Здесь мы представляем два протокола для преобразования растений картофеля. Agrobacterium tumefaciens преобразование приводит к полной трансгенных растений в то время как Agrobacterium rhizogenes производит трансгенных волосатые корни в стрелять дикого типа, который может быть самостоятельной распространенный. Мы затем обнаружить промоутер активность GUS пятнать в преобразованной корни.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes-опосредованной трансформации картофеля и промоутер активность гена суберин путем окрашивания ГАС
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Agrobacterium sp. является одним из наиболее широко используемых методов для получения трансгенных растений, поскольку он имеет возможность передачи и интегрировать свой собственный T-ДНК генома растений. Здесь мы представляем два преобразования систем генетически изменить растений картофеля (Solanum tuberosum). В A. tumefaciens трансформации зараженные листья, трансформированных клеток выбираются и новый полный преобразованные завод генерируется с использованием фитогормонов в 18 недель. A. rhizogenes трансформации стебли зараженных инъекционных бактерии с помощью иглы, новых появившихся преобразованные волосатые корни обнаруживаются с помощью маркера красных флуоресцентных и корни-трансформированных удаляются. В 5-6 недель результатом завод представляет собой совокупность дикого типа стрелять с полностью развитой преобразованные волосатые корнями. Для увеличения биомассы, преобразованные волосатые корни можно подакцизным и распространяются самостоятельно. Мы применяли оба методы трансформации Agrobacterium -опосредованной получить корни, выражая GUS Репортер ген обусловлен промоутера суберин биосинтетических генов. GUS пятная процедуру предоставляется и позволяет ячейки локализации промоутер индукции. В обоих методах корни преобразованные картофеля показал, что окрашивание в suberized эндодермы и exodermis и Кроме того, а. rhizogenes преобразован корни активность GUS GUS был также обнаружен в появление боковых корней. Эти результаты показывают, что а. rhizogenes может быть быстро альтернативных инструментом для изучения генов, которые выражаются в корни.
Введение
Помимо экономических интересов поколение трансгенных растений имеет свою собственную значимость в исследованиях продемонстрировать конечной функции генов и лучше понять физиологии растений и развития. Наиболее широко используемый метод для растений ДНК вставки Agrobacterium-опосредованной трансформации. Agrobacterium tumefaciens способен генерировать Корона галлов в инфицированных тканях многих видов растений под действием его опухоль заставить плазмида (Ti). Плазмида содержит область T-ДНК с набором генов, которые будут интегрированы в генома растений и побудить ткани дифференцировке1,2. Обм....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
A. rhizogenes протокол преобразования был адаптирован и изменения из рога et al.7 и тестирование генотипа был S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Дезирэ). A. tumefaciens преобразования протокола был адаптирован и изменения Банерджи et al.22 и генотипов испытания были S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Дезирэ) и S. tuberosum ssp. andigena. Основные этапы обеих процедур резюмируются в Рисунок 1 и 2, соответственно.
Примечание: На всех этапах процедуры, выполнение переводов в vitro сделат....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Agrobacterium rhizogenes -опосредованной трансформации картофеля
В этой рукописи представлена пошаговая процедура для получения преобразованного корень с A. rhizogenes . На рисунке 1 представлен обзор процедуры, которая вообще занимает около 5-6 недель (от инъекций A. rhizogenes для получения полностью развитых волосатые корни). Затем раст.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В картофеля наиболее распространенной системой для получения стабильной полный трансгенных растений использует преобразование Agrobacterium tumefaciens штаммов, которые требуют органогенеза с помощью экзогенных фитогормонов. Хотя у Agrobacterium на основе протоколов имеет потенциал, чтобы интегрировать вектор не T-ДНК последовательность25, эта методология еще простой и менее дорогой для преобразования растений картофеля. В последние годы интерес к A. rhizogenes-опосредов.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана Ministerio de Innovación y науки (AGL2009-13745, ИПИ Грант для PB), y Ministerio де Economía развитию и ФЕДЕР финансирования (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) и Жиронского университета (доктор Грант SF, и Грант SING11/1). Авторы благодарны доктором Инге Broer (Институт землепользования, университета г. Росток, Росток, Германия) и доктор Salomé Прат (Centro Nacional де биотехнология, Мадрид, Испания) для обеспечения а. rhizogenes и A. tumefaciens деформации, соответственно и доктор Marçal Солер и д-р Анна Plasencia за помощь и поддержку, полученную в инициировании трансформации экспериментов A. rhizogenes (Униве....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Экстракт дрожжей<
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <р>Ацетон | <р>Панреак | <р>1.310.071.21 < | |
| р>Ацетосирингон | <р>Акрос | <>115540050 | |
| <>Аквариумный насос | <>Продак | <р>MP350 | |
| <>Автоклав | Ragpa Strelimatic | ||
| Bacteriological agar | Lab Conda | 1800 | |
| BAP | Duchefa | B0904
| |
| Экстракт говядины | Lab Conda | < p>1700 | |
| Кабинет растениеводства | Nuaire | ||
| Carbenicillin | Duchefa | C0109 | |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 < | |
| p>DMSO | <>Merck | <>1029310161 | |
| <>Ecotron infors | <> < | <>>29378 | |
| этанол | <> Merck | <> 1 009 831 011< чел> | |
| трубка Falcon < | > контрольная техника | <>CFT011500 | |
| <>Феррицианат | <>Сигма < | >101001081 | |
| <>Ферроцианат | <>Сигма | <>100979088 | |
| колба (диаметр 8,06 см и высота 11,3 см) и пластиковая крышка для <эм>ин витро культуры < | >Апигласс | <>реф16 | |
| <>ГА3 | <>Сигма | <>Г7645 | |
| Гамборг Б5 медиа < | >Дючефа | <>Г0210 < | |
| Гельрит | <>Дючефа | < p>G1101 | |
| Glucosa | Sigma < | p>G5767 | |
| Kanamycin | Sigma | K1377 | |
| Leukopor tape | BSN Leukopor | BDF47467 | |
| Lupe | <>Вильд-Хеербругг | <>М420 | |
| <>Магнитный шейкер | <>Агикатик | <>7000243 <> | |
| /> | <>Сигма < | >М2933-25G < | |
| МгSO<суб>4 | Panreac | 131404 | |
| Microscope | Olympus | ||
| центрифуга Minufugue 5415R | Eppendorf | ||
| Murashige and Skoog media | Duchefa | M0254.0050 | |
Na2HPO4 | Panreac | 131679 | |
| NAA | Duchefa < | p>N0903 | |
| NaCl | Panreac | 131659 | |
2PO4 | Sigma | 58282 | |
| NightSea Stereo | SFA Moonting Adapter | ||
| Parafilm | < p>Anorsa | PRFL-001-001 | |
| Peptone | Lab Conda | 1616 | |
| Чашки Петри (90 x 14) | Anorsa | 200200 | |
| pHmetre | Crison | < > | |
| <>Фитотрон | <>Инкоа | <>РФТИ-Р5485 | |
| <>Растительный агар | <>Дючефа | <>рР1001 | |
| <>Рехригератот | <>Либхерр Медлайн | <> < | |
| р>Рифампицин | Duchefa | R0146 | |
| Spectinomycin | Sigma | 59007 < | |
| p>Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Square plates (120 x 120) | Deltalab | < >200204 | |
| <>стрептомицин | <>Сигма | <>S6501 | |
| Сахароза | <>Панреак | <>131621 | |
| <>Хирургические лезвия | <>Сванн-Мортон | <>201 | |
| Хирургическая игла | <>НИПРО | <>015/0204 | |
| <>Триптон | <>Лаб Конда | <>1612 | |
| <>Тритон | <> Серва | <>37240 | |
| Unimax 1010 шейкер | <>Хейдольф | ||
| Vacuum | Dinko | ||
| x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic кислота, безводная натриевая соль<> | Biosynth < | p>B-7398 | |
| /p> | Lab Conda | 1702.00 | |
| <>Зеатин рибозид | <>Сигма | <>1001042850 |
Ссылки
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant facto....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
