Поведенческие подходы к изучению врожденного напряжения в рыбе данио

Стресс ответы изменены поведенческих и физиологических состояний в результате потенциально вредных или отрицательной стимулы. Стресс ответы сохраняются во всем животном царстве, и имеют решающее значение для выживания организма¹. Десятилетия исследований значительно расширили наши знания о некоторых генетических и нейрональных механизмов, лежащих в основе стрессовых состояний. Сегодня, области головного мозга, такие как миндалины и стриатум², и генетические факторы, такие как кортикотропин рилизинг гормон (ЦРБ), и глюкокортикоидов (гр) и минералкортикоидных рецепторов ( Mr) были подробно изучены^3,4,5,6. Несмотря на эти критические выводы, многое остается неизвестным о генетическом и нейрональных регулирование стресса. Как таковой, много вызванных напряжений разладов терпят от отсутсвия терапевтики.

Генетически наменные модели организмов обеспечивают полезный инструмент в изучении генетического и нейрональных контроля поведения. Модели рыб, в частности, чрезвычайно мощные: они являются малыми организмами с коротким поколением, их использование в лабораторных условиях является поверхностным, их геномы легко модифицированы, и, как позвоночных, они разделяют не только генетические, но и нейроанатомические Гомология с их коллегами млекопитающих^7,8. Стандартные анализы для измерения напряжения могут быть в паре с линиями рыб данио укрывательство генетических мутаций, или те, в которых манипуляции точных нейронных подмножеств возможно, и эффекты отдельных генов или определенных нейронов могут быть оценены быстро и эффективно.

Поведенчески, стресс ответы могут быть охарактеризованы в рыбе как периоды гипер-активности или длительных периодов бездействия (сродни "замораживания")⁹, снижение разведки¹⁰, учащенное дыхание, снижение потребления пищи¹¹, и место-предпочтение на дно танка¹². Например, при помещении в незнакомый танк, рыба взрослого данио и другие мелкие рыбные модели изначально отдают предпочтение нижней половине бака, однако со временем рыба начинает исследовать верхние и нижние половинки с почти одинаковой частотой¹². Лечение взрослых с наркотиками, как известно, уменьшить беспокойство вызывают рыбу сразу исследовать верхнюю половину^10,13. И наоборот, препараты, которые увеличивают тревогу вызывают рыбы, чтобы показать сильное предпочтение нижней половине танка^12,14,15. Таким образом, снижение разведочных работ и предпочтение нижней части бака являются простыми и надежными индикаторами стресса.

Как и большинство позвоночных, стрессовые реакции в рыбе обусловлены активацией гипоталамо-гипофизарно-межпочечной оси (ИНН; аналог гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси у млекопитающих)^14,16. Гипоталамуса нейронов, выражающих гормон кортикотропин рилизинг гормон (ЦРБ) сигнал гипофиза, который в свою очередь релизы адренокортикотропиком рилизинг гормон (ACTH). ACTH затем сигналы в межпочечную железу производить и секретируют кортизола, который имеет ряд вниз по течению цели¹⁶, один из них является отрицательной обратной связи от ЦРБ-производство нейронов гипоталамуса^{3,17, 18,19}.

Здесь мы описываем метод оценки поведенческих показателей врожденного стресса. Для поведения, мы подробно протоколы, используя новый танк Дайвинг тест^12,14. Затем мы демонстрируем, как пример, что известный Анксиолитический препарат, buspirone, уменьшает поведенческие меры стресса.

Протокол был одобрен институционального ухода за животными и использовать Комитет Флорида Атлантического университета.

1. Подготовка

1. Обозначьте изолированную комнату для выполнения поведенческих исследований или закройте часть комнаты так, чтобы она была изолирована.
   Примечание: номер должен быть безмятежным и иметь низкий трафик, чтобы избежать нарушения нормального поведения рыбы.
2. Переместите следующие материалы и оборудование в поведенческую комнату: (i) фотоаппарат и объектив, (II) инфракрасный фильтр, который может быть присоединен к объективу, (III) стенд камеры, (IV) компьютер с программным обеспечением для приобретения камеры, (v) твердая и стабильная таблица для выполнения анализа на, (VI) инфракрасные огни (ИК огни; 850 нм или 940 нм), (VII) белый акриловый диффузор, который длиннее длины танка записи (VIII) 1,8 L тратраоидальная пластиковая Пробирная цистерна (именуемый "Роман танк '; один используется здесь 12 х 18 дюймов) , и (IX) ведро рыбы системы воды.
   Примечание: для романа танк, наша лаборатория использует коммерчески доступных пластиковых сосудов, которые являются тратратоидная форма. Размеры танка примерно 6 в х 9 в (подробные размеры предоставляются на рисунке 1а). Диффузор борту мы используем немного больше, чем Роман танк (12 в х 18 в). Новые эксперименты танк были выполнены с цистернами, имеющих различные формы, такие как те, которые имеют прямоугольную форму или с различными тратраоидной размеры^20,21. Как правило, поведение рыб аналогично во всех резервуарах независимо от их размеров: для всех контейнеров, рыба изначально предпочитают нижнюю половину, но с течением времени начинают изучать верхнюю половину с большей частотой.
3. Прикрепите инфракрасный фильтр к объективе камеры. Длины волн инфракрасных световых полос обычно варьируются от 850 нм до 940 нм. Фильтр длинный проход фильтр, который ограничивает свет длин волн менее 720 Нм от передачи через к камере.
4. Выберите подходящие параметры для программного обеспечения для приобретения камеры. Для большинства записей, установите приобретение камеры в размере 30 кадров в секунду, и продолжительность записи до 10-мин.
   Примечание: эти параметры могут отличаться в зависимости от эксперимента. Например, для изучения привыкания в романе танк^22,23, более длинные записи могут потребоваться.

2. Настройка

Примечание: шаги в этом разделе описывают создание нового анализа танка. Диаграмма конечного продукта дается на рисунке 1B.

1. Поместите Роман танк в середине таблицы.
2. Разместите инфракрасные огни позади танка и поместите белый акриловый лист или экран диффузора между баком и СВЕТОДИОДНЫМ источником света.
   1. Поместите диффузор так, что он максимально распространяет свет, поступатель от светодиодов, и интенсивность света достаточно, чтобы осветить новый танк. Чем ближе доска к источнику света, тем ярче будет свет, тем меньше он будет распространяться. В отличие от этого, размещение диффузора борту от источника света снизит интенсивность света, но распространять свет лучше.
3. Заполните приблизительно 3/4 из романа бака с водой системы рыб.
   Примечание: система воды генерируется с помощью обратного осмоса водопроводной воды, а затем дозирования, что проводимость равна 900 ± 100 МКС, что рН нейтрально (7,2), и что температура 27 ± 1 ° c.
4. Прикрепите камеру к камере стенд и подключить камеру к компьютеру. Откройте программное обеспечение для приобретения видео и настроить камеру для лица передней части танка и обеспечить весь роман танк можно увидеть и что есть нет затемнены области в видео. Отрегулируйте бак и ультракрасные света такие что достаточно и даже освещение повсеместно в бак наблюдано через камеру.
   Примечание: прежде чем приступать к экспериментам, это часто может быть полезно для выполнения пробный запуск, в котором видео рыбы захватили и отслеживания выполняется. Это гарантирует, что настройка является достаточным для экспериментов с поведением.

3. Новая установка испытания бака

1. Приготовьте стакан 250 мл, предварительно заполненный водой из рыбы, и, по крайней мере, два резервуаров для проведения.
2. На утро испытания, передача по крайней мере 10 тест взрослых рыб данио, которые будут использоваться для каждого экспериментального состояния (контроля и экспериментальных взрослых) из рыбы объекта в холдинг танк, передавать их в комнату поведения, и дать им возможность акклиматизировать, по крайней мере один Час.
   Примечание: анализ мощности должен быть выполнен до экспериментов, но в наших руках, n = 10, как правило, достаточно, чтобы обнаружить статистическую значимость. Кроме того, в холдинг-баке должно содержаться не более пяти особей на литр воды. Акклиматизирование одного часа достаточно, так как взрослые рыбы данио были показаны, чтобы пристать в течение 30 минут нового танка²². Кроме того, поведенческие ритмы страдают от циркадных процессов, и, таким образом экспериментальных повторяет делать в разные дни должны выполняться в течение одного часа. Мы обычно выполняем все эксперименты между часами 11:00 утра и 6:00 вечера.
3. Маркировать танки таким образом, что состояние или генотипа животных слепа к экспериментатору.
   Примечание: эксперименты могут быть легко ослеплены экспериментатору путем маркировки танков, используя букву или систему номера (то есть, один танк помечен как ' A ', другой ' B ' и т.д.). Участник не участвует в экспериментах этикетки танков с такой системой, и маски тождества от экспериментатора до окончания пост-анализ завершен.
4. Используя сеть, аккуратно поместите одного взрослого в предварительно заполненную стакан от шага 3,1. Разрешить взрослой рыбе акклиматизировать в стакане в течение 10 минут.
   Примечание: запись пола взрослого, как это может быть важно после анализа, чтобы искать секс-специфических различий.
5. После акклиации в стакане, ввести рыбу в романе танк (создан в разделе 1), осторожно наливание воды и взрослых из стакана.
6. После введения взрослого в новый танк, начать запись камеры, и отойти от установки, чтобы предотвратить дополнительные бедствия для рыб.
7. После завершения записи, удалите человека из романа танк и поместите в новый холдинг танк.
   Примечание: другой Холдинг бак из 1 в шаге 3,2 должны быть использованы для предотвращения повторного тестирования на тех же лиц.
8. Повторите шаги 3,4 до 3,7 для каждого взрослого, пока все животные были протестированы.
   Примечание: в дополнение к ослепляющему условий или генотипов, рандомизации испытаний. Используйте генератор случайных чисел или любой инструмент, который позволяет случайным образом между испытаниями. Это должно быть сделано до экспериментов, так что каждое испытание определяется до начала экспериментов.
9. В конце всех тестов верните рыбу обратно в рыбное заведение.

4. Предварительная обработка препаратом

Примечание: целью следующих шагов является сравнение поведения индивида до и после употребления наркотиков. Это сравнение достигается путем первого выполнения испытания нового танка, как в шаге 3,4 к 3,6, а затем медикаментозного лечения, а затем второй тест танк Роман (рис. 3а).

1. Подготовьте запас раствора препарата, в том числе положительный и отрицательный контроль.
   Примечание: если препарат ранее использовался в литературе, найти соответствующую рабочую дозу и использовать это. Например, для буспирон в репрезентативных результатах, мы делаем 100X складе решение и использовать 0,05 мг/мл в качестве конечной концентрации, как описано в литературе^13,20. Если предложена доза неизвестна, кривая реагирования на дозу должна выполняться путем изучения нескольких концентраций. Настройка больше бикеров с серийными разведениями наркотиков. Если препарат не растворяем в воде, используйте диметилсульфоксид (ДФСО) в качестве растворителя.
2. Разбавленные препараты для рабочей концентрации в 250 мл бикеры с системой воды. Например, если было сделано 100X раствор, разбавить 1:100 в системе воды. Настройка стакан с водой только системы в качестве элемента управления.
   Примечание: Если ДДСО использовался в качестве растворителя в шаге 3,1, используйте равный объем ДДСО в контрольном стакане.
3. С помощью другого исследователя, маска тождества наркотиков и контроля Бикерс, чтобы убедиться, что тестер слеп к условиям лечения до пост-анализа.
   Примечание: может использоваться система номер или буква.
4. Выполните новый тест танк, следуя шагам 3,1 к 3,6 для получения базового поведенческого стрессового ответа.
5. После базовой записи, используйте сеть, чтобы немедленно удалить взрослую рыбу из романа танка и поместить его в стакан, дозированный с наркотиками или транспортным средством, как описано в шаге 4,2. Разрешить взрослым оставаться в стакане в течение 10 мин.
   Примечание: Убедитесь, что чистая не прикасайтесь к воде в Бикерс для предотвращения перекрестного заражения наркотиками. Обеспечить правильную дозировку и администрирование время в зависимости от используемого препарата. 10 мин время лечения может не работать для всех препаратов.
6. После лечения используйте сетку, чтобы удалить взрослого из стакана в шаге 4,5 и поместите его в другой стакан, наполненный свежей системой только водой. Это период вымывания, чтобы минимизировать дальнейшие дозировки во время второго испытания танка роман. Разрешить взрослым оставаться в промыть стакан для дополнительного 10 мин.
   Примечание: отдельные сетки должны использоваться для каждого состояния препарата, чтобы предотвратить любое нежелательное перекрестное лечение с наркотиками. Период вымывания может быть пропущен при желании экспериментатора.
7. Выполните новый танк Дайвинг тест второй раз, удалив, что взрослый из стакана в предыдущем шаге, поместите его в новый танк роман, и следуйте инструкциям 3,5 до 3,6.
8. После второго испытания нового танка, удалите человека в отдельный холдинг танк. Вылейте воду системы во втором романе танк и заполнить его свежей системы воды для следующего испытания. Этот шаг предотвращает перекрестное загрязнение любого препарата.
   Примечание: в зависимости от срока полураспада лекарств, свежие бикеры содержащие препараты должны быть сделаны каждые 3 часа. Для buspirone, сделать свежие решения каждые 3 часа. Кроме того, следуя примечании в шаге 3,8, испытания должны быть рандомизированными между элементами управления и медикаментозными процедурами.
9. В конце всех испытаний, возвращение лиц обратно в рыбе объекта.
   Примечание: в зависимости от типа используемого препарата, эффекты этих методов лечения на людей могут быть долговечном. Поэтому не пользуйтесь этими индивидуумами в других экспериментах.

5. Анализ видео

1. После всех испытаний Загрузите видео-файлы в программное обеспечение для отслеживания выбора.
   Примечание: мы обычно используем коммерчески имеющееся отслеживая програмное обеспечение, но несколько свободно имеющихся пакетов програмного обеспечения можно использовать. Шаги для достижения отслеживания могут отличаться в зависимости от используемого программного пакета.
2. Использование неподвижа кадр из видео, определить мнимые границы вокруг (i) весь роман танк арене, которая заполнена водой, и границы вокруг (II) верхняя треть, (III) средней трети, и (IV) нижней трети танка. Используйте их, чтобы установить время, которое рыба провела в каждой части танка романа.
3. Расчет x-y смещения за кадр для каждой арены, определенной в шаге 5,2.
4. Определите верхние, средние и нижние области бака. Каждый регион должен быть схоже по размеру. Краткий метод определения этих регионов состоит в том, чтобы рассчитать длину бака в направлении y, и разделить это на 3.
   Примечание: Существуют вариации общего протокола. Например, некоторые лаборатории используют половинки вместо третей¹⁴.
5. Определите время, проведенное на каждой арене, на расстоянии и скорости.
   Примечание: большинство отслеживания пакетов будет автоматически рассчитать их для пользователя. Однако, если программное обеспечение отслеживания не делает, они могут быть рассчитаны легко от x-y значений смещения. Например, расстояние можно определить с помощью формулы:
   
   и скорость может быть определена следующим формула:
   
6. Повторите шаги 5,2 до 5,4, чтобы приобрести треки и измерений для всех испытаний.
   Примечание: вариации этого общего протокола

6. тестирование на нормальность

1. Выполните статистику, прежде чем приступать к вычислениям статистических различий. Проверьте, обычно ли данные распространяются с помощью теста Шапиро-Wilk.
2. Если нулевая гипотеза о том, что данные обычно распределены, отклоняется (т.е. данные не следуют за распределением Гауссово), выполните все тесты с использованием непараметрических тестов. И наоборот, если данные, как установлено, следуют обычному распределению, переходите к использованию параметрических тестов.
   Примечание: мы используем коммерчески имеющееся програмное обеспечение для того чтобы выполнить статистик; Тем не менее, язык программирования R также может быть использован. Анализ Шапиро-Уилка может быть выполнен с помощью Шапиро. тестового функции.

Изучение стресса в рыбе данио
Для изучения стресса поведение с течением времени в диком-тип рыбы данио, мы протестировали взрослых рыб из штамма AB24 в испытании нового танка. Взрослые из AB были подвергнуты протоколу, как описано выше. Коротко, рыбы получили 1-h период акклиации в баке в комнате поведения. Человека поместили в стакан на 10 мин, а затем аккуратно поместили в незнакомый танк (новый танк), наполненный свежей системной водой. Двигательного аппарата был записан на 10-мин, и отслеживание был выполнен в автономном режиме с использованием коммерчески доступного программного обеспечения. Сравнение двигательного действия между первой и последней минутой выявило драматические отличия (Рисунок 2A, B). Когда рыба впервые была введена в бак, она проводила большую часть времени в нижней части (рис. 2b), но со временем у взрослых было постепенное увеличение количества времени, проведенного в верхней части (Рисунок 2B, C). Общая длительность, проведенная в верхней части в первую минуту по сравнению с последней минутой, показала существенные отличия (6,29 ± 8,21 с против 23,23 ± 9,02 с; парный т-тест, p < 0,05) (рис. 2с). Напротив, общее расстояние, пройденное между первой и последней минутой, не выявило существенных различий (440,4 ± 110,3 см против 405,5 ± 49,71 см; парный т-тест, p = 0,375) (Рисунок 2D). Поскольку врожденное предпочтение различно между первой и последней минутой, а не пройденным расстоянием, мы полагаем, что изменение в поведении представляет собой реакцию стресса, а не просто изменение двигательного действия. Эти результаты свидетельствуют о том, что данио рыбы экспонат легко измеримых врожденной реакции стресса. Этот подход также устанавливает основание для сравнения различий в стрессе между различными группами животных и оценки различий в стрессе между ними.

Эффекты анксиолитических препаратов на стрессовое поведение рыбы данио
Рыба данио-это мощная система для скрининга лекарственных препаратов, так как применение препарата можно применять неинвазивными способами, просто добавляя к воде25,26,27. Чтобы проверить, что нижняя жилище в данио рыба представляет собой врожденный ответ на стресс, мы сравнили поведение в группах взрослых рыба данио испытания до и после контакта с анксиолитическим препаратом; в качестве элемента управления, мы обрабатываются отдельно от взрослых аналогично, но применяется только транспортное средство (система воды), а не наркотиков. Мы использовали агонистом рецепторов 5HT1A бупирон, который не является контролируемым веществом и назначается человеческим пациентам, страдающим от генерализованного тревожного расстройства28. Buspirone была подтверждена, чтобы вызвать снижение поведенческих реакций стресса в различных рыб и млекопитающих модели10,13,21,29,30, 31,32,33,34 . Как описано в протокольном протоколе, рыба данио впервые была записана в новом резервуаре, затем была извлечено и помещена в стакан с наркотиками или автомобилем на 10 мин. Затем рыба была предоставлена "промывать" период, когда они были помещены в новый стакан на 10 мин , а затем перезаписаны в новый танк тест (рис.3а).

Анализ двигательного пути показал небольшую разницу до и после лечения для групп взрослых, подвергающихся воздействию только транспортного средства (Рисунок 3B). В отличие от этого, взрослые, подверглись бупирон провел большое количество времени в верхней по сравнению с двигательного пути той же рыбы до воздействия наркотиков (Рисунок 3B, C). Количественная оценка продолжительности времени, проведенного в верхней части, не выявила существенных различий между пред-и послелечением в контрольных животных (183,9 ± 90,46 s до против 113,8 ± 81,88 с после; в одну сторону Анова, а затем с помощью нескольких сравнений Сидак, p = 0,4254), но животные подвергаются буспирон провел значительно больше времени в верхней по отношению к предварительной обработки, и контролировать лиц после лечения (буспирон: 201,4 ± 49,95 s до против 552,2 ± 42,97 s после; в одну сторону Анова после нескольких Сравнение тест, р < 0,0001; Контроль против Buspirone после лечения: p < 0,0001.) (Рисунок 3C). Чтобы проверить, были ли отличия вызваны меньшим локомоции в целом, мы измеряли общее пройденное расстояние. Эти данные не выявили существенных различий для любой из групп (4134 ± 601,9 см до против 3471 ± 766 см после для контроля; Испытание Крускал-Уоллис, p > 0,05; 3904 ± 301,3 см до против 3644 ± 566,3 cm после для buspirone; Испытание Крускал-Уоллис, p > 0,05) (Рисунок 3D). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что нижний жилой в взрослых рыб данио является мерой врожденного стресса, и создать основу для дальнейших фармакологических экспериментов у взрослых рыб данио.

Рисунок 1 . Схема установки романа танк. (A) размеры 1,8 L тратраоидального романа танк, как видно со стороны записи танка. (B) схема установки, включая позиции инфракрасных огней, камеры, и барьеры, используемые для минимизации вмешательства человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Рисунок 2 . Изучение врожденного стресса ответы в дикого типа данио рыбы. A) репрезентативные плаваные дорожки отдельного взрослого в тесте нового танка в первую минуту (слева) и последнюю минуту (справа) 10-минутной записи. Воображаемые линии, определяющие верхнюю, среднюю и нижнюю зоны бака, обозначены пунктирной линиями. B) количественное определение общего времени в верхней зоне за каждую минуту 10-минутной записи. (C &Amp; D) Сравнение общей продолжительности, потраченного в верхней зоне (C) и общей пройденной дистанции (D) в первой и последней минуте всех испытаний. Для анализа использовались спаренные т-тесты, поскольку данные проходили тест Шапиро-Уилка на нормальность. n = 5; *: p = 0,028. Бары ошибок указывают на стандартную ошибку среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Рисунок 3 . Изучение влияния анксиолитических препаратов на стрессовое поведение. A) схема экспериментального потока. (B) представитель плавать пути предварительного и после лечения человека от контрольной отдельные относились с системой воды только, и еще один человек относился с буспирон в новый танк испытания. Пунктирные линии определяют разделение верхней, средней и нижней зон бака. Серые треки представляют собой элемент управления, а синие дорожки представляют собой бупирон-обработал человека. (C &Amp; D) Сравнение общей продолжительности, потраченного в верхней зоне (C) и общего пройденного расстояния (D) между контролем (Ctrl) и бупирно-Обработными (busp) испытаниями. Впервые был сделан тест на нормальность с помощью теста Шапиро-Уилка. В тех случаях, когда тест на нормальность не удался, был использован тест Крускаль-Уоллис с последующим множественным сравнениями Данн (C); и если данные передаются в нормальное русло, то для анализа (D) использовалась однократная Анова, за которой последовал тест Сидак с множественными сравнениями. n = 5 для каждого условия; : p = 0,001. Бары ошибок указывают на стандартную ошибку среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих или финансовых интересов.