Методическая статья

Флуоресцентная визуализация Манго помечены РНК в полиакриламида гели с помощью пост-стоиносидный метод

DOI:

10.3791/59112

⸱

21 июня 2019 г.

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем чувствительный, быстрый и дискриминационный пост-гель окрашивая метод изображения РНК помечены РНК Манго aptamers I, II, III, или IV, используя либо родной или денатурирующий полиакриламид гель электрофорез (PAGE) гели. После запуска стандартных гелей PAGE, Манго помечены РНК может быть легко окрашены с TO1-Biotin, а затем проанализированы с помощью широко доступных читателей флуоресценции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Родные и денатурные гели полиакриламидов обычно используются для характеристики подвижности рибонуклеопротеина (РНП) и для измерения размера РНК, соответственно. Как и многие методы гель-изображения использовать неспецифические пятна или дорогие фторроновые зонды, чувствительные, дискриминационные, и экономичный гель-изображений методологии являются весьма желательными. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОсти ядра RNA Mango являются небольшими (19-22 nt) мотивами последовательности, которые, при закрытии произвольного стебля РНК, могут быть просто и недорого приложены к РНК интереса. Эти теги манго связываются с высокой близостью и специфичностью к тиазол-оранжевому флюорофору лиганду под названием TO1-Biotin, который становится в тысячи раз более флуоресцентным при связывании. Здесь мы показываем, что Манго I, II, III и IV могут быть использованы специально для изображения РНК в гели с высокой чувствительностью. Всего лишь 62,5 моль РНК в родных гелей и 125 моль РНК в денатурирующих гелей может быть обнаружена путем замачивания гелей в буфере изображения, содержащем калий и 20 нМ TO1-Биотина в течение 30 мин. Мы демонстрируем специфику манго-тегами системы путем визуализации манго помечены 6S бактериальной РНК в контексте сложной смеси общей бактериальной РНК.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Манго представляет собой РНК пометки система, состоящая из набора из четырех небольших флуоресцентных РНК aptamers, которые связывают плотно (наномолярной связывания) к простым производным тиазол-оранжевый (TO1-Биотин, Рисунок 1A)1,2,3 . При связке флуоресценция этого лиганда увеличивается в 1000-4000 раз в зависимости от конкретного аптамера. Высокая яркость системы манго, которая для Манго III превышает уровень улучшенного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), в сочетании с наномолярной связывающей сродством аптамеров РНК Манго, позволяет использовать ее как при визуализации, так и в очищении РНК комплексы2,4.

Рентгеновские структуры МангоI5, II6и III7 были определены с высоким разрешением, и все три аптамеров использовать РНК четырехугольник, чтобы связать TO1-Biotin (Рисунок 1B-D). Компактные ядра всех трех аптамеров изолированы от внешней последовательности РНК с помощью компактных адаптеров. Манго I и II оба используют гибкий GNRA-как петля адаптер для подключения их ядер манго к произвольной РНК дуплекс(Рисунок 1B, C). В отличие от этого, Mango III использует жесткий мотив триплекса, чтобы соединить его ядро с произвольной спиралью РНК(рисунок 1D,фиолетовые остатки), в то время как структура Манго IV в настоящее время не известна. Как лиганд-связывающее ядро каждого из этих aptamers отделен от внешней последовательности РНК этими сугнительными адаптерами, кажется вероятным, что все они могут быть просто включены в различные РНК. Бактериальная 6S регулятивная РНК (Манго I), компоненты дрожжевой spliceosome (Манго I), и человека 5S РНК, U6 РНК, и C / D scaRNA (Манго II и IV) все были успешно помечены таким образом2,8, предполагая, что многие многие биологические РНК могут быть помечены с помощью системы РНК Манго aptamer.

Денатуринг и местные гели обычно используются для изучения РНК. Денатуринг гели часто используются для судить размер РНК или РНК обработки, но, как правило, в случае северной пятно, например, требуют нескольких медленных и последовательных шагов для того, чтобы создать изображение. В то время как другие РНК фторгенных аптамеров, таких как РНК шпинат и брокколи, были успешно использованы для геля изображения9, не фторгенной аптамера системы на сегодняшний день не обладает высокой яркостью и сродством системы манго, что делает его значительный интерес для изучения манго гель-изображения способностей. В этом исследовании мы задавались вопросом, может ли система RNA Mango быть просто расширена до геля, так как возбуждение и длина волн выбросов TO1-Biotin (510 нм и 535 нм, соответственно) подходят для визуализации в канале eGFP, обычном для большинства флуоресцентных гелевосканно-сканирующие приборы.

Пост-гель окрашивания протокол, представленный здесь обеспечивает быстрый способ конкретно обнаружить Манго помечены молекулРНЫ в родной и denaturing полиакриламид гель электрофорез (PAGE) гели. Этот метод окрашивания включает в себя замачивания гелей в буфере, содержащем калий и TO1-Biotin. РНК Манго aptamers являются G-четверки основе и калий требуется для стабилизации таких структур. Используя РНК, транскрибированные из минимальных мангокодирующих шаблонов ДНК (см. раздел протокола), мы можем просто обнаружить всего лишь 62,5 фмоль РНК в местных гелей и 125 фмоль РНК в денатурации гелей, используя простой протокол окринирования. В отличие от обычных неспецифических ядерных кислотных пятен (см. ТаблицаМатериалов, упомянутых в SG от hereon), мы можем четко определить Манго помечены РНК, даже если высокие концентрации общего untagged РНК присутствуют в образце.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка реагентов

  1. To1-Biotin постстогиврешение решение (гель окрашивающий раствор)
    1. Сделать 1 L 1 M фосфатного буфера на рН 7,2 на 25 градусов по Цельсию, добавив 342 мл 1 М Na2HPO4 и 158 мл 1 M2PO4. Отрегулируйте рН до 7,2 при 50 мМ, добавив соответствующий фосфатный раствор. Стерильный фильтр с помощью фильтра 0,2 мкм и храните раствор в пластичной посуде при комнатной температуре.
    2. Приготовьте 5x гель окрашивающий раствор (без TO1-Biotin) следующим образом. Составьте 1 л раствора, смешивая 247,5 мл ddH2O, 700 мл 1 M KCl, 50 мл 1 M фосфатного буфера (pH 7.2), и 2,5 мл Tween 20. Стерильный фильтр с помощью фильтра 0,2 мкм и храните раствор в пластичной посуде. Его можно хранить при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MgCl2 может быть добавлен к этому решению, если требуется, поскольку это потенциально может стабилизировать комплексы РНК. Это будет иметь скромное влияние на флуоресцентный сигнал2.
    3. Составьте раствор окрашивания геля 1x, используя раствор окрашивания 5x геля от шага 1.1.2 и, непосредственно перед использованием, дополните его фторофором TO1-Biotin (см. Таблицаматериалов) до конечной концентрации 20 нм. Например, добавьте 20 мл 5-х гельостого окрашивающего раствора в 80 мл деионизированной воды, чтобы сделать 100 мл раствора окрашивания геля 1x, и добавьте 2 мл 1 мМ TO1-Biotin (подготовленв в диметилформамиде).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент вымирания для красителя TO1-Biotin на 500 нм составляет 63 000 М-1см-1, измеренный в растворе окрашивания1.
  2. Denaturing PAGE (2x denaturing гель погрузочный раствор и решения A, B, C, персульфат аммония, и тетраметилэтилениамин)
    1. Приготовьте 50 мл раствора загрузки геля 2x denaturing путем смешивания 40 мл формамида, 0,5 мл 0,5 М этиленденедиаминететраацетической кислоты (EDTA, pH 8.0) и 9,5 мл ddH2O. Раствор можно хранить при комнатной температуре. Загрузка красителей не добавляются к этому решению, так как это может скрыть флуоресцентную визуализацию.
    2. Подготовка 2x denaturing гель загрузки красителя следующим образом. При очистке РНК и ДНК-олигонуклеотидов добавьте 0,5 мл 2,5% (w/v) бромофенол синего (BB) и 0,5 мл 2,5% (w/v) цианола ксилена (XC) к раствору, описанного в шаге 1.2.1, и добавьте 8,5 мл ддГ2вместо 9,5 л. Раствор можно хранить при комнатной температуре.
    3. Приготовьте 100 мл раствора А, взвесив 200,2 г мочевины (вес формулы: 60,06 г/моль) и добавив его к 312,5 мл 40% 19:1 акриламид:N, N'-метиленебисацилимид. Перемешать его с магнитной панели перемешать на максимальной скорости до растворения (около 3 ч) и составить раствор до 500 мл с помощью ddH2O. Обратите внимание, что конечные концентрации 6,667 М мочевины и 25% 19:1 акриламид:N,N'-methylenebisacrylamide. Хранить при 4 градусах по цельсию в чистой пластмассовой посуде.
    4. Приготовьте 1 л раствора B, взвесив 400,4 г мочевины и составьте раствор до 1 л с ddH2O; перемешать, пока мочевина не растворится. Раствор B можно хранить при комнатной температуре.
    5. Подготовьте решение C (10x Tris-borate-EDTA) следующим образом. Приготовьте 4 л из 10x TBE, взвесив 432 г базы Tris и 220 г борной кислоты, добавив 160 мл 0,5 М EDTA с рН 8 (фильтрованным), и соизучив решение до 4 Л с ddH2O. Большой запас этого буфера производится, так как он также используется в качестве буфера для бега геля.
    6. Подготовка 10% аммония persulfate (APS) путем растворения 1 г APS в общий объем 10 мл ddH2O. Хранить при 4 кС.
    7. Держите тетраметилетилендиамин (TEMED) под рукой. Храните его при 4 градусах По Цельсию вместе с решением APS.
  3. Родной PAGE (2x родной гель погрузки решение)
    1. Приготовьте 50 мл раствора загрузки 2x native gel, смешивая 25 мл 100% глицерола, 10 мл раствора окрашивания геля 5x и 15 мл ddH2O, чтобы составить раствор до 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в разделе денатурного геля, погрузочные красители могут быть добавлены к этому запасу, но их добавление может потенциально скрыть флуоресцентный сигнал в геле и, таким образом, следует избегать.

2. Приготовление и загрузка гелей для денатурирования

  1. Подготовка денатурный гель с соответствующим процентом, следуя таблице 1. Рассмотрим конкретную систему литья геля; 30 мл гели широко используются. Соответствующий процент геля можно оценить с помощью таблицы 2: выберите процент полиакриламидов, где красители BB и XC имеют подвижность быстрее и медленнее, соответственно, чем РНК интереса, чтобы обеспечить высокодиапазонное разделение в соответствующем размере Диапазон.
  2. Смешайте решения A, B и C в соответствии с таблицей 1 и добавьте APS и TEMED непосредственно перед заливкой геля. Хорошо смешайте растворы в чистой пластичной посуде.
  3. Налейте раствор геля в соответствующий гель литья аппарата, после обеспечения того, чтобы все компоненты скрупулезно чистыми. Поднимите одну сторону аппарата так, чтобы гель слегка наклонен при заливке, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в ловушку внутри самого геля.
  4. Вставьте нужный гребень и оставьте ее полимеризировать (примерно 30 мин). Обратите внимание на полимеризацию, внимательно глядя на изменение индекса преломления вокруг гель скважин. Составьте гель бак с помощью 1x раствор C (1x TBE) и тщательно удалить гребень. Используя шприц, аспирируйте скважины непосредственно перед загрузкой образца.
  5. Подготовьте образцы денатурирования следующим образом. Добавьте 2x денатурный гель погрузочный раствор в ОБРАЗЦы РНК интерес, чтобы сделать денатурный гель погрузки решение 1x и теплоденатуры при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут с помощью термоциклоза или водяной ванны.
  6. Перед загрузкой образцов, воздух охладить их несколько минут, пока они не остынет на ощупь. Загрузите образцы, накладывая их на дно каждой скважины, используя гель-загрузку советы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Круглые наконечники могут быть использованы для гелей толщиной 1 мм или более; использовать плоские советы для тонких гелей.
  7. Запустите гели для денатурирования при комнатной температуре. Убедитесь, что мощность достаточно низкая, чтобы стеклянные пластины системы геля не трескаются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории для этой цели было достаточно 28 Вт на 20 см х 16 см пластин.

3. Подготовка и загрузка отечественных гелей

  1. Подготовка родной гель с соответствующим процентом, ссылаясь на таблицу 3. Рассмотрим конкретную систему литья геля, но имейте в виду, что 30 мл гели обычно используются. Смешайте растворы 1x TBE, 40% 29:1 акриламид:N,N'-methylenebisacrylamide, и глицерол в соответствии с таблицей 3, и добавить APS и TEMED непосредственно перед заливкой гель. Продолжить, как описано в шагах 2.3 и 2.4.
  2. Подготовка местных образцов, добавив 2x родной гель погрузки решение ДЛЯ РНК образцов интерес, чтобы сделать решение 1x и позволить ему инкубировать при комнатной температуре в течение 100 минут до запуска геля для обеспечения полного сворачивания РНК.
  3. Запустите родной гель в холодной комнате 4 градуса, гарантируя, что мощность достаточно низкая, чтобы не нагревать гель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории для этой цели было достаточно 14 Вт на 20 см х 16 см пластин.

4. Подготовка РНК путем транскрипции Стока T7

ПРИМЕЧАНИЕ: последовательности ДНК, используемые для стыковки10 конструкций РНК Манго были заказаны коммерчески. В этом методе, ДНК олигонуклеотиды, содержащие обратное дополнение (RC) как последовательность, которая будет транскрибирована и T7 промоутер гибридизированы в T7 промоутер верхней нити последовательности, а затем транскрибируется в пробирке. Ниже, для каждого олигонуклеотида, RC из манго основной последовательности показано жирным шрифтом и RC региона промоутер T7 показано курсивом. Остатки в обычном шрифте соответствуют произвольным дополнительным сечениям, необходимым для правильного сложения ядра манго.

Манго I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT CGT AGC TGC CTa TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Манго II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCT TCT CCT CGT AGC TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Манго III: GGC ACG TAC GAA TAT АКК АКА TAC CAA TCC TTC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Манго IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC АКК АКСТ CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT GAG TCG TAT TAA AG
T7 Top Strand: CTT TAA TAC GAC TCA CTA TAG G

  1. Препаративная гель очистка ДНК олигонуклеотидов
    1. Для синтеза ДНК в 0,2 моль-масштабе, resuspend deprotected ДНК олигонуклеотида в 100 л ddH2O и 100 л 2x денатурации погрузочной красителя (от шага 1.2.2). В этом случае предпочтительнее, в ключая гель-загрузку красителей в погрузочном растворе в той же концентрации, что и в шаге 1.2.2.
    2. Очистите ДНК олигонуклеотида с помощью 50 мл предварительной шкалы денатурации геля соответствующего процента полиакриламидов; использовать таблицу 2, чтобы выбрать процент геля. Например, используйте 8% гель для последовательности 50 nt. В идеале, бромофенол синий должен работать быстрее, чем олигонуклеотид, и цианол ксилена должен работать медленнее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории такие гели были отлиты с использованием литья прокладки толщиной 1,5 мм и гель-загрузки гребень с колодцами, которые были 2-2,5 см в ширину.
    3. Нагрузка 100 л ДНК олигонуклеотидов растворов, подготовленных в шаге 4.1.2 за preparative гель хорошо, как описано в шагах 2.4-2.7.
    4. Тщательно высушите внешнюю сторону геля, снимите стеклянные пластины и накройте обе стороны геля полиэтиленовой пленкой. Поместите его на флуоресцентный экран изображения (алюминиевые тонкослойные плиты хроматографии, пропитанные флюорофором, являются экономичным решением) и используйте коротковолжутную УФ-ручную лампу для визуализации полос ДНК с помощью УФ-тени.
    5. Хрустящая, четко определенная тень должна наблюдаться, если синтез ДНК имеет высокое качество. Отметьте полосы на полиэтиленовой пленке, используя перманентный маркер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите кожу и глаза от ультрафиолетового света и держите экспозицию короткой, чтобы избежать повреждения образца нуклеиновой кислоты.
    6. Разместив гель на чистой стеклянной пластине, аккуратно вырежьте отмеченные полосы и поместите каждый гель фрагмент в 400 л 300 мм NaCl. Утилист ДНК на ночь, используя ротатор при комнатной температуре.
    7. Восстановить eluent в чистой центрифуге трубки и добавить 2,5 эквивалента этанола, чтобы осадок ДНК. Вихрь хорошо и поместите трубку на -20 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
    8. Пеллет образца в скамейке верхней центрифуги на 156000 х г в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия. Тщательно удалите супернатант и отдохните гранулы в ddH2O. Используйте спектрофотометр для точного определения концентрации олигонуклеотида ДНК. Храните образец в качестве запаса 10 мкм для удобства при -20 градусов по Цельсию.
  2. Стоковая транскрипция и очистка геля образцов РНК
    1. Подготовка 5x нуклеозидный трифосфат (NTP) запас путем смешивания жидких запасов NTP, состоящий из окончательной концентрации 40 мм гуанозин трифосфат (GTP, 11,400 M-1см-1), 25 мм цитидин трифосфат (CTP, 7600 М-1см-1), 25 мм аденозин трифосфат (АТФ, 5000 М-1см-1)и 10 мМ трифосфат аденозин (UTP, 10 000 М-1см-1); все коэффициенты вымирания на уровне 260 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы жидкости или порошка могут быть получены на коммерческой уровне. При приготовлении первичных запасов из порошка, тщательно настроить рН до окончательного рН 7,9, используя 1 M NaOH. Aliquot акции в 1,5 мл микроцентрифуговых труб и хранить его при -20 градусов по Цельсию.
    2. Приготовьте 100 мл буферного запаса 10x T7, смешивая 25,6 мл 1 М Трис-HCl, 14,4 мл 1 M Tris базы, 26 мл 1 M MgCl2, 10 мл 10% Triton X-100, и 0,637 г спермидина. Составьте запас до окончательного объема 100 мл, добавив ddH2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный рН 7,9 из 1x решение должно быть подтверждено с помощью калиброванных рН метр. 10x должен быть стерильным фильтром и храниться при -20 градусов по Цельсию в подходящих размерах aliquots.
    3. Выполните транскрипцию следующим образом.
      1. Добавьте следующие реагенты, чтобы составить окончательную концентрацию буфера транскрипции 1x T7, используя 10x T7 транскрипционный буферный запас и ddH2O (от шага 4.2.2), 1x NTPs, 10 mM дитиотрейтол (DTT), 1 мКМ T7 Верхняя последовательность нити (см. раздел 4 Примечание для последовательность), 1 мкм гель-очищенной последовательности ДНК манго (шаг 2.1), и T7 РНК-полимераза фермента (1 U / Зл).
      2. Вихрь, спина вниз, и инкубировать раствор при 37 градусов по Цельсию в течение 2 ч или пока он не станет облачным и белый осадок формы в нижней части трубки. Транскрипция 50 л должна привести к тому, что после очистки геля будет 50 qL РНК в размере 50 км. Добавьте равный объем 2x денатурации красителя и хранить его при -20 градусов до готовности для очистки геля.
    4. Гель очищает полученную РНК, как описано в разделе очистки геля ДНК олигонуклеотидов, следуя шагам 4.1.2.u20124.1.8, заменяя образец РНК на ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: РНК чрезвычайно чувствительна к деградации RNase, поэтому убедитесь, что во всех шагах, перчатки и чистый лабораторный слой носят в любое время. Убедитесь, что все образцы готовятся и хранятся в одноразовой пластмассовой посуде для защиты от загрязнения RNase, и мыть стеклянные пластины тщательно с горячим мылом и водой перед использованием, промыть их тщательно с ddH2O, и высушить стеклянную посуду с помощь этанола применяется из бутылки сжатия.
    5. Используйте 1 кВ конечного образца РНК и, используя спектрофотометр на основе капель, определите абсорбцию на уровне 260 нм. Используя коэффициент вымирания, определяемый методом ближайшего соседа, вычислите концентрацию РНК и отрегулируйте концентрацию образца до 10 мкм с ddH2O для удобства. Храните образцы РНК при -20 градусов по Цельсию.
  3. Эшеричия палочка полная добыча сырой нуклеиновой кислоты
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол является примером. Этот протокол использует эндогенно выраженный Манго I помечены 6S РНК от плазмиды в кишечной палочке, и индукции из этой плазмиды описывается в другом месте подробно4.
    1. Для целей данного исследования, подготовить 500 мл индуцированных клеток для pEcoli-РНК Манго и pEcoli-T1 плазмиды (клетки индуцируются на OD600nm 1). Пеллет клетки и хранить их при -80 градусах Цельсия до использования.
    2. Выполните экстракцию РНК следующим образом.
      1. Возьмите 0,5 мл индуцированной плокольной клеточной гранулы и добавьте 500 л эквилибристого фенола. Затем, вихрь образца; раствор станет молочно-белым. Центрифуга на максимальной скорости в течение 2 мин, чтобы отделить слои.
      2. Извлеките верхний слой, который будет слегка желтым, и повторите шаг 4.3.2.1, добавив равный объем фенола, центрифугирования и извлечения в общей сложности 5x (или до тех пор, пока средний слой, который непрозрачный белый, уходит, и только два ясных слоя остаются).
      3. Добавьте фенол-извлеченный вакоозный объем в равный объем хлороформа, вихря, а затем центрифугу с максимальной скоростью в течение 2 мин.
      4. Извлеките свочный слой и добавьте NaCl к конечной концентрации 300 мМ. Осажгите полученную нуклеиловую кислоту добавлением 2,5 эквивалентов этанола, вихря, спин-дауна и осаждается при -20 градусов по Цельсию в течение не менее 30 мин.
      5. Пеллет в скамейке верхней центрифуги на 15,6 х 1000 х г при 4 кв кв в течение 30 мин. Тщательно удалить супернатант и resuspend гранулы в 100 зл от ddH2O.
      6. Добавить DNase I пищеварения шаг к этой процедуре, после ссылки протокол11, чтобы получить общую РНК.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вихрь энергично, пока гранулы полностью растворяется в ddH2O.

5. Пост-гель окрашивания

  1. Подготовка 1x гель окрашивая решение в соответствии с рецептом в шаге 1.1.3 и добавить его в чистый стеклянный контейнер, который достаточно широк, чтобы удобно соответствовать гель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Borosilicate стеклянные контейнеры с оснастки подходят крышки служат этой цели хорошо.
  2. Добавьте в контейнер достаточно ежегельное окрашивающее раствор, чтобы гель был полностью покрыт раствором, а жидкие разгильдяи поверх геля помещались на орбитальный ротатор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контейнер должен быть достаточно большим, чтобы соответствовать гель так, что он может передвигаться и иметь достаточно буфера в контейнере, чтобы полностью покрыть гель.
  3. После того, как родной или денатурируя гель закончил работать (раздел 2 или 3, соответственно), снимите гель из аппарата и отрежьте его колодцы. Это может быть полезно, чтобы удалить угол геля для ориентации позже в анализе.
  4. Аккуратно перенесите гель на раствор окрашивания геля 1x, приготовленный в шаге 5.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гели хрупкие и склонны к нарушению так что будьте осторожны при передаче геля. Держите крышку на окрашивая контейнер во все времена, чтобы не загрязнять гель.
  5. Поместите гель на орбитальный ротатор со скоростью 100 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что гель не складывается обратно на себя; в противном случае, РНК может рассеиваться из геля и так этикетке другой части геля.

6. Изображение Манго помечены РНК в гель

  1. Тщательно декантируйте буфер изображения. Промыть гель быстро с водой, обеспечивая достаточно жидкости остается держать гель слегка мобильным в контейнере.
  2. Аккуратно перенесите гель на изображение. Передача, тщательно поднимая стороны геля и поместив его на лоток изображения; в качестве альтернативы, гель можно медленно налить на лоток. Убедитесь, что под гелем нет пузырьков и нет лишней жидкости под гелем. Пипетка проката над гель может быть полезно, чтобы удалить излишки жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте бумажное полотенце, чтобы впитать лишнюю жидкость.
  3. Возьмите изображение геля, наблюдая флуоресценцию между волной возбуждения 510 нм и длиной волны излучения 535 нм (например, зеленый свет при настройках флуоресценции длины волны 520 нм на изображении). Убедитесь, что настройки полностью оптимизированы на инструменте и тщательно следуйте инструкциям для используемого инструмента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Короткие Манго помечены РНК были подготовлены, как описано в разделе протокола. Предполагая, что флуоресценция в условиях денатурации будет наиболее трудно наблюдать из-за присутствия мочевины в гелях, мы впервые изучили устойчивость манго аптамеров к мочевину, которая действует как нуклеиновая кислота денатурант. Мы обнаружили, что Манго aptamers существенно устойчивы к денатурации до концентрации мочевины примерно 1 М (Рисунок 2A). До добавления гель окрашивая раствор д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существенным преимуществом флуоресцентного тега Mango является то, что один тег может быть использован несколькими способами. Высокая яркость и сродство этих aptamers сделать их полезными не только в визуализации клеток 2, но и для in vitro РНК или RNP очистки4. Таким образом, гель изображения расширяет универсальность тега Манго в простой способ. Манго гель изображения чувствительность немного меньше, чем у северной пятно14, но может легко обнаружит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На фторгенной системе Манго находится на рассмотрении.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Развана Кожокару и Амира Абдолахзаде за техническую помощь и Лену Долгошеину за коррективную прочтение рукописи. Финансирование этого проекта было предоставлено Канадским советом по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) в рамках оперативного гранта P.J.U.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Гребень толщиной 0,8 мм 14 лунок для 30 мл PAGE гелейLabRepCo11956042
101-1000 &; Л  советыФишер02-707-511
20-200 & микро; L низкое удержание  советыFisher Scientific02-717-143
Акриламид: N,N'-метиленбисакриламид (40% 19:1)БиореагентыBP1406-1Острая токсичность
Акриламид: N,N'-метиленбисакриламид (40% 29:1)ФишерBP1408-1Острая токсичность
АгарАнахимия02116-380
Алюминиевая подложка TLCSigma-Aldrich
Amersham Imager 600GE Healthcare Lifesciences29083461
Персульфат аммонияBiorad161-0700Вредные
клетки BL21NEBC2527H
Борная кислотаACPB-2940
Бромфенол Синяя натриевая сольSigmaB8026-25G
ХлоформACPC3300
ДитиотреитолСигма Олдрич СпиртыD0632-5G
ДНКаза IThermoFisherEN0525
ЭДТА Динатриевая сольACPE-4320
Этанолкоммерческий 
Плоские гелевые насадки для загрузкиCostarCS004854
Формамид 99%Alfa Aesar A11076
Набор гелевых аппаратов с прокладками и гребнямиLabRepCo41077017
Стеклянная тарелка с пластиковой крышкойPyrex1122963Должна быть достаточно большой, чтобы поместиться ваша гелевая деталь
ГлицеринАнахимия43567-540
HClAnachemia464140468
ImageQuanTLGE Healthcare Lifesciences29000605
IPTGInvitrogen15529-019
KClACPP-2940
MgCl2Caledron4903-01
MgSO4Sigma-AldrichM3409
NaClACPS-2830
NaOHBDHBDH9292
Орбитальный ротаторLab-Line
ФенолИнвитроген15513-039
Круглые гели НасадкиКостарCS004853
Натрия Фосфат двухосновнойКаледрон8120-1
Натрий Фосфат ОдноосновнойКаледрон8180-01
SYBRGoldThermoFisherS11494
T7 РНК-полимеразаABME041
TEMEDSigma-AldrichT7024-50 мл
TO1-3PEG-биотин флуорофорABMG955
Tris BaseFisherBP152-500
ТриптонФишераBP1421-500
Tween-20SigmaP9496-100
МочевинаFisherU15-3
Ксилол цианолSigmaX4126-10G
Дрожжевой экстрактBioshopYEX401.500
1164840001P016EAAN

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
  2. Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656(2018).
  3. Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
  4. Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
  5. Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807(2017).
  6. Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
  7. Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
  8. Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
  9. Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
  10. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  11. A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
  13. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
  14. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
  15. Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TO1

Похожие статьи