Магнитно-резонансная томография оценки опухолей канцероген индуцированной мышиных мочевого пузыря

Рак мочевого пузыря является пятым наиболее распространенной формой рака в целом, отвечает за примерно 80 000 новых случаев заболевания и 16 000 смертей в Соединенных Штатах в 2017 году¹. Примерно через 30 лет без значительных успехов для системного лечения рака мочевого пузыря²недавние испытания ингибитора анти PD-1 и анти PD-L1 КПП продемонстрировали захватывающие и иногда прочный ответы больных с передовой Urothelial карцинома^3,4,5. Однако только около 20% больных показывают объективный ответ на эти процедуры, и необходимы дальнейшие исследования для расширения эффективного использования иммунотерапия больных с раком мочевого пузыря.

Мышиных мочевого пузыря рак модели являются важнейшими инструментами в доклинической оценке Роман лечения^6,7. Для того чтобы контролировать размер опухоли при случайной мышей для различных методов лечения, опухоль бремя должны оценивать и контролируемых между группами лечения. Предыдущие исследования использовали УЗИ или биолюминесценции для оценки ортотопическая клеток на основе линии мочевого пузыря рак модели^8,9,10,11. Однако оба методы представляют несколько недостатков. Ультразвуковых измерений могут зависеть от навыков оператора и отсутствие трехмерные характеристики и высокое пространственное разрешение. Биолюминесценции методы обеспечивают только полу количественной оценки опухолевых клеток и не позволяют для визуализации мочевого пузыря анатомии и морфологии. Кроме того биолюминесценцию может использоваться только с моделями на основе линии клеток, которые выражают биолюминесцентных генов в лысых мышей или мышей с белым пальто.

Магнитно-резонансная томография (МРТ), с другой стороны, предлагает уникальную гибкость в приобретении анатомических изображений с высоким разрешением, выставляют широкий спектр тканей контраст, который позволяет точную визуализацию и количественной оценки бремени опухоли без необходимости выразить биолюминесцентных свойства. Г-н изображения более легко воспроизводимые с соответствующий анализ трубопроводов и процедуру визуализации мочевого пузыря. Крупнейший ограничения МРТ, продолжительность времени, необходимого для обследования и связанные высокие затраты, которые ограничивают анализов высокой пропускной способности. Однако несколько исследований показали, что г-н последовательностей может предоставить диагностические изображения высокого качества, которые могут использоваться для эффективного выявления и мониторинга клетки опухоли мочевого пузыря, на основе линии; Таким образом они могут использоваться для высокой пропускной способности анализа^9,12.

Здесь мы описываем неинвазивный метод, основанный на MR, надежно и эффективно охарактеризовать канцероген индуцированной пузыря опухолей у мышей. Для этого мы используем быстро изображений с установившемся прецессии MR техника (правда FISP), который гарантирует короткие сканирования сессий, обеспечивая высокое качество и высокое пространственное разрешение (~ 100 мкм) для обнаружения и измерения мочевого пузыря опухоли¹³. Кроме того чтобы подтвердить точность этой неинвазивной пробирного МРТ, мы описываем корреляции между МРТ производные параметры и ex vivo вес мочевого пузыря, а также стадии патологически подтвердил опухоли.

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Северо-Западного университета.

1. индукции опухоли с BBN

1. Получение самцов мышей C57/BL6, каждая по крайней мере 6 недель.
   Примечание: Мышей-самцов развиваться рак мочевого пузыря, более быстро и последовательно, чем самок мышей^14,15.
2. Добавьте N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) Амин (BBN) в дозе 0,05% питьевой воды. Сохранить его в контейнере непрозрачной и предоставить ad libitum как питьевая вода для мышей¹⁶.
   Примечание: Хранение BBN решение в контейнере ясно будет деградировать канцероген¹⁷.
3. Измените 0,05% BBN воды два раза в неделю.
4. Мониторинг животных, проверяя для признаки бедствия, связанные с опухоли мочевого пузыря, включая гематурия, фирма мочевого пузыря и масс. Осмотрите мышей дважды в неделю или в соответствии с местными IACUC руководящих принципов.
5. Ожидаете опухоли развивать между 16 и 24 недель воздействия¹⁸.

2. МРТ установки

1. Выполните подкожного введения стерильного физиологического раствора (0,1 – 0,2 мл, с помощью иглы и 1 мл шприца 25 – 27 G) 10 мин до МРТ для облегчения наполнения мочевого пузыря.
2. Анестезировать каждая мышь с газовой смеси 100% O₂ и изофлюрановая (2%-4% в случае необходимости). Проверка надлежащего плоскости анестезии путем проверки вывода рефлекс (мыс пинча) прежде. Применить стерильная глазная мазь для животного.
3. Передача мыши владельцу изображений с ураном для доставки ингаляционных изофлюрановая (0,5%-3%).
4. Следить за температурой тела и дыхания, используя ректальной температуры зонда, подключенных к компьютеру физиологических записи.
   Примечание: Нормальной температуры тела (36 — 37 ° C) поддерживается с помощью рециркуляции горячей воды цепи, построен в животных держатель MR. Температура измеряется через ректальным датчиком и записанные на физиологические мониторинга компьютера, используя выделенный физиологического мониторинга программного обеспечения. Та же система используется для записи дыхания и ЭКГ сигналов измеряется через пневматические подушки под грудной клетки и через электроды ЭКГ 3-свинца. Дыхание сигнала также используется для запуска приобретения МРТ и уменьшения артефактов, связанных с движением дыхания.

3. МРТ изображения приобретение

1. Используйте катушки тела квадрирования для возбуждения.
2. Место 4-канальный приемник катушки на нижней части живота мыши проверяемых для оптимизированного обнаружения сигналов от региона интерес.
3. Инициируйте автоматической корректировки путем комплексной визуализации программного обеспечения приобрести tri осевой набор изображений тела всей мыши. От этого ссылка набора изображений Определите области интереса (в данном случае, область мочевого пузыря).
4. Приобрести три набора ортогональных нарезанных изображений вдоль аксиальная, фронтальная и сагиттальная плоскости, с использованием радиологических отсчета.
5. Использовать истинный FISP изображений последовательности (включены как одна из функций в комплексной обработки изображений) с указанными ниже параметрами MR: TR = 900 МС, TE = 2 мс, FA = 70, 14 средние.
   Примечание: Этот набор параметров позволяет для быстрой обработки изображений с высоким качеством диагностики, в том числе Утяжеление T1/T2 в < 10 мин на мышь.
6. Пространственное резолюции и кусочек толщиной определяются геометрические параметры, выбранные пользователем через графический интерфейс интегрированной платформы обработки изображений. Это приводит к серии фрагментов через весь пузыря толщиной 0,5 мм с разрешением в плоскости 0,148 мм.

4. г-н анализ изображений

1. Определите набор ломтиками толщиной 0,5 мм и в плоскости резолюции 0,148 мм, охватывающих весь мочевого пузыря.
2. Экспорт программного обеспечения анализ медицинских изображений, выбрав папку с соответствующими изображениями в формате ANALYZE.
3. Выберите «представитель осевой вид» в центре пузыря для количественного анализа, прокрутка изображений, созданных и выявления кусочек на середину мочевого пузыря, который позволяет для визуализации стенки мочевого пузыря и люмен.
   Примечание: Центр срез должен быть выбрали один с большим диаметром.
4. Тщательно разграничить области интереса (ROI) вручную трассировки границ вокруг внешнего края мочевого пузыря (BLA_вне) и внутренний просвет (БЛА_в) мочевого пузыря (см. схема и представительных цифры на рисунке 2) в выбранном представлении представитель осевой.
5. Вычтите внутренний просвет от внешнего края к вычислить площадь поверхности стенки мочевого пузыря.
   БЛА_стены = бла_вне - бла_в
   Примечание: Площадь поверхности мочевого пузыря управления с не опухоль, как ожидается, будет меньше, чем с опухоли мочевого пузыря.

5. эвтаназии и вскрытия мочевого пузыря

1. После 20 недель BBN воздействия усыпить мышей с использованием стандартных оперативных процедур в соответствии с местными IACUC руководящие принципы.
2. Чистота области разреза с 70% этанола, а затем понять и снять кожу брюшной стенки с щипцами.
3. Сделайте срединной линии разреза от лобковой симфиза до мечевидного отростка.
4. Резко надрезать брюшной полости, схватив с щипцами и промо с ножницами.
5. Определите пузырь, который расположен в средней линии нижней части живота.
6. Выявить и сократить средний пупочной связки, соединяющий купол мочевого пузыря в пупок и брюшной стенки.
7. Захватите купол мочевого пузыря с щипцами для обеспечения countertraction и вскрыть мочевого пузыря от окружающих структур, включая семенные пузырьки, прямой кишки и жира.
8. Идентифицировать мочеточников, мочевого пузыря ввода и резать с ножницами недалеко от мочевого пузыря.
9. Подъема пузыря краниально, вырезать уретры с ножницами и удаление мочевого пузыря.
10. Сразу же весят мочевого пузыря после промывки с PBS.

6. гистологическое обследование ткани мочевого пузыря

1. Исправьте ткани мочевого пузыря в нейтральных буферизации формалина 10% для 36-48 ч при комнатной температуре (RT).
2. Внедрить в блоков парафина ткани, вырезать слайды для последующего изучения и выведение слайды с гематоксилином и эозином для микроскопического исследования как описано ранее,^19,20.
3. Выполните микроскопическое исследование мочевого пузыря мыши на низком уровне (2,5 x и 10 x) и высокой (20 x и 40 x) увеличений, изучению макроскопических поражений, гиперплазия, рак на месте, папиллом, папиллярных опухолей и инвазивных новообразования^{19 , 21}.

Используя протокол описал (рис. 1), опухоли мочевого пузыря были наведены в самцов мышей C57/B6. МРТ была исполнена на 16 недель, и мышей были умерщвлены в 20 недель. Ex vivo мочевого пузыря весов (BW) для каждой мыши были записаны. Слайды окрашивали гематоксилином и эозином, а все гистология слайды были рассмотрены на стадии опухоли.

Чтобы проанализировать бремя опухоли с помощью MR, стены внутренний просвет мочевого пузыря (БЛАв) был вычитается из мочевого пузыря стены внешние люмен (BLA,) для расчета толщины стенок мочевого пузыря (BLAстены) (Рисунок 2). Представитель истинный FISP MR изображения, реконструкций 3-D стене мочевого пузыря и патологические образы мышь управления (то есть, не опухоль) отображаются в рисунке 3A-F и мышь с большой опухоли показано на рисунке 3 g-L.

МРТ производный параметр бластены слабо коррелирует с ex vivo BW (rs = 0,37, p = 0,009; Рисунок 4). Анализ МРТ производные бластены параметра и BW данных демонстрирует связь с стадии опухоли (Крускала-Уоллиса теста МРТ p = 0.0003, Рисунок 5A; BW p = 0.0006; Рисунок 5B), а также ассоциации при стратификации патологии мышц неинвазивная мочевого пузыря рак и рак мочевого пузыря мышц инвазивные (U Манна-Уитни теста МРТ p = 0.0002, рис. 5 c; BW p < 0,0001, Рисунок 5 d). Производительность бластены и BW для определения рака мочевого пузыря мышц инвазивных показан на рисунке 5E. Площадь под кривой (AUC) для БЛАстены (AUC = 0,81, 95% ДИ 0,68-093) статистически похож на АУК BW (AUC = 0,89, 95% ДИ от 0,80-0,98; p = 0,30).

Рисунок 1: схема для индукции опухоли мочевого пузыря с BBN и сроков МРТ и эвтаназии. BBN — управляемые ad libitum в концентрации 0,05% в питьевой воде. Мышей пройти МРТ в 16 недель. Мышей умерщвлены в 20 недель и емкостей для каждого рассматриваются с иммуногистохимия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Схематически графического метода для получения бластены и представитель г-н изображение с соответствующими контуры. С помощью интенсивности МРТ изображения, была определена наружной стенки мочевого пузыря и наброски было обращено в красном (BLAвне). Hyperintense просвет пузыря было изложено в Грин (БЛАв), и соответствующую область просвет пузыря был получен. Вычитание из этих двух величин принесли бластены параметр, который соответствует светло серый диска в графическом изображении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: представитель истинный FISP MR изображения, реконструкций 3-D стене мочевого пузыря и патологические образы мышь управления (то есть, не опухоль) (A-F) и мышь с большой опухоли (G-L). (A) представитель г-н изображение мыши не опухоли. (B) сегментации площадь стен мочевого пузыря (BLAстены), изложенные в красном, определяется как район между мочевого пузыря люмен (БЛАв) и стена внешняя мочевого пузыря (BLAвне). (C) 3-D визуализации стенки мочевого пузыря от управления мышью, генерируемые определения бластены на каждый ломтик через мочевого пузыря. Зеленые стрелки иллюстрируют мочевого пузыря на изображения 2-D, переведено на 3-D визуализации. (D) 3-D визуализации вырез бластены от управления мышью. (E) малой мощности (2,5 x) и (F) высокой мощности (10 x) изображения же мыши мочевого пузыря. (G) представитель г-н изображение мышью с большой опухоли. (H) сегментации площадь стен мочевого пузыря (BLAстены), изложенные в красном, определяется как район между мочевого пузыря люмен (БЛАв) и стена внешняя мочевого пузыря (BLAвне). (I) 3-D визуализации стенки мочевого пузыря мыши с большой опухоли. (J) 3-D визуализации вырез пузыря мышь с большой опухоли, создается путем определения бластены на каждый ломтик через мочевого пузыря. Зеленые стрелки иллюстрируют мочевого пузыря на изображения 2-D, переведено на 3-D визуализации. (K) малой мощности (2,5 x) и (L) высокой мощности (10 x) изображения же пузыря мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Спирмена корреляции между МРТ производные бластены и вес окончательной пузыря. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Сравнение патологической стадии и МРТ производный параметр бластены в 47 мышей. (A) сравнение всех патологических этапов и МРТ BLAстены (Крускала-Уоллиса). (B) сравнение всех патологических этапов и вес мочевого пузыря (Крускала-Уоллиса). (C) сравнение неинвазивные мышцы мочевого пузыря рак (этап ≤T1) и неинвазивного мышц мочевого пузыря рак (этап ≥T2) с МРТ BLAстены (тест U Манна-Уитни). (D) сравнение неинвазивные мышцы мочевого пузыря рак (этап ≤T1) и неинвазивного мышц мочевого пузыря рак (этап ≥T2) с весом мочевого пузыря (тест U Манна-Уитни). (E) ROC кривой МРТ производные bladder области и вес окончательной мочевого пузыря в определении неинвазивного мышц мочевого пузыря рак (этап ≥T2). Перечисленных p-значение разницы между двумя AUCs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.