Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Альвеолярных макрофагов фагоцитоза и распродажа бактерий в мышей

11.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59088

⸱

2 марта 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physiological Sciences, Eastern Virginia Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы приводим общие методы для анализа фагоцитарную функцию мышиных альвеолярных макрофагов и бактериальных Распродажа из легких. Эти методы исследования в пробирке фагоцитоз флуоресцеин Изотиоцианаты бусы и в естественных условиях фагоцитоз Pseudomonas aeruginosa зеленого флуоресцентного белка. Мы также описывают метод для очистки P. aeruginosa мышей.

Аннотация

Альвеолярных макрофагов (AMs) гвардии пространство альвеолярных легких. Фагоцитоз, AMs играет решающую роль в обороне против вторгаясь патогенов, удаление омертвевших клеток или посторонних частиц и в резолюции воспалительных реакций и тканей ремоделирования, процессов, посредничестве различные поверхности рецепторы AMs. Здесь мы приводим методы для анализа фагоцитарной функции с помощью экспериментальных стратегий и в vitro и in vivo анализов различать шаблон признание рецептор-, рецептор комплемента- и гамма Fc рецептор опосредованный AMs фагоцитоз. Наконец мы рассмотрим метод, чтобы установить и характеризуют P. aeruginosa пневмонии модели мышей для оценки бактериальных Распродажа в естественных условиях. Эти анализы являются наиболее распространенными методами для оценки функции AM и может также использоваться для изучения функции макрофагов и бактериальных Распродажа в других органах.

Введение

АПП являются крупные резидентов фагоцитов в альвеолах в стадии покоя и один из основных игроков врожденные иммунные реакции через признание и интернализации ингаляционных патогенов и инородных частиц1,2. Сообщалось, что AMs имеют важное значение для быстрого разминирования многих легочных патогены, например P. aeruginosa и клебсиеллы пневмонии3,4, так что дефицит в AM фагоцитоза часто приводит к респираторных инфекции, такие как острая пневмония, которые вызывают более высокие показатели смертности и заболеваемости.

АПП также инициировать врожденной воспалительные реакции в легких, производство цитокинов и chemokines например ФНО α, ИЛ 1β, какой уровень помех с другими клетками альвеолярного среды для производства chemokines и набирать воспалительных нейтрофилов, моноцитов, и Адаптивная иммунные клетки в легких5. Например ИЛ 1β, производимые AMs помогает премьер высвобождение нейтрофилов хемокиновых CXCL8 из эпителиальных клеток6. Кроме того АПП способствовать фагоцитоз apoptotic полиморфноядерных лейкоцитов (ПНЛ), отказ которых приводит к постоянной утечки внутриклеточных ферментов из ПНЛ окружающие ткани, что приводит к повреждению тканей и длительное воспаление 7 , 8 , 9.

Фагоцитоз, AMs опосредуется прямого признания патоген связанные молекулярные узоры на поверхности патогена шаблон признание рецепторов (ПРРС) АПП или привязки опсонизированными патогенов с рецепторами иммунной эффекторных АПП 10. для последнего, AMs может признать целей опсонизированными с иммуноглобулина (IgG) через их Fcγ рецепторы (FcγR) или патогенов с фрагментов комплемента, C3b и C3bi, через их дополнения рецепторов покрытием (CR)11. Среди дополнения рецепторов выборочно CR суперсемейства иммуноглобулинов (CRIg) выражается в ткани макрофагами12, и недавнее заключение подчеркнул роль CRIg в AM фагоцитоза в контексте P. aeruginosa пневмонии 13.

Многие оригинальные исследования использовать методы для оценки фагоцитоз макрофага описать молекулярных механизмов макрофагов функция14,15. Однако методы как в естественных условиях фагоцитоза требуют точную количественную оценку фагоцитоза. Здесь, мы суммируем подробная методология для фагоцитоза в vitro и in vivo, используя флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-стеклянные бусы и P. aeruginosa Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), соответственно. Кроме того мы объяснить метод дифференциации среди PRR-, CR- и FcγR опосредованной фагоцитоза. Наконец мы сообщаем метод характеризовать бактериальных Распродажа в мыши отношении P. aeruginosa пневмонии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол следует принципам институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Восточной Вирджинии медицинской школы.

1. флуоресцентные бусинки фагоцитоз

  1. Усыпить мыши (C57BL/6J, 6 недель, женщины) CO2 удушение согласно IACUC протоколы для этического эвтаназии животных.
  2. Положите мыши животе на доске рассечение, покрытые бумажные полотенца. Придавить его лапы с spread-eagle конечностей и подключить строку под его передних зубов тянуть его голову назад, так что трахеи располагается прямо и уровня.
  3. Влажные мыши горло, грудь и живот с 70% этанол лечить и предотвращать мех от прилипания к инструментам.
  4. С помощью регулярных щипцы, подтянуть кожу на осевой линии тела и сократить с Ножницы хирургические до осевой линии в верхней части горла.
  5. Использование тупой конец стандартные хирургические ножницы, тщательно отойти на горло мышц и соединительной ткани и использовать весной ножницы (microscissors) для предоставления трахеи.
  6. Сжимая кольцо хряща с щипцами, тщательно сделать небольшой надрез (~1.5 мм), используя microscissors, на лице желудочка трахеи и Вставьте канюлю 18 G в трахею.
  7. Аккуратно промывание 3 мл фосфат амортизированное saline (PBS), 1 мл за один раз. Каждый раз мягко вывести жидкость в шприц и reinfuse его обратно в легких, 3 раза подряд. После сбора BALF, выполняют шейки матки дислокации для обеспечения эвтаназии. Передать трубку, центрифуги на 1000 x g за 10 мин, собранных PBS (~2.8 мл), которая является Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF), и собирать гранулы. Добавьте 1 mL свежих PBS в трубку и центрифуги на 1000 x g 10 мин мыть мусора и собирать гранулированных альвеолярные макрофаги.
  8. Ресуспензируйте гранулы в 2 мл среды (DMEM) Дульбекко изменение орла с 10% nonheat инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) и культуры первичной альвеолярных макрофагов в тех же СМИ за 2 дня на блюде стекло дно при 37 ° C в атмосфере увлажненной.
  9. Аспирационная старых СМИ, промойте его с 1 мл раствора PBS и добавить 2 мл свежего средств массовой информации. Добавить FITC бусины (карбоксилатные латексные шарики, 2 мкм в диаметре, 50 бусы/клеток) и инкубировать 1 час при 37 ° C в атмосфере увлажненной.
  10. Мыть широко с PBS (1 мл в то время, в общей сложности пять смывки) для удаления внеклеточного бусины. Случайно изображение 100 клеток и подсчитать количество ячеек с внутриклеточной бусины (488 нм).
    Примечание: фагоцитарный индексы являются количество попадает бусы, деленное на общее количество макрофагов; процент фагоцитирующих клеток — количество макрофаги, которые глотать по крайней мере один шарик, деленное на общее количество макрофаги16.
    1. Кроме того после 1 ч инкубации с бисером, вымыть клетки с 3 мл PBS и обрабатывать их для проточной цитометрии для количественной оценки фагоцитоза. Аналогичным образом процесс AMs без бисера как безупречный ячейки или элемент управления. Рассчитать процент позитивность и означают интенсивности флуоресценции, использованием потока цитометрии программное обеспечение, выбрав эти варианты в программном обеспечении.

2. FcγR - и CR-опосредованной фагоцитоз

  1. Для опсонизацию проинкубируйте 2 x 108 овец красные кровяные клетки (SRBCs) с 50 мкл кролик анти SRBC-IgM или 50 мкл кролика, анти SRBC-IgG за 30 мин при комнатной температуре11.
  2. Инкубируйте IgM опсонизированными SRBCs с 50 мкл человеческой сыворотки C5-недостаточным (C5D) на 30 минут при 37 ° C для фиксации фрагментов дополнения C3b и C3bi на IgM покрытием SRBCs.
  3. Семя мышиных макрофагов (клетки MH-S) (10 000 клеток/а) в 96-луночных пластине и инкубировать на ночь, чтобы получить сочетанием ~ 70%. Добавить 100 мкл/мл 1 x 10-7опсонизированными SRBCs в каждой скважине MH-S клеток и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Мыть несвязанные SRBCs очень быстро (~ 1 мин) с 100 мкл буфера lysis аммония хлорид калия (ACK).
  4. Лизировать клетки с 0.1% SDS и добавьте 50 мкл 2,7-diaminofluorene (DAF), содержащий 3% перекиси водорода и 6 М мочевины. Измерение оптической плотности формирования гемоглобина катализированное флуорена синий на 620 Нм.
  5. Определите количество SRBCs с помощью стандартной кривой в 620 Нм значения поглощения с известным количеством SRBCs. Аналогичным образом процесс MH-S клетки инкубировали с nonopsonized SRBCs для использования в качестве негативных элементов.

3. PRR-опосредованной фагоцитоз

  1. Выполните шаги 1,1-1,9 для изоляции и культивирования мышь первичной альвеолярных макрофагов.
  2. После 2 дней удалите средства массовой информации, вымыть клетки с 1 мл раствора PBS и 500 мкл свежих сред, содержащих Alexa Fluor-488-конъюгированных zymosan-A bioparticles (100 частиц/блюдо).
  3. Инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Остановите фагоцитоза, добавив 500 мкл ледяной PBS.
  4. Вымойте клетки активно с PBS (1 мл в то время, в общей сложности пять автомойки). Исправьте клетки с параформальдегида 4% за 10 мин при комнатной температуре.
  5. Вымыть клетки активно с PBS (1 мл в то время, в общей сложности пять смывки) и сохранить клетки в 500 мкл PBS.
  6. Изображение клетки под дифференциальной помехи контраст и флуоресцентные канала в 488 нм. AMs, содержащие zymosan-A bioparticles и определить процент фагоцитоза.

4. в естественных условиях фагоцитоза, альвеолярные макрофаги

Примечание: Прививок P. aeruginosa GFP на тарелку питательный агар и инкубировать пластины при 37 ° C на ночь. На следующий день прививок одной колонии по 2 мл бульона, питательных и расти бактерий при 37° C на ночь.

  1. Следующий день, анестезировать мышей с внутрибрюшинного отправления Ксилазина кетамина и 10 мг/кг 100 мг/кг. Подтверждение правильного анестезии через отсутствие реакции на мыс пинча.
  2. Положите мыши на плоской доски с резинкой через верхние резцы и поместите его в semirecumbent (45°) положении с вентральной поверхности и трибуны, вверх. С помощью Изогнутый пинцет, частично отозвать язык. Intratracheally управления microsprayer, 50 мкл (5 х 106 образуя колонии единиц [CFU])17 P. aeruginosa GFP в легкие наркотизированных мышей.
  3. После 1 h инфекции выполните шаги 1.1-1.7.
  4. Ресуспензируйте клетки в PBS и cytocentrifuge их (1000 x g, 1 мин при комнатной температуре) на стеклянное скольжение.
  5. Дифференциально пятно cytospin слайды для альвеолярные макрофаги и нейтрофилы, лимфоциты, согласно инструкциям производителя.
  6. Случайным образом выбрать 100 AMs, подсчета АПП, содержащие внутриклеточных бактерий и определить процент фагоцитоза.

5. в естественных условиях бактерии разминирования с помощью P. aeruginosa

  1. Прививок P. aeruginosa на тарелку агар P. aeruginosa изоляции и инкубировать пластины при 37 ° C на ночь. Прививок одной колонии до 2 мл бульона lysogeny (LB) и расти бактерий при 37° C на ночь. Вычислите CFU, с помощью следующей формулы.

    КОЕ/мл = (количество колоний x коэффициент разрежения) / объем пластину культуры.

    Разбавьте культуры с PBS для получения желаемого кое/мл.
  2. В пробной 1, intratracheally придать сублетальных доз ~2.5 x 105 кое/мл P. aeruginosa наркотизированных одичал тип (WT) и TRIM72KO мышей, как указано в шаге 4.2. Измерьте вес тела ежедневно в течение 6 дней.
  3. В пробной 2 ввести вторую дозу P. aeruginosa (5 x 105 кое/мл) в мышей, которые выжили в пробной 1 и измерения массы тела в течение 4 дней.
  4. В пробной 3, используя другой набор мышей придать WT и TRIM72KO мышей с смертельной дозы (3 x 107 кое/мл) P. aeruginosa и запишите смертность в течение 2 дней после инъекции. Признаки тяжелой стресса, такие как потеря веса значительное тела животных, сгорбленная обратно, анорексия или одышка будут оцениваться путем посещения ветеринары. Неизлечимыми животных будет жертвовать немедленно.
  5. В момент смерти или после эвтаназии на 2 день после инъекции Соберите целое легочной ткани для количественной оценки легких бактериальной нагрузки на пик инфекции.
  6. Чтобы проверить легких бактериальной нагрузки, 200 мкл нормальное saline в тканях легких и гомогенизации их, используя параметр ранее протестированных на электронных гомогенизатор, который полностью разрушает легочную ткань не нарушая бактерий. Отрегулируйте общий объем легких огневки до 1 мл и пластины 100 мкл легких lysate на плиты агара Pseudomonas изоляции на десятикратного серийных разведений.
  7. Инкубировать пластины при 37 ° C в течение 24 часов и рассчитывать бактериальных колоний для определения кое за весь легких.

6. Статистический анализ

  1. Используйте студента t-тест для определения статистической значимости различий между двумя группами. Рассмотреть статистически значимой разницы когда p < 0,05. Все данные представлены как средства ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы впервые провели эксперимент, чтобы анализировать фагоцитоза, мышь первичной AMs. На протяжении всех анализов мы сравнили AMs, изолированные от WT и TRIM72KO мышей. Как показано на рис. 1А, микроскопии флуоресцирования показал что фагоцитоза FITC-стеклянные бусины мышь первичной AMs происходит после 1 ч инкубации. Рисунок 1 B подачей cytometry показывает анализ фагоцитоза. Количестве...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

При выполнении функции обмена газа, легких упорно противостоит посторонних частиц, патогенов и аллергенов. АПП обеспечивают первую линию обороны в силу их основная функция, а именно фагоцитоза. АПП также координировать с другими иммунные клетки в уничтожении патогенных микроорганизмов, а также в резолюции воспаления. Здесь мы описали методы специально оценки фагоцитоза, AMs, изолированных от легких мыши. Протокол, представленный в этой рукописи объясняет детальное изучение фагоцитоза in vivo и в пробирке, которые также м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа поддерживается Грант R01HL116826 X. Zhao.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
18-G ИглаNipro Medical CI+1832-2CМолекулярная биология класс
2,7-диаминофлуорен (DAF)Sigma-AldrichD17106Молекулярная биология класс
70% этанолDecon Labs Inc.18C27BАналитический класс
96-луночный планшетCorning3603Клеточная биология класс
ACK лизисный буферLife TechnologiesA10492Молекулярная биология класс
Alexa fluor-488 Зимозан-A-биочастицаThermofisher ScientificZ23373Молекулярная биология класс
C5 дефицит сыворотки Sigma-AldrichC1163Биохимический реактив
ЦентрифугаLabnet InternationalC0160-R
Cytospin 4 ЦитоцентрифугаThermofisher ScientificA78300101 Выпуск 11
DMEM Среда для клеточных культурGibco11995-065Клеточная биология класса
FBSAtlanta BiologicalsS11550Клеточная биология класс
Flow ЦитометрBD BiosciencesFACSCalibur
Flow Jo SoftwareFlowJo, LLC
ЩипцыDumont0508-SS/45-PS-1Подходит для вскрытия лабораторных животных
FITC-карбоксилированные латексные шарикиSigma-AldrichL4530Клеточная биология класс
GFP-P. aeruginosaATCC101045GFPПодходит для  анализы на клеточную инфекцию
Чашка со стеклянным дномMatTek Corp.P35G-0.170-14-CШприц высокого давления класса клеточной биологии
Penn-CenturyFMJ-250Подходит для использования на лабораторных животных
ГомогенизаторOmni InternationalTH-01
Перекись водородаSigma-AldrichH1009Аналитический класс
Инвертированный флуоресцентный микроскопOlympusIX73
Кетамин ГидрохлоридHospiraCA-2904Фармацевтический класс
Shandon Kwik-Diff StainsThermofisher Scientific9990700Клеточная биология класс
LB АгарFisher ScientificBP1425Молекулярная биология класс
LB Бульон FisherScientificBP1427Молекулярная биология класс
MicroSpray АэрозолизаторPenn-CenturyIA-1CПодходит для использования на лабораторных животных
ПараформальдегидSigma-AldrichP6148Реагент класса
PBSGibco20012-027Клеточная биология класса
кролика анти-SRBC-IgG MP Biomedicals55806Подходит для иммунологических анализов
кроликов анти-SRBC-IgM Cedarline LaboratoriesCL9000-MПодходит для иммунологических анализов
НожницыMiltex5-2Подходит для вскрытия лабораторных животных
Ларингоскоп мелких животныхPenn-CenturyLS-2Подходит для использования лабораторными животными
Додецилсульфат натрия (SDS)BioRad1610301Аналитический класс
Пружинные ножницы (Med)Инструменты для тонкой науки15012-12Подходит для вскрытия лабораторных животных
Пружинные ножницы (маленькие)Fine Science Tools91500-09Подходит для вскрытия
лабораторных животных овечьих эритроцитов (SRBC)  MP Biomedicals55876Мытый, консервированный SRBC
МочевинаSigma-AldrichU5378Молекулярная биология класса
Ксилазин Akorn Animal Health59399-110-20Фармацевтический класс

Ссылки

  1. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
  2. Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
  3. Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
  4. Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
  5. Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
  6. Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
  7. Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
  8. Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
  9. Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
  10. Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
  11. Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).
  12. He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
  13. Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
  14. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  15. Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
  16. Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
  17. Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Анализ фагоцитозаклиренс бактериймодель на мышахP aeruginosaинтратрахеальное введениебронхоальвеолярный лаважпроточная цитометрияфлуоресцентная микроскопиярецептор комплемента
Альвеолярных макрофагов фагоцитоза и распродажа бактерий в мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.