Здесь мы представляем подробный протокол для обнаружения и количественной оценки уровня белка во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза путем иммуносохранения с помощью мыши черепно-лицевой ткани в качестве примеров. Кроме того, мы описываем метод приготовления и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей у молодых мышей для иммунодефицита.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ткань Подготовка и иммуностоирование мыши Craniofacial тканей и недекализированных костей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ткань иммуностоинга обеспечивает высокоспецифическое и надежное обнаружение белков, представляющих интерес в данной ткани. Здесь мы описываем полный и простой протокол для обнаружения экспрессии белка во время черепно-мозгового морфогенеза/ патогенеза с использованием мышичерепных тканей в качестве примеров. Протокол состоит из подготовки и криоотделения тканей, косвенной иммунофлуоресценции, приобретения изображения и количественной оценки. Кроме того, описан метод подготовки и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей для иммуностоинга, в качестве примеров используется черепно-мозговая ткани и длинные кости. Эти методы являются ключевыми для определения экспрессии белка и морфологических / анатомических изменений в различных тканях во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза. Они также применимы к другим тканям с соответствующими изменениями. Знание гистологии и высокое качество разделов имеют решающее значение для того, чтобы сделать научные выводы из экспериментальных результатов. Потенциальные ограничения этой методологии включают, но не ограничиваются спецификой антител и трудностями количественной оценки, которые также обсуждаются здесь.
Введение
Лицо является ключевой частью человеческой идентичности, и состоит из нескольких различных типов тканей, таких как эпителий, мышцы, кости, хрящи, зуб. Эти ткани являются производными от всех трех слоев зародыша: эктодерм, эндодерм, и мезодерм1,2. Для правильного узорства и развития черепно-мозговых тканей, пролиферации клеток, смерти и дифференциации должны быть высоко скоординированы и регулируются конкретными сигнальными путями, такими как Wnt, Fgf, Hh и Bmp пути3,4 ,5. Дефекты пролиферации, выживания или дифференц....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты с мышью проводились в соответствии с руководящими принципами Мичиганского университета, охватывающими гуманный уход и использование животных в исследованиях. Все процедуры для животных, используемые в этом исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) при Мичиганском университете (Протокол #PRO00007715).
1. Подготовка тканей
-
Подготовка эмбриональных тканей
- Приготовьте одну тарелку 10 см и несколько 3,5 см блюд, содержащих фосфат буферный солен (PBS), и одну 12-колодую культурную тарелку, содержащую 2 мл 4% параформальдегида (PFA) в....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эмбриональные участки черепно-мозговой ткани
После вышеуказанных шагов, головы были расчленены от управления(P0-Cre) или мутант (в обязательно активированный Bmpr1a в нервных клетках гребня, P0-Cre; caBmpr1a) зародышить на зародышевом дне (E) 16.5 или 18.5. После фиксации в 4% PFA для 4 ч, образцы были встроены в OCT и криосекционные коронально. Полученные разделы были immunostained с антителами против pSmad1/5/9 (вниз по течению факторы сигнала BMP) .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы предоставляем подробный протокол для подготовки головы мыши и недекальцифицированных костных тканей, а также криосекции для иммуносточки зрения клеточной пролиферации, клеточной смерти и сигнальных маркеров БМП. Мы также подробно описываем стратегию получения количественных данных с иммунофлуоресцентных изображений. Эти методы могут также применяться к другим тканям с соответствующими изменениями.
Условия подготовки тканей варьируются в зависимости от размера и типа тканей. Фиксация и.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01DE020843 до Y.M.), Международной ассоциацией ФОП (Y.M.), а также грантом от Национального фонда естественных наук Китая (31500788 до J.Y.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Клейкая лента | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit вторичное антитело | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Бычья сыворотка альбумин | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Флуоресцентный микроскоп | Olympus | BX51 | |
| Желатин | Sigma | G1890 | |
| in situ Набор для обнаружения клеточной смерти | Millipore | S7165 | |
| Предметные стекла для микроскопа | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| Соединение ОКТ Fisher | Healthcare | 23-730-571 | |
| Параформальдегид (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 антитело | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 антитело | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| цитрат натрия | Sigma | 1613859 | |
| сахарозы | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
Ссылки
- Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
