vм из каннуляющих сосудов сопротивления, таких как средняя мозговая артерия с помощью метода микроэлектродов impalement. Средние мозговые артерии могут получить миогенный тон в миографической камере, а стенка сосуда пронзили с помощью микроэлектродов высокого сопротивления. Сигнал Vm собирается с помощью электрометра, оцифровывается и анализируется. Этот метод обеспечивает точное считывание Vм стенки сосуда, не повреждая клетки и не изменяя мембранное сопротивление.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мембранный потенциал (Vм) клетки относится к относительной разнице ионного заряда по плазменной мембране и относительной проницаемости мембраны к этим ионам. Vm генерируется дифференциальным распределением ионов и поддерживается ионными каналами и насосами. Ионные каналы, такие как Kq, Na,и Clй внести существенный вклад в отдых Vм. Сосудистые гладкие мышечные клетки (VSMCs) выражают более четырех различных типов Каналов Kи 1, два типа напряжения-gated Ca2 "каналов (VGCC)2, более двух типов Cl- каналы3, 4 , 5, магазин-управляемые каналы Ca2 '6, растяжечныеканалы катионов7,8,и электрогенные насосы натрия-калия ATPase9 в их плазменных мембранах, все из которых могут быть участвует в регулировании Vм.

Vм VSMCs зависит от давления промена. В ненагерметиковых судах Vm варьируется от -50 до -65 мВ, однако в герметике артериальных сегментов В м колеблется от -37 до -47 мВ10. Повышение внутрисосудистого давления приводит к деполяризации ВСМК11,снижает порог открытия VGCC, и увеличивает приток кальция, способствующий развитию миногенного тона12. Напротив, в пассивных или ненагерметизированных сосудах мембранная гиперполяризация, из-за высокой активности канала K, предотвратит открытие VGCC, что приведет к ограниченному входу кальция и уменьшению внутриклеточного кальция, способствуя меньшему сосудистый тон13. Таким образом, Vm из-за изменений давления промена, как представляется, играют важную роль в развитии тонусов сосудов, и как VGCC и Kq каналы играют решающую роль в регулировании Vм.

Vm варьируется между типом судна и видом. Vм -54 - 1,3 мВ у морских свинок superior мезентериальных артериальных полос14, -45 и 1 мВ в крысиных средних мозговых артериях при давлении просвета60 мм рт. ст.12,и -35 - 1 мВ в крысиных паранхмальных артериях при давлении 40 мм рт. ст. Отдых Vм записано в нерастянутой крысиной лимфатической мышце -48 и 2 мВ16. Vм церебральных VSMCs является более негативным, чем в периферических артериях. Для сравнения, кошачьих средних мозговых артерий, как сообщается, Vм около -70 мВ, в то время как мезентерические и коронарные артерии, как сообщается, -49 и -58 мВ, соответственно17,18. Различия в Vм через сосудистые кровати могут отражать различия в экспрессии и функции ионных каналов и электрогенных натриево-калийных насосов.

Увеличение и уменьшение ВМ называют мембранной деполяризацией и гиперполярализацией, соответственно. Эти изменения в Vм играют центральную роль во многих физиологических процессах, включая ион-канал gating, сигнализация клеток, сокращение мышц, и действия потенциального распространения. При фиксированном давлении, многие эндогенные и синтетические сосудорасширяющие соединения, которые активируют каналы Kи вызывают мембранную гиперполяризацию, в результате чего вазодилатация1,13. И наоборот, устойчивая деполяризация мембран имеет жизненно важное значение в агонист-индуцированной или рецепторо-опосредованного сосудосуживание19. Vm является критической переменной, которая не только регулирует приток Ca2 "через VGCC13, но и влияет на выпуск Ca2" из внутренних магазинов20,21 и Ca 2"чувствительность контрактный аппарат22.

Хотя существует несколько методов записи Vм из различных типов клеток, данные, собранные из метода микроэлектрода прокола канналесора, как представляется, более физиологические, чем данные, полученные из изолированных VSMCs. При записи из изолированных VSMC с использованием текущих методов зажима, Vm рассматривается как спонтанные переходные гиперполяризации в VSMCs24. Изолированные VSMCs не находятся в синцитии, и изменения в устойчивости серии могут способствовать колебационному поведению Vm. С другой стороны, колебальное поведение не наблюдается, когда Vm записывается из нетронутых сосудов, вероятно, из-за контакта клеток между VSMCs, которые находятся в синцитии в артерии и суммируются по всему сосуду, ведущей к стабильной Vм 24. Таким образом, измерение Vм из под давлением сосудов с использованием стандартной методики микроэлектрода impalement относительно близко к физиологическим условиям.

Запись Vм из каннаулированных сосудов может обеспечить жизненно важную информацию, так как Vм VSMCs, которые находятся в синхронизации является одним из основных детерминантов сосудистого тона и кровотока, и модуляция Vм может обеспечить способ для разбавлять или сужают кровеносные сосуды. Таким образом, важно понимать методологию, связанную с записью Vm. В этой статье описывается внутриклеточная запись Vм из каннулялизных средних мозговых артерий (MCAs) с помощью метода микроэлектрода impalement. Этот протокол будет описывать, как подготовить MCAs, микроэлектроды, настроить электрометр и выполнить метод impalement для записи Vм. Также обсуждаются репрезентативные данные, общие проблемы, возникшие при использовании этого метода, и потенциальные проблемы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Самцы крыс были размещены в центре по уходу за животными в УГМК, который одобрен Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AAALAC). На протяжении всего исследования животные имели свободный доступ к пище и воде. Звери содержались в контролируемой среде с температурой 24 х 2 градусов по Цельсию, уровень влажности 60-80% и 12 ч светлых/темных циклов. Все протоколы были утверждены Комитетом по уходу за животными и использованию УГМК.

1. Подготовка оборудования

  1. Поместите двойной дифференциальный электрометр(см. ТаблицуМатериалов) близко к камере судна и в нужном месте.
  2. Подключите выход канала усилителя A или B к вхотворцу канала дигитайзера с помощью кабеля BNC-BNC.
  3. Установите зонд в микроманипулятор и поместите его рядом с микроскопом и миографом. Установка записи должна быть установлена на безвибрационном столе.
  4. Поместите ручки и переключатели на передней панели усилителя в положениях, которые настраиваются на этот эксперимент, как описано в руководстве.
  5. Соедините основу ванны с контурной площадкой усилителя с помощью соответствующего электрода. Аналогичным образом, убедитесь, что клетка приземляется на шасси усилителя.

2. Подготовка микроэлектродов и сборки

  1. Используйте боросиликатные стеклянные микроэлектроды (см. таблицу материалов) и потяните стеклянный наконечник, чтобы иметь конус диаметром 8-10 мм, диаметром 1 мкм и сопротивлением 80-120 МЗ при заполнении 3 М ККЛ.
    1. Используйте стандартный шкив для достижения короткого постепенного конуса, используя следующие настройки: тепло 650; скорость - 20; тянуть No 25; время 250 и петля дважды для более высоких сопротивлений и меньших кончиков. Посмотреть таблицу материалов, как настройки инструмент-специфических.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр наконечника злт;1 мкм нанесет минимальный ущерб клетке при проколе.
  2. Заполните микроэлектрод 3 M KCl с помощью шприца микроволокна (см. таблицу материалов).
    1. Медленно потяните поршень из шприца микроволокна вверх во время введения 3 M KCl в микроэлектрод, чтобы пространство для жидкости для заполнения и предотвратить образование пузырьков воздуха внутри микроэлектрода.
    2. Заполните микроэлектрод до полного и убедитесь, что Есть нет пузырьков воздуха, прежде чем поместить его в держатель микроэлектрода. Если пузырьки присутствуют, осторожно коснитесь микроэлектродой пальцем, чтобы удалить пузыри.
  3. Осуществляя уход, твердо нажмите электрод хвостовик в держатель через скучно отверстие. Если избыток жидкости присутствует, удалить его с тканью.
  4. Подключите сборку держателя электрода к зонду усилителя. Проведите тест на электрод, отрегулируйте смещение ввода, проверьте нулевую настройку и проверьте утечку ввода зонда в соответствии с руководством по усилителею.
  5. Измерьте сопротивление электродов с помощью теста на электрод, как показано в таблице1.
  6. Обратите внимание, что работающий электрод отображает положительный сдвиг напряжения ПОСТОЯННОГО ТОКа в 1 мВ/МЗ на выходе канала. С другой стороны, если большое напряжение появляется на выходе канала и на счетчике, это указывает на заблокированный или сломанный электрод.
  7. Откройте программное обеспечение для записи, присвоите имя файлу и сохраните его для дальнейшего анализа в программном обеспечении для хранения.

3. Изоляция и кануляция средней мозговой артерии

  1. Подготовка реагентов.
    1. Подготовка нормального и низкого кальция физиологического солевого раствора (PSS), как описано в таблице 2.
  2. Приготовьте миограф.
    1. Промыть миографную камеру (см. таблицуматериалов) с дистиллированной водой несколько раз, чтобы держать его свободным от мусора. Загрузите камеру с 5 мл нормального PSS.
    2. Заполните обе стеклянные канюли с отфильтрованным нормальным PSS с помощью шприца 5-10 мл. Тщательно заполните всю канюли и прикрепленные трубки без введения каких-либо пузырьков воздуха.
    3. Приготовьте два монофилоновых нейлоновых шва (10-0, 0,02 мм) с половиной узла каждый с помощью тупых щипц.
    4. Поместите частично закрытые узлы шва на обе канюлях немного от кончика, используя рассечение щипцы под микроскопом вскрытия. Позже эти узлы будут соскользнул и связаны тщательно на каниulated артериальных концов для обеспечения судна.
  3. Изолировать и канитулировать среднюю мозговую артерию.
    1. Индуцировать глубокую анестезию в Sprague Dawley крысы с помощью 2-4% вдыхаемых изофлуран.
    2. Обезглавить крысу с помощью гильотины под глубокой анестезией.
    3. Тщательно удалите череп с помощью костного резака и ножницами.
    4. Удалить мозг из черепа и поместить его в 5 мл низкого кальция PSS на льду.
    5. Определите и вскрывайте неразветвленный сегмент крысиной средней мозговой артерии (MCA) с внутренним диаметром 100-200 мкм от мозга с помощью пружинных ножниц и щипков.
    6. Установите MCA на стеклянные канюли с помощью тонких щипц и закрепите, затягивая швы в миографе, содержащем нормальный PSS.
    7. Закройте дистальной канюли, чтобы не было потока в РАМКАХ MCA.
    8. Подключите водоемную трубу к резервуару, удерживающего PSS, чтобы обеспечить контроль внутрилюмиального давления, которое будет контролироваться с помощью трансдуктора давления в линии.
    9. Визуализируйте cannulated MCA с помощью зарядной камеры устройства (см. Таблицаматериалов), установленной на перевернутом микроскопе и программном обеспечении для визуализации.
    10. Установите осевую длину MCA до приблизительной длины, где она должна появиться ни жесткой, ни вялой.
    11. Уравновесить раствор ванны с O2 (95%) и CO2 (5%) при температуре 37 градусов По Цельсию для обеспечения адекватной оксигенации, температуры и поддержания рН на уровне 7,4.
  4. Impale (проникает в клеточную плазменную мембрану) сосудистые гладкие мышечные клетки.
    1. Соедините молотый электрод и держите его погруженным в PSS миографа.
    2. Осветите камеру сосуда и посмотрите через микроскоп, чтобы визуализировать кончик микроэлектрода в растворе ванны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, можно визуализировать MCA и микроэлектрод на компьютере, имеющего программное обеспечение для визуализации.
    3. Используйте элементы управления микроманипулятора для перемещения кончика микроэлектрода близко к внешней стенке кровеносных сосудов. Микроманипулятор и кончик микроэлектрода должны находиться в стабильном положении по отношению к ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом экспериментов подтвердите, что напряжение мембраны стабилизировалось. Если измеренное напряжение нестабильно, связь между электродом и клеткой не запечатана, что указывает на утечку.
    4. Начните запись.
    5. Медленно двигайте кончик микроэлектрода к сосуду, нацеливаясь в центр сосуда, используя курс или тонкий контроль микроманипулятора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда, небольшое отклонение в записи может наблюдаться, когда микроэлектрод кончик контактов мембраны мышечного волокна.
    6. Когда наконечник приходит в непосредственной близости от сосуда, продвижение электрода вперед в одном быстром движении с помощью микроманипулятора, чтобы пронзить мембрану мышцы.
    7. На этом этапе можно начать наблюдать за изменениями в V m, записываемыми. Не прикасайтесь к микроманипулятору, когда микроэлектрод пронзает мембрану клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разница в напряжении между записью и эталонным электродом уменьшается от 0 мВ до -40 мВ до -75 мВ в зависимости от уровня внутрисосудистого давления или других возбуждающих или ингибирующих стимулов. Эти показания характеризуют трансмембранную потенциальную разницу текущей клетки.
    8. Выполните несколько проколов на одном судне в различных областях судна, не повреждая ВСМК, чтобы получить точные измерения.
    9. После записи используйте манипулятор для удаления микроэлектрода в одном быстром движении.
    10. Остановите запись и сохраните файлы данных для дальнейшего анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный метод можно надежно использовать для записи Vм в каниulated сосудах. Краткая процедура, описывающая, как изолировать MCA от мозга представлена на рисунке 1A. После отделения мозга от черепа, MCA был расчленен и помещен в чашку Петри, содержащую низкий уровень содержания кальция PSS. Часть соединительной ткани, которая была прикреплена была также расчленена вместе с MCA с помощью пружинных ножниц и щипцы, чтобы предотвратить поврежден...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья предоставляет необходимые шаги о том, как использовать острый метод микроэлектрода impalement для записи Vм от консервированной подготовки судна. Этот метод широко используется и предлагает высококачественные, последовательные записи Vm, которые отвечают на широкий спектр экспериментальных вопросов.

Некоторые критические соображения и шаги по устранению неполадок описаны здесь, чтобы обеспечить успех метода. Качество микроэлектрода (его резкость и устойчивость)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана грантами от программы интрамуральной поддержки (IRSP) от УГМК, Грантом развития ученых AHA (13SDG14000006), присужденными Малликарджуне Р. Паббиди.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dissection Instruments
Диссекционный микроскопNikon Instruments Inc., NYEclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575Harvard Apparatus, MA73-198
Littauer Bone CutterFine science tools16152-15
Moria MC40 Ультратонкие щипцыИнструменты для тонкой науки11370-40
Хирургические ножницы Острый-тупойИнструменты для тонкой науки14008-14
ШовГарвардский аппарат72-3287
Пружинные ножницы VannasИнструменты для тонкой науки15018-10
Инструменты для электрофизиологии
Устройство с зарядовой связью камерыQimaging, , BCRetiga 2000R
Дифференциальный электрометр усилительWPIFD223A
Встроенный преобразователь давленияHarvard Apparatus, MAMA1 72-4496
МикроманипуляторThor labsPCS-5400
МикроэлектродыWarner Instruments LLC, CTG200-6,
Micro Fil (шприц из микрофибры)WPIMF28G67-5
Держатель микроэлектродовWPIMEH1SF
Миограф для живых систем Контрольно-измерительные приборы, VTCH-1-SH
PullerSutter Instrument, Сан-Рафаэль, КалифорнияP-97
Стол без вибрацииTMC3435-14
< strong>Softwares
Clampex 10Молекулярные устройства
p Clamp 10Молекулярные устройства
Программное обеспечение для визуализацииNikon, NYNIS-элементы
Chemicals
NaClSigmaS7653
KClSigmaP4504
MgSO4SigmaM7506
CaCl2 SigmaC3881
HEPESSigmaH7006
GlucoseSigmaG7021
2PO4SigmaS0751
NaHCO3SigmaS5761
Aneshetic Vaporiser Parkland Научный V3000PK

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
  2. Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
  3. Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
  4. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  5. Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
  6. Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
  7. Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
  8. Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
  9. Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
  10. Coca, A., Garay, R. Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , Taylor & Francis. (1993).
  11. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
  12. Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
  13. Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
  14. Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
  15. Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
  16. Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
  17. Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
  18. Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
  19. Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
  20. Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
  21. Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
  22. Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
  23. Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
  24. Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Membrane PotentialMicroelectrode ImpalementMiddle Cerebral ArteryVascular Smooth MuscleElectrophysiology RecordingMyograph ChamberBorosilicate MicroelectrodesPotassium Chloride FillingElectrometer AmplifierCannulated Vessel Preparation

Related Articles