Методическая статья

Геном редактирование в Mammalian клеток линии, используя ТРИФОСФАТЫ-Cas

21.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59086

⸱

11 апреля 2019 г.

 ,  ,  , 
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

В этой статье

Краткое содержание

ТРИФОСФАТЫ-Cas — это мощная технология инженер комплекс геномов растений и животных. Здесь мы подробно протокол эффективно редактировать генома человека с использованием различных эндонуклеазами Cas. Мы отмечаем важные соображения и расчетные параметры для оптимизации эффективности редактирования.

Аннотация

Кластерный системы регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) функции естественно в бактериальных адаптивного иммунитета, но успешно многократно использовать для генома инженерии в многих различных живых организмов. Чаще всего Cas12a эндонуклеазы используется прилепится определенных сайтов в геноме, после чего перерыв двуцепочечной ДНК будет восстановлена через не гомологичных конце присоединения (NHEJ) путь или ориентированные на гомологии ремонт (или wildtype ТРИФОСФАТЫ связанные 9 (Cas9) HDR) путь в зависимости от того, является ли шаблон доноров отсутствует или представить соответственно. На сегодняшний день, ТРИФОСФАТЫ систем от различных видов бактерий было показано, чтобы быть способными выполнять изменения генома в mammalian клетках. Однако несмотря на кажущуюся простоту технологии, несколько конструктивных параметров должны рассматриваться, которые часто оставляют пользователи недоумевали о том, как лучше всего выполнять их геном редактирования экспериментов. Здесь мы описываем полный рабочий процесс из экспериментального дизайна для идентификации ячейки клонов, которые несут желаемые изменения ДНК, с целью облегчения успешного выполнения редактирования эксперименты в mammalian клетки линии генома. Мы подчеркиваем основные соображения для пользователей, чтобы принять к сведению, включая выбор системы ТРИФОСФАТЫ, длина распорку и дизайн шаблона доноров одноцепочечной oligodeoxynucleotide (ssODN). Мы предполагаем, что этот процесс будет полезен для гена нокаут исследований, моделирования усилия, болезни или поколения репортер мобильных линий.

Введение

Способность инженер геном любого живого организма имеет много биомедицинских и биотехнологических приложений, например коррекции болезнетворные мутации, строительство точных моделей для исследования заболеваний, или поколения сельскохозяйственных культур с желательные черты. С начала века, различные технологии были разработаны для техники генома клеток млекопитающих, включая meganucleases1,2,3, цинковый палец nucleases4,5, или Транскрипция эффекторных активатор как nucleases (Таленс)6,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. дизайн sgRNAs

  1. Выберите соответствующую систему ТРИФОСФАТЫ-Cas.
    1. Во-первых проверьте целевого региона для PAM последовательности всех Cas9 и Cas12a nucleases, которые показали, чтобы быть функциональным в mammalian клетках16,21-32. Пять часто используемые ферменты приведены в таблице 1 вместе с их соответствующими пам.
      Примечание: Помимо эндонуклеазами, перечисленных в таблице 1, существуют другие менее часто используемые Cas ферменты, которые были успешно развернуты в mammalian клетках также, как Cas9 Нуклеаза от Streptococcus thermophilus (St1Cas9), признает PAM NNAGAAW. Если нужного целевог....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для выполнения генома редактирования эксперимент, ТРИФОСФАТЫ плазмида, выражая sgRNA ориентации, локус интерес должен быть клонированы. Во-первых плазмида переваривается с энзима ограничения (обычно типа IIs фермент) для линеаризации его. Рекомендуется для устранения переваривается продукт на геле агарозы 1% наряду с непереваренных плазмида проводить различие между полной и частичной пищеварение. Как supercoiled непереваренных плазмид, они, как правило, работают быстрее, чем их линеаризованного (см. .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Система ТРИФОСФАТЫ-Cas является мощным, революционная технология для инженер геномов и transcriptomes растений и животных. Содержат ТРИФОСФАТЫ-Cas систем, которые потенциально могут быть адаптированы для генома и транскриптом инженерных целей44были найдены многочисленные виды бактерий. Хотя Cas9 эндонуклеазы от Streptococcus pyogenes (SpCas9) был первый фермент для развертывания успешно в клетки человека21,,22

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

M.H.T. поддерживается агентства грант для Объединенного бюро Совета науки, технологий и научных исследований (1431AFG103), Национальный совет медицинских исследований Грант (OFIRG/0017/2016), Национальный исследовательский фонд предоставляет (NRF2013-THE001-046 и NRF2013-THE001-093), Министерство образования Tier 1 Грант (RG50/17 (S)), запуска грант от Nanyang технологический университет и фондов для генетически Инженерная машина (МПСЭ) международного конкурса от Nanyang технологический университет.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
T4 Полинуклеотидкиназа (PNK)NEBM0201
Щелочная фосфатаза креветок (rSAP)NEBM0371
Трис-ацетат-ЭДТА (TAE) Буфер, 50X1-е основаниеBUF-3000-50X4Lразбавить до 1X перед использованием. Раствор 1X содержит 40 мМ Трис, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА.
Буфер Tris-EDTA (TE), 10X1st baseBUF-3020-10X4Lразбавить до 1X перед использованием. Раствор 1X содержит 10 мМ Трис (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА.
BbsINEBR0539
BsmBINEBR0580
T4 ДНК-лигазаNEBM0202400 000 единиц/мл
Набор для быстрого лигированияNEBM2200Альтернатива T4 ДНК-лигазе.
Набор для быстрого лигирования ДНКThermo ScientificK1423Альтернатива Т4 ДНК-лигазе.
Набор для клонирования Zero Blunt TOPO PCRThermo Scientific451245Раствор соли поставляется с вектором TOPO в комплекте.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621LKit для сборки Gibson.
Один выстрел Stbl3 Химически компетентный E.ColiThermo ScientificC737303
LB Бульон (Lennox), порошокSigma AldrichL3022Reconstitute в ddH20, и автоклав перед использованием
LB Бульон с агаром (Lennox), порошкомSigma AldrichL2897Reconstitute в ddH20 и автоклавом перед использованием
среды SOC--2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 20 мМ глюкозы в 1 л LB Бульон
Ампициллин (натрий), USP Grade GoldBiotechnologyA-301
REDiant 2X PCR Mastermix1-е основаниеBIO-5185
Агароза1-е основаниеBIO-1000
T7 Эндонуклеаза INEBM0302
Мини-набор для экстракции плазмидной ДНК FavorgenFAPDE 300
модифицированная орлиная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), гиклон с высоким содержанием глюкозыSH30081,014,5 г/л глюкозы, без L-глутамина, HEPES и пируват натрия
L-глютамин, 200mMGibco25030
пенициллин-стрептомицин, 10 000 ед/млGibco15140
0,25% трипсин-ЭДТА, 1XGibco25200
плод крупного рогатого скота СывороткаHycloneSV30160FBS инактивирована термической инактивацией перед применением при температуре 56 oC в течение 30 мин
фосфатно-солевого буфера, 1XGibco20012
jetPRIME трансфекционный реагентPolyplus Transfection114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0EpicentreLUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit BiolineBIO-52067Альтернатива QuickExtract
Q5 Высокоточная ДНК-полимеразаNEBM0491
Смесь растворов дезоксинуклеотидов (dNTP) NEBN0447
6X Краситель для загрузки ДНКThermo ScientificR061110 мМ Tris-HCl (pH 7,6) 0,03% бромофенол синий, 0,03% ксилолацианол FF, 60% глицерин, 60 мМ ЭДТА
Коктейль ингибиторов протеазы, Set3Merck
Нитроцеллюлозная мембрана, 0,2&микро; mBio-Rad1620112
буфер Tris-glycine-SDS, 10XBio-Rad1610772разбавить до 1X перед использованием. Раствор 1x содержит 25 мМ Трис, 192 мМ глицина и 0,1% SDS.
Трис-глициновый буфер, 10X1-е основаниеBUF-2020Разбавить до 1X перед использованием. Раствор 1x содержит 25 мМ Трис и 192 мМ глицина.
Раствор Ponceau SSigma AldrichP7170
TBS, 20X1-е основаниеBUF-3030разбавить до 1X перед использованием. Раствор 1x содержит 25 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и 150 мМ NaCl.
Tween 20Sigma AldrichP9416
Обезжиренное молоко для иммуноферментного анализаNacalai Tesque31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRPAdvanstaK12043
Антитела к β-актину (C4)Santa Cruz Biotechnologysc-47778Номер партии: C0916
MiSeq systemIlluminaSY-410-1003
СпектрофотометрNanoDrop ThermoScientific ND-2000
Кубитный флуориметрThermoScientific Q33226
Система визуализации клеток EVOS FLThermo ScientificAMF4300
CRISPR плазмида: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138Одновекторная система: ГРНК экспрессируется из той же плазмиды.
CRISPR плазмида: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpAAddgene61591Одновекторная система: гРНК экспрессируется из той же плазмиды.
Плазмида CRISPR: xCas9 3.7Addgene108379Dual vector system: гРНК экспрессируется из другой плазмиды.
CRISPR плазмида: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9Addgene42230Одновекторная система: гРНК экспрессируется из одной и той же плазмиды.
CRISPR плазмида: hCas9Addgene41815Двухвекторная система: гРНК экспрессируется из другой плазмиды.
CRISPR плазмида: eSpCas9(1.1)Addgene71814Одновекторная система: гРНК экспрессируется из одной и той же плазмиды.
CRISPR плазмида: VP12 (SpCas9-HF1)Addgene72247Двухвекторная система: гРНК экспрессируется из другой плазмиды.
539134

Ссылки

  1. Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
  2. Arnould, S., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPR Cas9T7

Похожие статьи